ARTICLE
Introduction
Les surfaces cultivées en espèces génétiquement
modifiées ont été multipliées par 30 (1,7
à 52,6 millions ha) entre 1996 et 2001 et ont augmenté de
19 % entre 2000 et 2001. La quasi-totalité (99 %) est cultivée
dans 4 pays (USA, Argentine, Canada et Chine), dont 68 % aux USA, et concerne
essentiellement 4 espèces : le soja (33,3 millions ha), le maïs
(9,8 millions ha), le coton (6,8 millions ha) et le colza (2,7 millions
ha) [1]. En Europe, la culture des plantes transgéniques est soumise
à la directive CE 220/90 [2] et, depuis le 17 octobre 2002, à
la directive CE 18/2001 [3]. Moins de 25 000 ha de plantes transgéniques
(maïs Bt) y ont été cultivés en 2001.
Suite au règlement relatif aux nouveaux aliments (CE 258/97)
[4], les denrées alimentaires contenant des organismes génétiquement
modifiés (OGM) ou constituées d'OGM autorisés doivent
être étiquetées comme telles. Le règlement
CE 1139/98 [5], qui sert actuellement de guide en matière d'étiquetage
dans l'Union européenne, repose sur la présence d'ADN ou
de protéines résultant d'une modification génétique.
Ces règles d'étiquetage ont été modifiées
au début de l'année 2000 par le règlement CE 49/2000
[6] qui fixe un seuil de tolérance de 1 % en cas de présence
« fortuite » de matériel issu d'OGM. Les aliments et
les ingrédients alimentaires, issus de maïs ou de soja, contenant
moins de 1 % de matériel génétiquement modifié
(ADN ou protéine) ne sont pas soumis à cet étiquetage.
Le règlement CE 50/2000 [7] prévoit en outre des exigences
d'étiquetage pour les denrées et ingrédients alimentaires
contenant des additifs et des arômes issus d'OGM. Ces deux règlements
étaient applicables à partir du 10 avril 2000.
La plupart des méthodes de détection des OGM sont basées
sur l'amplification d'une partie spécifique de la construction
génique par une réaction de polymérisation en chaîne
(PCR). Les méthodes basées uniquement sur la détection
ou l'identification des OGM par PCR ne permettent pas de déterminer
le pourcentage de matériel génétiquement modifié
dans le produit. Elles ne peuvent donc pas être utilisées
pour répondre aux exigences d'étiquetage fixées par
les deux règlements précédemment cités. Différentes
méthodes ont été développées pour quantifier
le pourcentage d'OGM dans les grains, graines et produits dérivés.
Certaines sont basées sur l'analyse immunochimique (ELISA) et nécessitent
l'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine
codée par le transgène [8, 9]. D'autres reposent sur la
PCR quantitative compétitive [10] ou la PCR quantitative en temps
réel [11-13].
Principe et avantages de la PCR quantitative
en temps réel
La technique PCR consiste en une succession de cycles comprenant chacun
une étape de dénaturation de l'ADN, une étape d'hybridation
de deux amorces spécifiques de la séquence à amplifier,
et une étape d'élongation de l'ADN par une ADN polymérase
(figure 1). En théorie,
la production des produits d'amplification (amplicons) est exponentielle
(production de 2n molécules d'ADN après n cycles
de PCR). En pratique, on atteint un plateau entre 30 et 40 cycles de PCR
parce que certains éléments de la réaction deviennent
limitants ou inhibiteurs [14]. Il n'y a donc pas nécessairement
proportionnalité entre la quantité d'amplicons produits
à l'issue de la PCR et la quantité d'ADN cible de départ,
ce qui rend la quantification peu fiable par PCR dite « en point
final ».
