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Diagnostic biochimique et moléculaire de la maladie de Gaucher en Tunisie

Annales de Biologie Clinique. Volume 65, Numéro 6, 647-52, Novembre-Décembre 2007, pratique quotidienne

DOI : 10.1684/abc.2007.0171

Résumé

Summary

Auteur(s) : A Dandana, S Ferchichi, S Khedhiri, L Chkioua, Z Jaidane, K Monastiri, S Ben Khelifa, R Ben Mansour, I Maire, R Froissart, V Bonnet, S Laradi, A Miled , Laboratoire de biochimie, CHU Farhat Hached, Sousse, Tunisie, Centre de référence des maladies héréditaires du métabolisme de Lyon, Hospices civils, Hôpital Debrousse, Lyon, France.

Résumé : Nous rapportons dans notre étude une stratégie diagnostique de la maladie de Gaucher au Sahel (Tunisie). Elle comprend une étude biochimique suivie par une étude moléculaire chez un patient âgé de 50 ans (le cas index) et ses deux enfants. Les résultats de diagnostic biochimique ont montré que le cas index est déficitaire. L’analyse moléculaire a porté sur la recherche de deux mutations, la p.Asn 370 Ser et la p.Leu 444 Pro. Le cas index était homozygote pour la mutation p.Asn 370 Ser. Ses enfants étaient hétérozygotes pour cette mutation. On a signalé également l’absence de la délétion de 55 pb au niveau du nucléotide 1263. Ces résultats ont été confirmés par le séquençage. L’homozygotie pour p.Asn 370 Ser est associée en général au phénotype peu sévère et à l’absence totale de manifestations neurologiques, ce qui est en accord avec le diagnostic clinique de notre patient.

Mots-clés : maladie de Gaucher, β-glucocérébrosidase, mutation, p.Asn 370 Ser, diagnostic

Illustrations

ARTICLE

Auteur(s) : A Dandana¹, S Ferchichi¹, S Khedhiri¹, L Chkioua¹, Z Jaidane¹, K Monastiri¹, S Ben Khelifa¹, R Ben Mansour¹, I Maire², R Froissart², V Bonnet², S Laradi¹, A Miled¹

¹Laboratoire de biochimie, CHU Farhat Hached, Sousse, Tunisie
²Centre de référence des maladies héréditaires du métabolisme de Lyon, Hospices civils, Hôpital Debrousse, Lyon, France

Article reçu le 26 Juin 2007, accepté le 27 Août 2007

La maladie de Gaucher est une sphingolipidose de surcharge lysosomale. C’est une maladie génétique à transmission autosomique récessive. Elle présente une très grande hétérogénéité phénotypique. Elle est subdivisée en trois types (Type 1 : MIM 230800 ; Type 2 : MIM 230900 ; Type 3 : MIM 231000) selon l’absence ou la présence de manifestations neurologiques [1]. Le type 1 est la forme non neurologique. Il est le plus fréquent avec une incidence de 1/40 000 dans la population générale et 1/500 chez les juifs ashkénazes [2]. Le type 2 est la forme neurologique aiguë. Il est le plus sévère et le plus rare avec une fréquence de 1/100 000 dans la population générale. Il est caractérisé par une détérioration neurologique progressive. Le type 3 est la forme neurologique subaiguë et chronique. Il est subdivisé en trois sous-types (3-a, 3-b et 3-c) [1].À cette variabilité phénotypique de la maladie de Gaucher, s’ajoute une très grande hétérogénéité génétique. En effet, la maladie de Gaucher est due à un déficit en une enzyme lysosomale, la β-glucocérébrosidase (GCB) (E.C 3.2.1.45) [3] ou plus rarement son cofacteur la saposine C [4]. La GCB est codée par un gène localisé à la position 1q21. Il compte 11 exons et 10 introns répartis sur 7,6 kb. Un pseudogène de 5,7 kb est situé à 16 kb en aval du gène de la GCB et présente 97 % d’homologies avec ce gène [1]. Avant la découverte de l’enzymothérapie substitutive, certaines mesures thérapeutiques d’ordre médical ou chirurgical sont proposées pour atténuer la sévérité de la maladie de Gaucher. Le traitement enzymatique substitutif est désormais au centre de la prise en charge thérapeutique de la maladie de Gaucher.D’autres études sont menées pour la recherche d’une thérapie génique de cette maladie. Elle demeure l’un des modèles les plus intéressants de transfert de gènes dans les cellules hématopoïétiques, mais les formes neurologiques restent inaccessibles à l’enzymothérapie. D’où la poursuite des travaux de la thérapie génique qui est en cours de recherche [5].Actuellement, plus de 200 mutations sont décrites [6]. On trouve des mutations ponctuelles, des délétions, des insertions, des mutations d’épissage et de nombreux réarrangements [7]. Chez les Juifs ashkénazes, 4 mutations sont responsables de 90 % des cas identifiés : p.Asn 370 Ser (AAC→AGC), p.Leu 444 Pro (CTG→CCG), c.84insG, et la IVS2+1 G→A. Dans la population non juive, cette maladie a une faible prévalence et les mutations communément identifiées sont p.Asn 370 Ser, p.Asp 409 His (GAC→CAC), p.Arg 463 Cys (CGC→TGC), p.Leu 444 Pro et la IVS2+1 [1].L’objectif de ce travail est de mettre en œuvre une stratégie diagnostique de la maladie de Gaucher en Tunisie. Elle comprend une étude biochimique suivie par une étude moléculaire de la maladie de Gaucher chez 3 individus apparentés (père et ses deux enfants).

