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Dissémination des souches de Klebsiella pneumoniae productrices de β-lactamases à spectre étendu dans un centre hospitalo-universitaire tunisien

Annales de Biologie Clinique. Volume 64, Numéro 3, 237-43, Mai-Juin 2006, Article original

Résumé

Summary

Auteur(s) : D Elhani, L Bakir, M Aouni , Laboratoire des maladies transmissibles et substances biologiquement actives, Faculté de pharmacie, Monastir, Tunisie, Laboratoire de biologie clinique du Centre hospitalo-universitaire Mongi Slim de La Marsa, Tunis, Tunisie.

Résumé : Sur une période de quatre ans (janvier 1999-décembre 2002), 49 souches de Klebsiella pneumoniae productrices de β-lactamases à spectre étendu non redondantes isolées de prélèvements divers chez 43 patients, ainsi que trois souches isolées de l’environnement hospitalier ont été collectées au Centre hospitalo-universitaire Mongi Slim de La Marsa. Les objectifs de notre travail étaient d’établir s’il s’agissait d’un même clone bactérien, d’élucider les modes de transmission et les réservoirs de l’infection. Une étude des dossiers cliniques et un typage des souches par antibiotypie, analyse du profil plasmidique et Random amplified polymorphic DNA (RAPD) ont été effectués. Quatre-vingt-quatre pour cent des patients étaient hospitalisés dans les services de réanimation et de pédiatrie. Il s’agissait surtout d’infections urinaires et de septicémies (74,2 %). Les 49 isolats ont été classés en 13 antibiotypes. L’analyse des profils plasmidiques a montré 16 profils. La RAPD a révélé 28 profils et une variation intraprofil dans cinq cas. Les résultats obtenus ont montré une diversité des souches suggérant une endémicité, une transmission possible de plasmides et une persistance de quelques souches clonales qui circulaient entre services. Les marqueurs utilisés ont permis d’évaluer ainsi une stratégie de prévention à long terme nécessitant une observance stricte des règles d’hygiène et une utilisation rationnelle des antibiotiques.

Mots-clés : infection nosocomiale, Klebsiella pneumoniae, β-lactamase à spectre étendu

Illustrations

ARTICLE

Auteur(s) : D Elhani¹, L Bakir², M Aouni¹

¹Laboratoire des maladies transmissibles et substances biologiquement actives, Faculté de pharmacie, Monastir, Tunisie
²Laboratoire de biologie clinique du Centre hospitalo-universitaire Mongi Slim de La Marsa, Tunis, Tunisie

Article reçu le 31 Mai 2005, accepté le 6 Février 2006

Les souches de Klebsiella pneumoniae productrices de β-lactamases à spectre étendu (BLSE) sont décrites dans la littérature comme étant des pathogènes nosocomiaux importants. Plusieurs épidémies ont été rapportées dans divers pays [1-3]. En Tunisie, cette bactérie multirésistante a également posé de véritables problèmes dans de nombreux hôpitaux depuis sa première apparition en 1984 [4-6]. Au Centre hospitalo-universitaire (CHU) Mongi Slim de La Marsa, la première souche de K. pneumoniae BLSE était apparue en 1999. Elle était isolée à partir d’un prélèvement distal protégé chez un patient hospitalisé en réanimation. Depuis, une recrudescence des infections a été notée. Plusieurs autres souches ont été isolées de prélèvements divers de malades hospitalisés dans différents services du CHU. Ces souches étaient toutes responsables d’infections nosocomiales et étaient souvent multirésistantes aux antibiotiques. Elles ont posé de véritables problèmes aux équipes médicales : cliniques, thérapeutiques, maîtrise de l’infection, lutte et éradication. Dans ce cadre, une enquête épidémiologique comprenant une étude des dossiers cliniques et un typage des souches, a été réalisée dans le but d’établir s’il s’agissait d’un même clone bactérien, d’élucider les modes de transmission et les réservoirs de l’infection.

Matériel et méthodes

L’étude entreprise a été réalisée sur le mode rétrospectif sur une période de 4 années, de janvier 1999 à décembre 2002, au CHU Mongi Slim de La Marsa qui est un hôpital général de 220 lits. Celui-ci regroupe différents services d’hospitalisation : pédiatrie (avec une unité de néonatologie), gynécologie-obstétrique, chirurgie générale, anesthésie-réanimation, cardiologie, médecine interne et rhumatologie-acupuncture.

