ARTICLE
Auteur(s) : Florent
Engelman
IRD 911, avenue agropolis BP 64501 34394 Montpellier France
À l’aube du XXIe siècle, l’agriculture est confrontée
à de nouveaux défis, afin d’assurer une production et une
autosuffisance alimentaire durables, et de contribuer à
l’éradication de la pauvreté et à l’équilibre écologique de la
planète. Les agriculteurs sont en première ligne, en
particulier au travers des variétés de plantes et des semences
qu’ils conservent. Cependant, la communauté scientifique impliquée
dans la conservation de la biodiversité et des ressources
génétiques végétales a également un rôle crucial à jouer.
Ses travaux doivent permettre une adaptation rapide des
espèces végétales cultivées aux changements à venir, qui
comprennent l’érosion de la biodiversité, la dégradation de
l’environnement, les changements climatiques et les risques
associés ainsi que la diversification de l’utilisation des produits
agricoles. Cette adaptation reposera sur l’identification et
l’utilisation de caractères spécifiques qui sont présents dans les
collections de ressources génétiques végétales qui existent dans le
monde entier.
Parmi les plantes alimentaires majeures, de nombreuses espèces
végétales produisent des semences qui présentent une phase de
déshydratation importante en fin de maturation. Elles sont donc
tolérantes à une déshydratation intense et peuvent être conservées
à basse température à l’état déshydraté. Les semences de ces
espèces sont nommées orthodoxes (Roberts, 1973). Le stockage
des semences orthodoxes est la méthode la plus largement utilisée
de conservation ex situ des ressources phytogénétiques, puisque 90
% des 6,1 millions d’accessions stockées dans les banques de
gènes sont conservées sous la forme de semences. Par opposition aux
semences orthodoxes, un nombre considérable d’espèces,
principalement d’origine tropicale ou subtropicale – telles que le
cocotier, le cacaoyer ou de très nombreux arbres fruitiers ou
forestiers – produisent des semences qui ont une phase de
déshydratation très légère en fin de maturation et qui sont donc
disséminées à des teneurs en eau relativement élevées.
De telles semences ne peuvent résister à la déshydratation et
sont souvent sensibles au froid. Elles ne peuvent donc pas être
conservées dans les conditions de stockage traditionnelles des
semences, c’est-à-dire à teneur en eau réduite et à basse
température. Ces semences sont appelées récalcitrantes et doivent
être conservées dans des conditions d’humidité et de température
relativement élevées pour maintenir leur viabilité (Roberts, 1973).
Même lorsqu’elles sont stockées dans des conditions optimales, leur
viabilité est limitée à quelques semaines ou mois. Il existe
d’autres espèces dont la conservation sous forme de semences pose
des problèmes. Tout d’abord, ce sont les espèces qui ne produisent
pas de semences et qui sont par conséquent propagées de manière
végétative, telles que le bananier et le plantain (Musa spp.). Par
ailleurs, des espèces comme la pomme de terre (Solanum tuberosum),
d’autres racines et tubercules comme l’igname (Dioscorea spp.), le
manioc (Manihot esculenta) et la patate douce (Ipomoea batatas),
ainsi que la canne à sucre (Saccharum spp.), ont soit des génotypes
stériles, soit des génotypes qui produisent des semences
orthodoxes. Cependant, ces semences sont hautement hétérozygotes et
elles sont donc d’une utilité limitée pour la conservation de
génotypes particuliers. Ces plantes sont généralement
propagées de manière végétative pour maintenir les génotypes sous
la forme de clones.
La méthode de conservation ex situ traditionnelle de ces espèces
dont la conservation pose des problèmes est la conservation sous
forme de collections en champ. Cependant, cette méthode, si elle
offre des avantages certains, présente des inconvénients qui
limitent son efficacité et menacent sa sécurité (Engelmann, 1997).
Les ressources génétiques de ces espèces sont exposées aux
ravageurs et aux maladies, aux calamités naturelles comme la
sécheresse ou les ouragans, aux erreurs humaines et au vandalisme.
De plus, elles ne sont pas sous une forme qui facilite les
échanges de matériel génétique, à cause des risques élevés de
transfert de maladies lors de l’échange de matériel végétatif.