Patients

Dans cette étude, nous avons recruté trois individus apparentés : le père (P₁) qui représente le cas index et est âgé de 50 ans, son fils (P₂) et sa fille (P₃) d’âge respectivement 18 et 26 ans. La mère a refusé d’adhérer à notre étude. Ces deux enfants étaient cliniquement sains. Le père a présenté une hépatosplénomégalie associée à une anémie (hémoglobine 90 g/L) et une thrombopénie (80 G/L).

Méthodes

Diagnostic biochimique

L’activité enzymatique de la GCB a été déterminée dans les lymphocytes par la méthode fluorimétrique en utilisant un substrat synthétique, le 4-méthylumbelliféryl-ß-glucoside (Sigma Aldrich). L’acide taurocholique a été utilisé comme activateur et à pH 5,5 pour optimiser les conditions expérimentales. Parallèlement, une activité témoin, la N-acétyl-β-D-glucosaminidase, a été pratiquée en utilisant un substrat fluorogénique, le 4-méthyl umbelliféryl-N-acétyl-β-D-glucopyranoside (Sigma Aldrich) pour valider la qualité du prélèvement [8]. Le dosage des protéines est réalisé par la méthode de Lowry modifiée par Hartree [9].

Diagnostic moléculaire

L’analyse moléculaire a porté sur la recherche des deux mutations les plus fréquentes qui sont la p.Asn 370 Ser et la p.Leu 444 Pro. Les ADN ont été extraits au phénol chloroforme à partir des cellules sanguines du père (cas index) et de ses deux enfants, puis précipités par l’alcool saturé et solubilisés dans de l’eau bidistillée stérile.

Amplification

La réaction d’amplification par PCR (polymerase chain reaction) des exons 9 [10] et 10 [11] a été réalisée en utilisant la Go Taq polymérase [Promega, Madison, WI]. Le tableau 1 regroupe les amorces et les conditions de PCR qui ont été appliquées. L’amplification de l’exon 9 a été faite par PCR mismatchée [10]. Le mismatch ou mésappariement est le non appariement entre un ou plusieurs couples de bases non complémentaires au sein d’une double hélice. Il a été introduit dans l’amorce sens (p.Asn 370 Ser) afin de créer un site de restriction pour l’enzyme de restriction correspondante. L’amplification de la p.Leu 444 Pro a été réalisée par une PCR. Les réactions de PCR commencent par une dénaturation de 10 minutes à 94 °C (1 cycle) suivie de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation pendant 30 secondes à 94 °C, une étape d’hybridation dont les températures correspondantes ont varié selon le couple d’amorces choisi (tableau 1), puis une étape d’extension pendant 45 secondes à 72 °C. Enfin, l’élongation finale de 2 minutes à 72 °C est réalisée en un cycle.

Tableau 1 Couples d’amorces et enzymes de restriction utilisés.

Exon	Mutation	Amorces	Séquences	Position des nucléotides	Taille en pb	Tm en °C	Enzymes de restriction	Taille des fragments en pb
N	M
9	p.Asn 370 Ser	GCB 9 (+)^• GCB 9 (-)^•	⁵’GCCTTTGTCCTTACCCTC*GA^3’ ^5’GACAAAGTTACGCACCCA³	6708-6727 6813-6796	105	57 °C	XhoI (+)	105	89 + 16
10	p.Leu 444 Pro	GCB 10 (+)° GCB 10 (-)°	^5’GGAGGACCCAATTGGGTGCGT^3’ ^5’GCTGTCTTCAGCCCACTTC^3’	6784-6804 7418-7400	638	60 °C	MspI (+)	638	536 + 102

Digestion enzymatique

Les produits PCR ont été digérés par les enzymes de restriction suivantes : XhoI (p.Asn 370 Ser) et MspI (p.Leu 444 Pro) (Promega, Madison, WI). Les fragments d’ADN obtenus après digestion ont été analysés par électrophorèse sur gel d’acrylamide, puis visualisés sous UV après addition du bromure d’éthidium. Les enzymes de restriction et les fragments de PCR obtenus avant et après digestion figurent dans le tableau 1.