Principe de la PCR quantitative en temps réel
La PCR quantitative en temps réel repose sur le même principe
que la PCR classique, excepté qu'elle nécessite l'utilisation
d'une sonde en plus des deux amorces. La figure
2 présente le principe de la PCR quantitative en temps réel
avec utilisation d'une sonde TaqMan. Une sonde TaqMan est un oligonucléotide
complémentaire de l'un des brins de la séquence cible, à
laquelle elle s'hybride pendant la phase d'hybridation, de même
que les amorces (figure 2).
Elle porte à son extrémité 5' une molécule
fluorescente (fluorochrome) dite « reporter », et à son
extrémité 3' un deuxième fluorochrome dit «
quencher ». Le « reporter » est une molécule qui,
après excitation par un faisceau laser, émet un signal de
fluorescence à une longueur d'onde spécifique qui est mesuré
à la fin de chaque cycle de PCR. En absence d'amplification, la
sonde reste intacte, le fluorochrome « quencher » inhibe en
grande partie la fluorescence du « reporter », et seule une
fluorescence résiduelle est émise [15]. En revanche, s'il
y a amplification, la sonde TaqMan est hydrolysée lors de l'étape
d'élongation de l'ADN (activité 5'-3' exonucléase
de l'ADN polymérase, figure
2) [16, 17]. Le « reporter » est alors libéré
et sa fluorescence n'est plus inhibée par celle du « quencher
». Pour chaque échantillon, l'émission de fluorescence
enregistrée à la fin de chaque cycle de PCR permet de définir
une valeur de Ct (cycle threshold ou cycle seuil) correspondant au nombre
de cycles de PCR à partir duquel la valeur de l'intensité
de fluorescence est significativement différente du bruit de fond.
La valeur du Ct est d'autant plus faible que le nombre initial de copies
de la séquence cible est grand : elle est inversement proportionnelle
au logarithme du nombre initial de copies de la séquence cible
dans l'échantillon d'ADN [18].
Avantages de la PCR quantitative en temps réel
Par rapport à la PCR en point final, la PCR quantitative en temps
réel présente plusieurs avantages. Le principal est que
la détermination des Ct est effectuée à la même
intensité de fluorescence, pendant la phase exponentielle, ce qui
permet une précision identique pour une gamme dynamique de mesure
qui s'étend jusqu'à six ordres de magnitude. Par ailleurs,
l'efficacité de la PCR quantitative en temps réel est d'autant
meilleure que la taille des amplicons est petite (50-150 pb). Cela permet
d'amplifier l'ADN extrait de produits transformés, qui est souvent
dégradé (c'est-à-dire composé de fragments
de petite taille). Enfin, l'utilisation d'une sonde TaqMan en plus des
deux amorces augmente fortement la spécificité des amplicons
générés. Les autres avantages de la PCR quantitative
en temps réel sont sa rapidité de mise en œuvre (elle
ne nécessite pas l'utilisation de standards internes clonés
comme la PCR quantitative compétitive) et un risque nul de contaminations
post-PCR du fait que les tubes ne sont pas ouverts après amplification.
Les risques de contamination pré-PCR par de l'ADN étranger
lors des étapes d'extraction et de purification de l'ADN et/ou
de préparation des réactions de PCR sont cependant les mêmes
que pour la PCR en point final. En revanche, la PCR quantitative en temps
réel est très sensible à la présence d'inhibiteurs
(polysaccharides, protéines, solvants organiques... co-extraits
avec l'ADN) de l'ADN polymérase, ce qui nécessite de veiller
à la pureté des ADN extraits.
Application de la PCR quantitative en temps réel
à la quantification du soja Roundup-Ready®
dans des farines de soja
Cette étude a été réalisée sur deux
séries d'échantillons, contenant de 0 à 5 % (p/p
farine) de soja transgénique Roundup-Ready® (RR).
D'une part, des échantillons, préparés par l'Institute
of Reference Materials and Measurements (IRMM) du Joint Research Center
à Geel (Belgique), provenaient d'un ring-test (essais inter-laboratoires
organisé par le Joint Research Center d'Ispra (Italie) [19, 20].