Les collections en champ sont coûteuses à maintenir et, par
conséquent, elles sont à la merci de décisions économiques qui
peuvent limiter le niveau de réplication des accessions, la qualité
de leur entretien et même leur survie en cas de difficultés
économiques. Même dans les meilleures conditions, les collections
en champ nécessitent des intrants considérables sous forme de
terrain, main-d’œuvre, gestion, et matériel. De plus, leur
capacité à conserver une quantité importante de diversité est
limitée.
Au vu de ces problèmes, il n’est pas surprenant que des efforts
aient été faits pour améliorer la qualité et la sécurité de la
conservation offerte par les collections en champ et pour
comprendre et régler les problèmes causés par la récalcitrance des
semences, afin de rendre le stockage des semences plus largement
disponible. Cependant, il est clair que des approches alternatives
sont nécessaires pour la conservation des ressources génétiques des
matériels qui posent des problèmes : depuis les années 1970,
l’attention s’est tournée vers les possibilités offertes par les
biotechnologies et, de manière plus spécifique, par la culture in
vitro et la cryoconservation.
Techniques biotechnologiques développées
pour la conservation de la biodiversité
végétale
Au cours des 30 dernières années, les techniques de culture in
vitro se sont largement développées et elles ont été appliquées à
plus de 1000 espèces différentes (George 1993a, b).
Les techniques de cultures de tissus sont d’un grand intérêt
pour la collecte, la multiplication et la conservation du matériel
génétique (Engelmann, 1991). Les systèmes de culture de tissus
permettent de propager le matériel végétal avec des taux de
multiplication élevés, dans un environnement aseptique.
Des plantes exemptes de virus peuvent être obtenues par
culture de méristèmes en combinaison avec la thermothérapie, ce qui
permet la production de stocks exempts de virus et simplifie les
procédures de quarantaine pour l’échange international de matériel
génétique. La miniaturisation des explants permet de réduire
l’espace nécessaire pour la conservation, et, par conséquent, de
réduire les coûts de main-d’œuvre pour l’entretien des collections
de matériel génétique. Différentes techniques de conservation in
vitro sont utilisées selon la durée de stockage recherchée
(Engelmann, 1991 ; Krishnapillay et Engelmann, 1996). Pour le
stockage à court et moyen terme, on utilise les techniques de
conservation en croissance ralentie. Pour la conservation à long
terme, la cryoconservation, c’est-à-dire le stockage à température
ultrabasse, généralement celle de l’azote liquide
(-196oC), est la seule méthode utilisable.
Les techniques de collecte in vitro, de conservation en
croissance ralentie et de cryoconservation sont décrites dans les
sections suivantes.
Collecte in vitro
La collecte de matériel génétique d’espèces à semences
récalcitrantes ou à multiplication végétative peut poser différents
problèmes qui peuvent conduire à la perte du matériel collecté à
cause de sa détérioration, de sa contamination ou de sa viabilité
réduite. Ces problèmes peuvent être surmontés si l’on réalise
que la semence n’est pas le seul matériel qui peut être collecté :
les embryons zygotiques ou les tissus végétatifs comme des
fragments de tige, des bourgeons ou des apex peuvent être prélevés,
transportés et cultivés avec succès s’ils sont placés dans les
conditions adéquates. À la suite d’une réunion d’experts organisée
par l’IBPGR1 en 1984 et le financement de divers
programmes de recherche, des techniques de collecte in vitro ont
été développées pour différents matériels tels que les embryons de
cocotier, de cacaoyer, d’avocatier, d’agrumes, des organes
végétatifs de cacaoyer, de Musa spp., de caféier, de Prunus, de
vigne, de cotonnier et de diverses espèces fourragères (Pence
et al., 2002).
Conservation en croissance ralentie
Pour la croissance en vie ralentie, la technique la plus largement
utilisée est la réduction de la température qui peut être combinée
avec une diminution de l’intensité lumineuse ou avec une culture à
l’obscurité. Des températures de l’ordre de 0-5 °C sont
employées pour les espèces tolérantes au froid. Les espèces
tropicales sont souvent sensibles au froid et doivent être
conservées à des températures plus élevées, qui dépendent de leur
sensibilité au froid. Diverses modifications peuvent également être
apportées au milieu de culture afin de ralentir la croissance
(Withers et Engelmann, 1998). Les techniques de stockage in
vitro en croissance ralentie sont utilisées en routine pour la
conservation à moyen terme de nombreuses espèces, à la fois
d’origine tropicale et tempérée, telles que la pomme de terre, les
Musa spp., l’igname et le manioc (Engelmann, 1999). En 1996, la FAO
recensait environ 38 000 accessions conservées in vitro
en vie ralentie (FAO, 1996). Cependant, si la conservation in vitro
semble une option simple et pratique pour la conservation à moyen
terme de nombreuses espèces, son utilisation nécessite une
adaptation à chaque nouveau matériel ainsi que des apports continus
d’intrants, et des questions se posent quant à la stabilité
génétique du matériel stocké pour certaines espèces.