Amplification de la mutation c.1263 del 55

Dans la littérature, il a été suggéré qu’une délétion de 55 pb au niveau du nucléotide 1263 (exon 9) peut accompagner les deux mutations p.Asn 370 Ser et p.Leu 444 Pro [11]. Cette délétion est présente dans le gène et le pseudogène. De ce fait, nous avons utilisé deux amorces : une amorce sens, spécifique du gène et une amorce antisens qui est commune au gène et au pseudogène [11](tableau 2). En absence de la délétion, la taille du fragment amplifié est de 504 pb. Si la délétion était présente, la taille est égale à 449 pb. La réaction de PCR commence par une dénaturation de 10 minutes à 94 °C (1 cycle) suivie de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation pendant 30 secondes à 94 °C, une étape d’hybridation pendant 30 secondes à 56 °C et une étape d’extension pendant 45 secondes à 72 °C. L’étape d’élongation finale a été réalisée en un seul cycle de 2 minutes à 72 °C. La PCR a été contrôlée sur gel d’agarose 2 % en présence du bleu de bromophénol après addition de bromure d’éthidium.

Tableau 2 Séquences des amorces de la mutation c.1263 del 55 et du séquençage.

	Exon	Amorces	Séquences	Position des nucléotides	Tm	Taille en pb
La mutation 1263 del 55	9	GCB 9 Ia (+)^• GCB 9 Ia (-)^•	^5’AACCATGAT TCCCTATCTTC^3’ ^5’GCTCCCTCGTGGTGTAGAGT^3’	6454-6474 6978-6959	56 °C	N	M
504	449
Le séquençage	9-10	GCB 9-10 (+) GCB 9-10 (-)	^5’CAGCTTTCCCCAGCTAG^3‘ ^5’CTGAGAGTGTGATCCTGCCAA³	6413-6429 7449-7429	55 °C	1 036

Séquençage

Le produit de PCR obtenu en présence du couple d’amorces GCB 9-10 (+) et GCB 9-10 (-) (tableau 2) est purifié par un Kit Quiaquik gel-extraction (Qiagen Inc, Valencia, CA, États-Unis). Le séquençage a été assuré grâce à un séquenceur automatique (ABI Prism 3700 Capillary Array Sequencer, PE Biosystems) en utilisant un kit de séquençage (Perkin-Elmer-Cetus Norwalk, CT, États-Unis).

Résultats

Diagnostic biochimique

Le tableau 3 regroupe les résultats des activités enzymatiques : le père P₁ était déficitaire, les deux enfants (P₂ et P₃) ont présenté des activités légèrement diminuées. Ce diagnostic biochimique est complété par le diagnostic moléculaire afin de définir la mutation responsable de ce déficit enzymatique.

Tableau 3 Résultats de l’activité enzymatique.

	Protéines (g/L)	β-glucocérébrosidase-H₂O (µkat/kg)	β-glucocérésidase-acide taurocholique (µkat/kg)	Hexosaminidases totales (µkat/kg)
P₁	3	1,05	0,1	349
P₂	3,2	2,10	3,3	355
P₃	3,5	2,48	4,1	286
T	4	3,10	5,2	296

Diagnostic moléculaire

Digestion enzymatique

Aucun allèle muté p.Leu 444 Pro n’a été détecté dans les fragments d’ADN amplifiés traités. Ce résultat est objectivé par la présence d’un seul fragment de 638 pb (figure 1). Concernant la mutation p.Asn 370 Ser, les résultats obtenus par PCR mismatchée associée à la digestion enzymatique en utilisant l’enzyme XhoI ont montré la présence de l’allèle muté p.Asn 370 Ser. En effet, le cas index (P₁) était homozygote pour cette mutation (deux fragments de 89 et de 16 pb) ; P₂ et P₃ étaient hétérozygotes (trois fragments de 105, 89 et 16 pb) (figure 2).