D'autre part, des échantillons préparés dans notre
laboratoire par mélange de farines de soja transgénique
et non transgénique directement dans le tube d'extraction de l'ADN.
Les PCR ont été réalisées avec un appareil
de PCR quantitative ABI Prism® 7700 (Applied Biosystems).
Pour le détail des conditions de PCR et l'ensemble des résultats
voir Alary et al. [13].
Choix des gènes cibles
Pour quantifier l'ADN total de soja, il est nécessaire d'amplifier
un gène de référence caractéristique de l'espèce
: nous avons choisi d'amplifier un fragment (80 pb) d'un gène codant
une lectine [21]. Pour quantifier l'ADN provenant uniquement du soja RR,
nous avons utilisé un fragment (79 pb) du promoteur 35S du virus
de la mosaïque du chou-fleur [22] (promoteur utilisé dans
la construction génique du soja RR et présent dans la plupart
des OGM autorisés).
PCR simplex versus PCR duplex
La PCR quantitative en temps réel peut être réalisée
en simplex (amplification d'une seule cible) ou en duplex (amplification
de 2 cibles différentes en une seule réaction PCR). Cette
dernière élimine les variations dues aux erreurs de pipetage
puisque les 2 PCR ont lieu simultanément dans le même tube.
Elle est également plus économique. Cependant, son optimisation
est plus délicate car il faut vérifier que l'efficacité
des 2 PCR est comparable.
En PCR duplex, les sondes sont marquées avec deux fluorochromes
« reporter » différents pour différencier les
deux profils d'amplification : la sonde TaqMan spécifique de l'espèce
(lectine) est marquée avec le fluorochrome VIC™ (Applied Biosystems),
et la sonde spécifique du transgène (35S) avec le fluorochrome
FAM (6-carboxy-fluorescein), dont le spectre d'émission est différent
de celui de VIC. À leur extrémité 3', les deux sondes
sont marquées avec le fluorochrome « quencher » TAMRA
(6-carboxyl-tetramethyl-rhodamine).
Qualité de l'ADN
L'amplification de l'ADN par PCR est largement conditionnée par
la qualité de ce dernier. La taille moyenne des fragments qui le
compose doit être supérieure à celle des fragments
que l'on souhaite amplifier. L'ADN extrait des échantillons ring-test
est sensiblement plus dégradé que celui extrait à
partir des échantillons préparés dans notre laboratoire
(figure 3). L'ADN des
deux séries d'échantillons a été extrait par
la même technique (colonne échangeuse d'ions). Ces résultats
ont été confirmés en utilisant une autre technique
d'extraction (méthode au cethyl trimethyl ammonium bromide ou CTAB)
pour les échantillons ring-test, ce qui indique que la dégradation
de l'ADN n'est pas due à la technique d'extraction utilisée
mais à la préparation du matériel végétal.
Les échantillons ring-test ont en effet subi des traitements de
congélation/lyophilisation, plusieurs broyages, et ils ont été
conservés plusieurs mois à 4 °C [19, 20], alors que
les échantillons laboratoire provenaient de farines fraîchement
préparées. Cependant, ce critère de taille n'est
pas suffisant pour caractériser complètement la qualité
de l'ADN extrait : il est nécessaire de vérifier qu'il ne
contient pas d'inhibiteurs de l'ADN polymérase. Bien qu'en théorie
l'extraction d'ADN à partir de grains ou de graines ne présente
pas de difficultés majeures, ce dernier peut contenir des polysaccharides,
protéines, polyphénols ou sels qui sont des inhibiteurs
potentiels de la PCR.