Souches bactériennes et patients

Cinquante-deux souches de K. pneumoniae BLSE dont 49 isolats cliniques (non redondants) et 3 souches isolées de l’environnement hospitalier (E1, E2 et E3) ont été analysées. Les souches cliniques ont été isolées, chez 43 patients, à partir de divers prélèvements pathologiques. Cinq souches additionnelles de K. pneumoniae non productrices de BLSE, qui ont été choisies au hasard durant la période d’étude, ont été utilisées comme souches témoins. Les souches ont été identifiées par galerie API-20E (Biomérieux^®). Parmi les 43 patients présentant une infection à K. pneumoniae BLSE, on a pu avoir accès pour 31 à leur dossier clinique à partir desquels des fiches de renseignements ont été établies comprenant le sexe, l’âge, le service d’hospitalisation et la nature de l’infection.

Antibiotypie

L’antibiogramme a été réalisé par écouvillonnage sur gélose de Mueller Hinton selon la méthode de Kirby-Bauer préconisée par le National committee for clinical laboratory standards (NCCLS) [7]. Un contrôle de qualité a été effectué avec la souche de référence : E. coli ATCC 25922. Les antibiotiques testés étaient (Bio-rad^®) : amoxicilline (AMX), ticarcilline (TIC), amoxicilline-acide clavulanique (AMC), céfalotine (CF), céfoxitine (FOX), céfotaxime (CTX), ceftazidime (CAZ), imipénème (IMP), aztréonam (ATM), streptomycine (S), gentamicine (GM), tobramycine (TM), kanamycine (K), amikacine (AN), ofloxacine (OFX), chloramphénicol (C), tétracycline (Te), colistine (CS), triméthoprime -sulfaméthoxazole (SXT). La recherche d’activité BLSE a été effectuée par le test de double synergie [8].

Analyse du profil plasmidique

L’extraction de l’acide désoxyribonucléique (ADN) plasmidique a été effectuée selon une méthode rapide décrite en 1989 par Sambrook et al. [9]. L’analyse de l’ADN plasmidique obtenu a été réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose (Promega^®) à 1 %. Les bandes d’ADN ont été visualisées sous lumière ultraviolette. Les tailles moléculaires ont été estimées par comparaison avec deux marqueurs de taille : le DNA Ladder (Invitrogen^®) et le Lamda/Hind III Markers (Promega^®). Les souches ont été comparées d’après leur profil de migration : nombre et taille des bandes.

Typage par RAPD

L’extraction à la chaleur de l’ADN génomique a été réalisée selon la méthode décrite par Gori et al. [10] ; 0,8 μL du produit d’extraction a été ajouté à un mélange réactionnel de volume final 20 μL, contenant : Tampon PCR 1X (Biogène^®, M190G13755334 ; 29 avenue de l’indépendance Borj El Bacouch 2080 avana, Tunisie), 2,5 mM de MgCl₂ (USB, 200998), 0,4 mM de dNTPs (Biogène^®), 6 pmol d’amorce AP4 (5’-TCACGATGCA-3’) (Q-BIOgène research service^®, 20517D6G10 ; 29 avenue de l’indépendance Borj El Bacouch 2080 Avana), 2,5 U de Taq DNA polymérase (Biogène^®). La solution finale de PCR a été dénaturée pendant 5 minutes à 94 °C puis amplifiée pendant 40 cycles : dénaturation 94 °C pendant 30 secondes (s), hybridation à 36 °C/30s, élongation à 72 °C/30s. Au dernier cycle, une étape d’extension finale à 72 °C/7 minutes a été effectuée. Les produits PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d’agarose (Promega^®) à 1,4 % [10]. Les bandes obtenues ont été différenciées par leurs tailles moléculaires et leurs intensités. Les isolats montrant des profils qui différent par une seule bande ont été considérés comme des variants mineurs.