Amplification de la mutation c.1263 del 55

La mutation c.1263 del 55 était absente chez les trois individus. Ceci est objectivé par la présence d’un fragment de 504 pb (figure 3).

Le séquençage

Le séquençage confirme le résultat obtenu par la digestion enzymatique. Le profil de séquençage (figure 4A) a confirmé l’état d’homozygotie chez le père (p.Asn 370 Ser/p.Asn 370 Ser), ce qui se traduit par la présence d’un seul pic. Par contre, l’état d’hétérozygotie chez les deux enfants (P₂ et P₃) (figure 4B) s’est traduit sur le profil de séquençage par la superposition de deux pics qui correspondent à un allèle normal et un allèle muté (p.Asn 370 Ser/normal).

Discussion

La maladie de Gaucher est une sphingolipidose décrite par Philippe Gaucher en 1882. Elle est héréditaire, à transmission autosomique récessive. Elle résulte d’un déficit en β-glucocérébrosidase ou plus rarement de son cofacteur la saposine C (SAP-C pour sphingolipid activator protein-C) [4]. Le déficit ou l’inactivation du gène de la saposine C engendre l’apparition d’une forme clinique qui ressemble au type 3 de la maladie de Gaucher et qui est caractérisée par des atteintes viscérales et des manifestations neurologiques bien que l’enzyme soit normalement synthétisée [4].

Devant l’hétérogénéité symptomatique de la maladie de Gaucher et les difficultés pronostiques, le diagnostic associe l’étude clinique à des moyens analytiques qui permettent un diagnostic de certitude [5].

Le diagnostic biologique comprend un diagnostic d’orientation qui repose sur la réalisation d’une ponction médullaire qui permet la détection des cellules de Gaucher. Mais des pseudocellules de Gaucher ont été rencontrées dans d’autres affections génétiques (la maladie de Niemann-Pick, la leucémie myéloïde chronique, la maladie de Hodgkin et le myélome multiple). Elles ont la même morphologie que la cellule de Gaucher [5] et de plus la ponction médullaire reste un examen invasif. Plusieurs marqueurs sériques (l’enzyme de conversion de l’angiotensine A (ECA), la ferritinémie, la phosphatase acide tartrate résistante (PATR), la chitotriosidase, les chémokines, la LDL (low-density lipoprotein), la HDL (high-density lipoprotein), les transaminases, la 5’-nucléotidase…) peuvent être mesurés afin d’apporter d’autres éléments diagnostiques.

La mesure de l’activité enzymatique est le diagnostic de certitude de la maladie de Gaucher et repose sur la mise en évidence du déficit en GCB. La β-glucocérébrosidase est ubiquitaire et la mesure de l’activité enzymatique est réalisée sur un prélèvement sanguin après isolement des lymphocytes mais également sur des fibroblastes. Plusieurs auteurs utilisent également un substrat radioactif pour déterminer l’activité résiduelle de la GCB. Selon Beutler et Kull [15], l’activité glucosidasique lymphocytaire est maximale à pH 4 et à pH 5,5. En effet, le pH optimal varie en fonction des tampons, des détergents, de la nature du substrat et de la lyse ou non des membranes cellulaires. Peters et al. déterminent l’activité résiduelle de la GCB au niveau des lymphocytes à la seule valeur de pH de 5,5 [16]. Le taurocholate de sodium présente parfois des problèmes de reproductibilité et il est remplacé dans d’autres études par l’acide taurocholique pur [15]. La méthode fluorimétrique reste la technique la plus utilisée en pratique car elle est reproductible, facile à pratiquer et moins coûteuse malgré sa moindre sensibilité et spécificité par rapport à la méthode radioactive. L’étude de l’activité enzymatique ne permet pas de diagnostiquer l’état hétérozygote, ni de distinguer et de différencier les trois phénotypes de la maladie de Gaucher. Par conséquent, il n’existe pas de corrélation entre l’activité résiduelle de la β-glucocérébrosidase et l’ensemble des phénotypes cliniques de la maladie de Gaucher [5]. Chez les patients atteints par la maladie de Gaucher, les valeurs habituelles de l’activité enzymatique varient entre 0 et 30 % de la valeur de référence [2]. L’activité enzymatique peut diminuer de 50 % dans les lymphocytes circulants et les cultures de fibroblastes cutanés des sujets hétérozygotes [17]. Plusieurs laboratoires ont développé des méthodes de biologie moléculaire pour détecter les mutations qui affectent le gène de la β-glucocérébrosidase [7]. Ces mutations résultent de deux mécanismes, soit la présence d’une nouvelle mutation ponctuelle ou de phénomènes de recombinaison (crossing-over) entre le gène et le pseudogène [17]. L’analyse de la structure du pseudogène est importante dans la compréhension de certaines mutations qu’on rencontre aussi bien dans la séquence du gène que du pseudogène [18]. En effet, plusieurs modifications nucléotidiques sont distribuées le long de la séquence du pseudogène et qui ont été identifiées au niveau de l’allèle muté du gène [5] ce qui complique le diagnostic. L’identification des mutations spécifiques du gène dépend alors du choix judicieux des amorces. En conséquence, certaines séquences sont spécifiques du gène uniquement et n’amplifient pas le pseudogène. D’autres stratégies moléculaires sont adoptées pour valider les résultats de la PCR dans notre étude. Le séquençage utilise des amorces spécifiques du gène et permettent la vérification de la mutation.