Détermination du pourcentage d'OGM
La détermination du pourcentage d'OGM d'un échantillon
inconnu est réalisée en se référant à
une droite d'étalonnage établie à partir de standards
de teneur connue en OGM. Pour la PCR simplex, la gamme étalon a
été obtenue en faisant des dilutions successives de l'ADN
extrait d'un échantillon référence de soja à
2 % d'OGM (IRMM de Geel, Belgique). Pour la PCR duplex, elle a été
obtenue par dilution de l'ADN extrait à partir de farine de soja
contenant 1 % de soja RR. La concentration en ADN des extraits servant
à établir les droites d'étalonnage a été
déterminée par spectrofluorimétrie en présence
de picogreen (Molecular Probes). À partir des droites d'étalonnage
et des valeurs de Ct des échantillons inconnus, le logiciel (S.D.S
1.6.3) détermine le nombre de cibles du gène lectine (fonction
de la quantité totale d'ADN de soja) ou le nombre de cibles du
promoteur 35S (fonction de la quantité d'ADN de soja RR) qui étaient
présentes dans la réaction de PCR. Le pourcentage de soja
RR contenu dans l'échantillon est exprimé par le rapport
: nombre de cibles du promoteur 35S/nombre de cibles du gène de
lectine. Cette correspondance nombre de cibles/quantité d'ADN n'est
vraie que si le nombre de copies du gène de lectine et du promoteur
35S provenant du transgène est identique. Pour cela, nous avons
vérifié, pour une même quantité d'ADN de soja
RR, que les valeurs de Ct des deux PCR (lectine et 35S) étaient
bien identiques et donc le nombre de cibles des deux gènes.
Optimisation de la PCR duplex
Afin d'éviter au maximum une compétition entre l'amplification
du gène de référence (lectine) et celle du transgène
(35S), il est nécessaire d'optimiser la concentration des deux
couples d'amorces utilisés simultanément. L'amplification
du gène de référence nécessite une concentration
plus faible d'amorces que l'amplification du transgène, pour lequel
le nombre de cibles est moindre. La concentration des amorces a été
optimisée en déterminant expérimentalement le couple
de concentrations pour lequel la valeur du DELTACt = Ct (amplification
35S) Ct (amplification lectine) est la plus proche du DELTACt théorique
(figure 4). L'optimisation
a été faite à partir de 100 ng d'ADN extrait de l'échantillon
de soja à 1 % d'OGM préparé au laboratoire : la quantité
d'ADN provenant du soja RR est de 1 ng, et le DELTACt théorique
de 6,64. Le couple de concentrations retenu (200 nM pour les amorces 35S
et 150 nM pour les amorces lectine) a été validé
en déterminant l'efficacité des deux PCR. L'efficacité
calculée selon l'équation : efficacité de
la PCR = [10 1/pente 1] x 100, où le terme
« pente » correspond à la pente des droites de régression
obtenues sur la gamme d'étalonnage (figure
5) est de 95,6 % pour l'amplification du gène de lectine
et de 93,1 % pour celle du 35S. Comme illustré pour les échantillons
de soja à 0,1 % et 1 % d'OGM, préparés au laboratoire,
les profils d'amplification se superposent parfaitement lors de la phase
exponentielle alors que ce n'est plus le cas lors de la phase plateau
(figure 6).
Comparaison de la teneur en soja RR mesurée
par PCR en temps réel simplex ou duplex
Pour les échantillons du ring-test, les résultats obtenus
par PCR simplex sont proches des valeurs théoriques, sauf pour
l'échantillon à 1 % d'OGM (tableau
1). Les valeurs obtenues en PCR duplex sont également proches
des valeurs théoriques, excepté pour les échantillons
à 0,5 et 2 % d'OGM. Pour les échantillons préparés
dans notre laboratoire, le pourcentage d'OGM déterminé par
PCR duplex est conforme à la valeur théorique, dans une
plage de variation de ± 25 %, sauf pour l'échantillon à
0,1 % d'OGM, pour lequel la variation est plus importante.