Des directives techniques ont été publiées récemment (Reed
et al., 2004) qui peuvent servir de guide aux chercheurs et
gestionnaires des banques de gènes pour l’établissement et la
gestion des collections in vitro de ressources génétiques.
Cryoconservation
À la température de l’azote liquide, toutes les divisions
cellulaires sont stoppées et le métabolisme arrêté.
Le matériel végétal peut ainsi être conservé sans altération
ni modification pendant des durées théoriquement illimitées.
De plus, les cultures sont stockées dans un volume réduit, à
l’abri des contaminations et avec un entretien limité. Il est
important de réaliser que la cryoconservation est la seule
technique disponible à l’heure actuelle permettant la conservation
économique, en sécurité, des ressources génétiques du matériel
végétal dont la conservation pose des problèmes.
Certains matériels comme les semences orthodoxes ou les
bourgeons dormants présentent des processus naturels de
déshydratation et peuvent être cryoconservés sans aucun
prétraitement. Cependant, la plupart des systèmes expérimentaux
employés en cryoconservation (bourgeons, embryons, suspensions ou
cals) contiennent des quantités d’eau intracellulaire élevées et
sont donc extrêmement sensibles à la congélation. Les cellules
doivent donc être déshydratées artificiellement pour les protéger
des dégâts causés par la cristallisation de l’eau intracellulaire
pour former de la glace. Les techniques employées et les
mécanismes physiques sur lesquels elles reposent sont différents
dans les techniques de cryoconservation classiques et nouvelles
(Withers et Engelmann, 1998). Les techniques classiques sont
fondées sur la déshydratation pendant la congélation, alors que les
nouvelles techniques le sont sur la vitrification.
La vitrification peut être définie comme la transition de
l’eau directement de la phase liquide en une phase amorphe ou
verre, en évitant la formation de glace cristalline dommageable
pour l’intégrité cellulaire. Les techniques de
cryoconservation classiques ont été appliquées avec succès aux
systèmes indifférenciés tels que les suspensions cellulaires et les
cals (Withers et Engelmann, 1998). Dans le cas des cultures
différenciées, ces techniques peuvent être employées seulement pour
la congélation d’apex d’espèces tolérantes au froid. Dans les
procédures fondées sur la vitrification, la déshydratation
cellulaire est réalisée avant la congélation en exposant les
échantillons à des solutions cryoprotectrices extrêmement
concentrées ou à la dessiccation physique. La déshydratation
est suivie par la congélation. Avec ces techniques, tous les
problèmes liés à la formation de glace intracellulaire sont évités.
Les procédures fondées sur la vitrification offrent des
avantages pratiques par rapport aux techniques classiques. Elles
sont plus appropriées aux organes complexes tels que les bourgeons
ou les embryons qui ont une structure histologique hétérogène. En
empêchant la formation de glace dans le système, les protocoles
fondés sur la vitrification sont de mise en œuvre moins complexe
que les protocoles classiques (ils ne nécessitent pas de
congélateurs programmables) et ils ont un potentiel d’applicabilité
beaucoup plus large (Engelmann, 1997). Sept techniques différentes
fondées sur la vitrification ont été mises au point :
encapsulation-déshydratation, vitrification,
encapsulation-vitrification, déshydratation, préculture,
préculture-déshydratation et vitrification en gouttes (Engelmann,
2004 ; Gonzalez-Arnao et Engelmann, 2006 ; Sakai et Engelmann,
2007). Ces nouvelles techniques ont été utilisées pour la
cryoconservation de bourgeons et d’embryons de nombreuses espèces
végétales d’origine tropicale et tempérée (Engelmann et Takagi,
2000 ; Reed, 2008).
Bien que leur utilisation en routine soit encore limitée, il
existe un nombre croissant d’exemples pour lesquels la
cryoconservation est employée à grande échelle avec différents
types de matériels, tolérants ou non à la dessiccation.