En Tunisie, on est amené à utiliser les moyens de diagnostic de base (PCR et digestion enzymatique) afin d’assurer l’analyse moléculaire de la maladie de Gaucher. Le séquençage s’avère dans notre laboratoire plus coûteux. Seules trois d’entre elles, la mutation p.Asn 370 Ser, la p.Leu 444 Pro et la c.84insG qui représentent respectivement 55, 20 et 8 % des allèles sont étudiées dans la maladie de Gaucher [1]. Mais la fréquence et la distribution de ces mutations varient selon les populations étudiées. En Tunisie, et selon une étude menée par Châabouni et al. en 2004 [19], la maladie de Gaucher ne paraît pas exceptionnelle. Sur 27 cas étudiés, 20 cas sont de type 1 (74 %) tandis que le type 2 et le type 3 sont présents chacun avec 3 cas (11 %) et un seul cas de type non déterminé.

Dans notre étude, le sujet index P₁ est homozygote pour la p.Asn370 Ser. Ce patient manifeste le type 1 de la maladie de Gaucher avec une hépatosplénomégalie, et aucune atteinte neurologique n’a été signalée. En effet, plusieurs études ont montré que les patients de type 1 de la maladie de Gaucher et ayant au moins un allèle p.Asn 370 Ser ne présentent aucune manifestation neurologique [5].

Certains auteurs confirment qu’il y a une corrélation entre la présence d’au moins un allèle p.Asn 370 Ser et le type 1 de la maladie de Gaucher [5]. L’allèle p.Asn 370 Ser peut atténuer la sévérité de la maladie. Par contre, la mutation p.Leu 444 Pro est généralement associée au type sévère de la maladie [20], avec l’apparition de manifestations neurologiques. Elle est fréquemment trouvée chez des patients qui manifestent le type 2 et 3 de la maladie de Gaucher. Elle est commune au gène et au pseudogène. La présence d’une délétion de 55 pb au niveau de l’exon 9 pourrait induire des erreurs dans l’interprétation des résultats des deux mutations, la p.Asn 370 Ser et la p.Leu 444 Pro, par la formation des mutations faussement homozygotes [11]. La mutation c.1263 del 55 est due soit au phénomène de recombinaison entre le gène de la β-glucocérébrosidase et son pseudogène, soit à une conversion du gène fonctionnel, du fait de la grande homologie entre les deux gènes. Toutefois, cette mutation est fréquente surtout dans la population non juive [11]. En outre, la corrélation phénotype - génotype demeure ainsi imparfaite en raison des variations phénotypiques inter et intrafamiliales [5]. Plusieurs facteurs sont responsables de ces variations tels que les gènes modificateurs et les facteurs environnementaux, ce qui affecterait l’expression phénotypique de la maladie [7].

Conclusion

Du fait de la grande hétérogénéité phénotypique, le diagnostic de la maladie de Gaucher doit faire appel à la clinique, la biologie et l’étude moléculaire. Dans notre laboratoire, la détermination de l’activité enzymatique permet le diagnostic de certitude. Par ailleurs, le diagnostic moléculaire est possible par la recherche des mutations les plus fréquentes. Par contre, le diagnostic antinatal n’est proposé que dans le cas de la maladie de Gaucher de type 2 et 3. Le suivi de l’évolution de la maladie de Gaucher avant et après traitement se fait par la mesure des différents marqueurs biologiques (chitotriosidase, hémoglobines, plaquettes, enzyme de conversion…). Actuellement, la maladie de Gaucher bénéficie de l’enzymothérapie substitutive mais elle reste très coûteuse. Les avancées de la génétique moléculaire ont aussi permis d’explorer d’autres options thérapeutiques potentielles telles que les molécules chaperonnes.

Références

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