Les résultats différents obtenus entre les PCR simplex
et duplex pour les échantillons ring-test sont probablement dus
à la qualité de l'ADN extrait. En effet, les PCR simplex
ont été réalisées à partir d'ADN extrait
par une technique utilisant du cethyl trimethyl ammonium bromide (CTAB),
alors que pour les PCR duplex, l'ADN a été purifié
sur colonne échangeuse d'ions. La purification sur colonne échangeuse
d'ions des échantillons de soja semble plus délicate et
moins reproductible que la méthode au CTAB. Contrairement au maïs,
le soja contient beaucoup de polysaccharides chargés positivement,
qui peuvent se fixer sur la résine échangeuse d'anions [23].
Cela perturbe l'écoulement du liquide par gravité et nécessite
l'application d'une pression positive au sommet de la colonne pour faciliter
l'écoulement. Cette étape est difficile à normaliser.
De plus, certains polysaccharides fixés sur la résine sont
probablement élués en même temps que l'ADN. La présence
éventuelle d'inhibiteurs de l'ADN polymérase dans ces échantillons
pourrait affecter préférentiellement l'une ou l'autre des
amplifications (35S ou lectine). Les pourcentages déterminés
expérimentalement étant le plus souvent inférieurs
aux pourcentages théoriques (tableau), il semblerait que
les inhibiteurs affectent davantage l'amplification du transgène,
dont le nombre de cibles est très nettement inférieur à
celui du gène de lectine. L'ADN extrait et purifié par la
même technique (colonne échangeuse d'ions) à partir
des échantillons préparés dans notre laboratoire
ne semble pas contenir d'inhibiteurs de PCR (efficacités proches
de 100 %). La différence de préparation des échantillons
ring-test et laboratoire explique certainement les différences
observées au niveau de la qualité de l'ADN extrait.
Quel que soit le type de PCR (simplex ou duplex) mis en œuvre,
les échantillons ne contenant pas d'OGM sont bien évalués
comme tels, ce qui est important dans le cadre de transactions commerciales.
Pour les échantillons dont la teneur en OGM est de l'ordre de 0,1
%, le faible nombre de cibles provenant du transgène est un paramètre
important à prendre en compte. Pour une détermination précise,
il est recommandé de disposer d'environ 100 copies et au
minimum de 20 copies de la séquence cible dans le milieu
réactionnel. En dessous de ce nombre, la probabilité que
des répétitions contiennent le même nombre de copies
est trop faible, à cause d'un manque de répartition homogène
des séquences cibles dans l'extrait d'ADN [24]. Quel que soit l'échantillon,
nous avons travaillé à volume constant d'ADN, par conséquent
pour les ADN extraits d'échantillons contenant une faible teneur
en OGM (0,1 %), le nombre de cibles 35S était seulement de 50 pour
la PCR duplex (ADN purifié sur colonne échangeuse d'ions)
donc en dessous de la valeur souhaitable de 100 copies alors qu'il était
de 150 pour la PCR simplex (ADN extrait au CTAB).
Reçu le 19/09/02
Accepté le 10/12/02
CONCLUSION
Il ressort de cette étude que la PCR quantitative en temps réel,
simplex ou duplex, permet de déterminer le pourcentage d'OGM d'un
échantillon inconnu. Le protocole d'extraction et de purification
de l'ADN doit être adapté à la nature des échantillons
à analyser. De plus, la préparation et la conservation des
échantillons utilisés comme standards sont également
un point important à prendre en considération.
Malgré ses avantages, la PCR duplex est plus délicate
à optimiser, et elle semble être plus sensible à la
présence d'inhibiteurs. Pour utiliser cette technique, il faut
donc trouver un compromis entre deux paramètres antagonistes :
le volume d'ADN, que l'on souhaite aussi faible que possible pour limiter
la concentration d'inhibiteurs pouvant affecter l'efficacité de
la PCR, et le nombre de cibles du transgène, que l'on souhaite
au moins égal à 20. D'une façon générale,
plus les produits sont transformés, moins la qualité et
la quantité de l'ADN extrait sont bonnes, et plus la présence
d'inhibiteurs risque d'être élevée. Ce point peut
être crucial pour l'analyse de produits ayant subi des procédés
complexes de transformation.
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