Ces matériels comprennent des semences d’espèces orthodoxes ou
récalcitrantes, des bourgeons dormants, du pollen, des produits des
biotechnologies et des bourgeons prélevés sur des vitroplants
(Engelmann, 2008). Ces progrès ont été rendus possibles par le
développement des nouvelles techniques fondées sur la vitrification
qui ont permis son application à une large gamme d’espèces
(Engelmann, 2004). Un avantage important de ces nouvelles
techniques est leur simplicité de mise en œuvre, puisqu’elles sont
destinées à être utilisées dans les pays tropicaux, dans lesquels
la plus grande partie des ressources génétiques des espèces posant
des problèmes de conservation est située. Pour un nombre non
négligeable d’espèces à multiplication végétative, les techniques
de cryoconservation sont suffisamment avancées pour pouvoir
envisager leur utilisation immédiate en routine dans les banques de
gènes. Les recherches sont nettement moins avancées pour les
espèces à semences récalcitrantes. Cela est dû au nombre très
important de ces espèces, qui sont principalement sauvages, et au
nombre limité d’activités de recherche visant à améliorer leur
conservation. Cependant, il existe différentes approches techniques
pour améliorer leur efficacité et augmenter leur applicabilité aux
espèces récalcitrantes. De plus, des recherches sont
activement conduites par différents groupes dans le monde pour
augmenter les connaissances sur les mécanismes biologiques et
physiques sur lesquels est fondée la récalcitrance.
Des résultats nouveaux sur des points clés comme la
compréhension et le contrôle de la sensibilité à la dessiccation
contribueront de manière significative au développement de
techniques de cryoconservation améliorées pour les espèces à
semences récalcitrantes. À ce sujet, il est intéressant de
mentionner qu’un projet COST (European Cooperation in the field of
Scientific and Technical Research), financé par l’Union européenne
– action COST 871 : « Cryopreservation of crop species in Europe »
–, a été initié récemment. Cette action vise notamment à accroître
les connaissances fondamentales sur la cryoprotection par la
détermination des changements physico-biochimiques associés avec la
tolérance à la cryoconservation et à développer et à appliquer de
nouveaux protocoles de cryoconservation2. On peut donc
s’attendre à ce que, dans les années qui viennent, notre
compréhension des mécanismes impliqués dans la cryoconservation
augmente et que la cryoconservation devienne plus fréquemment
employée pour la conservation à long terme des ressources
phytogénétiques.
Conclusion
Dans cet article, nous avons présenté les nouvelles possibilités
offertes par les biotechnologies pour améliorer la conservation ex
situ de la diversité végétale. Des progrès très importants ont
été faits au cours des dernières années, avec le développement de
nouvelles techniques de conservation pour les espèces à semences
non orthodoxes et à multiplication végétative, particulièrement
dans le domaine de la cryoconservation. Les concepts actuels
de la conservation ex situ devront être modifiés en conséquence
pour intégrer ces avancées technologiques.
Il est maintenu reconnu qu’une stratégie de conservation
appropriée à un pool génétique particulier nécessite une approche
holistique, qui combine de manière complémentaire les différentes
techniques de conservation in situ et ex situ disponibles.
Les méthodes in situ et ex situ, qui incluent une gamme de
techniques pour cette dernière, sont des options disponibles pour
les différents composants de ce pool génétique. La sélection
des méthodes appropriées doit être fondée sur un ensemble de
critères, incluant la nature biologique de l’espèce considérée, la
faisabilité des méthodes particulières choisies (qui dépendent de
la disponibilité des infrastructures adéquates), de même que la
sécurité et la rentabilité économique apportées par leur
application. Les aspects de complémentarité en ce qui concerne
l’efficacité et le coût des différentes méthodes de conservation
choisies sont aussi importants. Dans de nombreux cas, le
développement des stratégies complémentaires de conservation
appropriées nécessitera encore des recherches supplémentaires pour
définir les critères, optimiser les méthodes et tester leur
application pour une gamme de pools génétiques et situations. Dans
ce contexte, il est important de souligner que ces nouvelles
techniques de conservation in vitro très efficaces ne sont pas
perçues comme destinées à remplacer les approches conventionnelles
de conservation ex situ. Elles offrent aux gestionnaires des
banques de gènes et aux curateurs de jardins botaniques des outils
supplémentaires pour leur permettre d’améliorer la conservation du
matériel génétique placé sous leur responsabilité.
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2 Pour plus d’informations, le site web
http://www.biw.kuleuven.be/dtp/tro/cost871/Home.html peut être
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