Résultats

Investigation épidémiologique

Parmi les patients, 67,7 % étaient de sexe masculin (sex ratio = 2,1). Il s’agissait de 17 adultes (moyenne d’âge : 46,4 ans) et de 14 enfants (moyenne d’âge : 1 an). La majorité, soit 84 % des patients, était hospitalisée dans les services de réanimation (42 %) et de pédiatrie (42 %). Les autres étaient répartis entre les services de cardiologie (6,4 %), médecine interne (3,2 %), chirurgie (3,2 %) et gynécologie (3,2 %). Les infections les plus fréquemment retrouvées étaient des infections urinaires et des septicémies (74,2 %) (tableau 1)( Tableau 1 ). Les moyens de lutte entrepris au CHU Mongi Slim pendant l’année 1999 ont été le nettoyage et la désinfection des services de pédiatrie et de réanimation, la fermeture provisoire des chambres contaminées dans ces services, la mise en place de distributeurs de savon liquide pour le lavage des mains et la sensibilisation du personnel.
Tableau 1 Répartition des différents types d’infections à Klebsiella pneumoniae BLSE par patient (n = 31).

Types d’infections / patient	Pourcentage
Infection urinaire	41,9
Septicémie	32,3
Méningite	12,9
Péritonite post-chirurgicale	6,5
Pneumopathie	3,2
Infection de plaie	3,2

Souches bactériennes

Durant la période d’étude (21 souches en 1999, 3 en 2000, 12 en 2001 et 13 en 2002) 49 souches cliniques de K. pneumoniae BLSE ont été isolées. Elles ont représenté 10 % de l’ensemble des souches de K. pneumoniae isolées dans cette période. La répartition des souches cliniques de K. pneumoniae BLSE par service était : réanimation (47 %), pédiatrie (41 %), cardiologie (4 %), médecine interne (4 %), chirurgie (2 %) et gynécologie (2 %). La répartition des souches cliniques de K. pneumoniae BLSE en fonction des prélèvements était : urines (46,9 %), sang (22,4 %), ponction lombaire (8,2 %), prélèvement distal protégé (8,2 %), pus (6,1 %), cathéter (4,1 %) et liquide péritonéal (4,1 %). Les 3 souches isolées de l’environnement hospitalier ont été recueillies pendant le mois de février de l’année 1999 dans le service de réanimation. Elles ont été isolées de potences (souches E1 et E3) et d’un bocal d’aspiration (souche E2). Toutes les souches étudiées ont répondu aux critères d’identification de l’espèce K. pneumoniae après analyse par la galerie API-20E.

Antibiotypie

Toutes les souches étudiées étaient résistantes à toutes les β-lactamines testées à l’exception de l’IMP et de la FOX. Le test de double synergie était positif pour les 52 souches de K. pneumoniae étudiées. Les cinq souches témoins ont montré un test de double synergie négatif. L’antibiotypie a permis de ressortir au total 13 antibiotypes différents dont 4 prédominaient : A, B, C et D (11, 10, 8 et 7 isolats) (tableau 2)( Tableau 2 ). Les souches E1, E2 et E3 isolées de l’environnement hospitalier avaient montré des antibiotypes retrouvés chez certaines souches cliniques qui étaient respectivement : B, K et I.
Tableau 2 Illustration des 13 antibiotypes caractéristiques des souches de Klebsiella pneumoniae productrices de β-lactamases à spectre étendu étudiées.

Antibiotype	Phénotypes de résistance	Nombre de souches
A	K/ TM / AN / GM / Te / Sxt	11
B	S/ K/ TM / AN / GM/C / Te / Sxt	10
C	K/ TM / AN / GM/C / Te / Sxt / OFX	8
D	K/ TM / AN / GM/C / Te / Sxt	7
E	S/ K/ TM / AN / GM/C / Te / Sxt / OFX	3
F	S/ K/ TM / GM/C / Sxt	2
G	S/C	2
H	Te / Sxt	1
I	S/ K/ TM / GM/C / Te / Sxt	1
J	S/ K/ TM / AN / GM / Te / Sxt	1
K	K/ TM / GM/C / Te / Sxt	1
L	K/ TM / GM / Sxt / OFX	1
M	S	1

Analyse du profil plasmidique

Au moins un plasmide a été trouvé dans toutes les souches étudiées ( (figure 1) ). Les souches cliniques ont montré 16 profils plasmidiques différents dont cinq prédominaient : a, b, c, d et e comprenant respectivement un nombre de souches de 9, 6, 6, 5 et 3. La totalité des bandes retrouvées dans les différents profils était au nombre de 25 avec des tailles allant de 0,45 à 8,2 Kb. Le nombre de bandes par profil variait de 1 à 6. Les bandes les plus fréquentes étaient de taille 5,2, 2, 6,4, 1,1 et 3,5 Kb et dont les fréquences étaient respectivement 42,5 %, 36,2 %, 31,9 %, 31,9 % et 21,3 %. Les souches isolées de l’environnement hospitalier ont montré 3 profils plasmidiques différents : deux profils déjà observés chez les souches cliniques (28, 33 profil i et 13 profil n) pour les isolats E1 et E3, et un nouveau profil (q) pour la souche E2.

Profil RAPD

La méthode RAPD a permis d’observer 28 profils différents. Il est à noter que 8 souches n’ont montré aucune bande (tableau 3( Tableau 3 ) et ( figure 2) ). Les profils obtenus ont présenté au total 36 bandes distinctes par leurs tailles et leurs intensités. Le nombre de bandes par profil variait de 1 à 9. Les isolats E2 et E3 ont montré respectivement les profils RAPD XXc et IXXX, alors que la souche E1 n’a montré aucune bande. Les souches E3 et 13, qui ont montré le même profil plasmidique, sont différentes par RAPD. Les souches E2, 25 et 41 ont montré des profils RAPD variants mineurs et seraient donc issues de la même souche ancestrale.
Tableau 3 Caractéristiques phénotypiques et génotypiques des 49 souches cliniques de Klebsiella pneumoniae productrices de β-lactamases à spectre étendu étudiées.

Souche	Date d’isolement	Service	Type de prélèvement	Antibiotype	Profil plasmidique	Profil RAPD
1	16/01/1999	Réa	PDP	B	f	I
2	01/02/1999	MI	Urine	B	m	II
3	04/02/1999	Ped	Urine	H	c*	IIIa
4	16/02/1999	Réa	Pus	I	b	IV
5	26/03/1999	Réa	Sang	F	b	V
6 ^a	30/03/1999	Réa	Urine	B	b	VIa
7	15/04/1999	Réa	Sang	J	b	VII
8	20/04/1999	Réa	Pus	C	e	VIII
9	22/04/1999	Ped	Cathéter	D	f	IX
10	04/05/1999	Réa	Urine	F	b	Xa
11	14/05/1999	Réa	Urine	C	e	-----------
12 ^a	20/05/1999	Réa	Urine	K	b	XI
13	11/06/1999	Réa	Urine	B	n	Xb
14 ^a	18/06/1999	Réa	Urine	B	c	XII
15	15/07/1999	Chir	Pus	B	c	XIII
16	02/08/1999	Réa	PDP	C	a	XIV
17 ^b	08/08/1999	Ped	Urine	D	a	XV
18 ^b	04/09/1999	Ped	Urine	D	a	XI
19	21/10/1999	Réa	PDP	D	o	XVI
20	08/11/1999	Ped	Urine	A	a	XVII
21	11/11/1999	Ped	Urine	D	c	XVIII
22	24/04/2000	Gyn	Urine	B	----------	-----------
23	09/05/2000	Réa	Sang	A	a	XVII
24	08/11/2000	Réa	Sang	B	c	IXX
25	01/01/2001	Réa	Sang	C	g	XXa
26	09/01/2001	Réa	Sang	C	h	AB
27	07/05/2001	Ped	Urine	A	----------	-----------
28	21/05/2001	Ped	Urine	D	i	VIa
29	25/05/2001	Ped	Urine	A	j	VIb
30	15/06/2001	Ped	PL	D	k	AB
31	28/06/2001	MI	Urine	A	k	AB
32	14/09/2001	Cardio	Sang	G	h	AB
33	21/09/2001	Ped	PL	A	i	XXI
34	03/10/2001	Réa	Sang	C	g	AB*
35	23/10/2001	Ped	PL	A	l	XXIIa
36	06/11/2001	Ped	Urine	B	l	AB
37	16/01/2002	Cardio	Cathéter	C	d	XXIII
38	19/01/2002	Réa	Sang	E	a	XXIV
39	11/02/2002	Réa	Sang	E	j	XXV
40 ^c	09/03/2002	Ped	Urine	B	d	XXVI
41 ^c	24/04/2002	Ped	Urine	C	d	XXb*
42	07/05/2002	Réa	Lp	E	e	IIIb
43	31/05/2002	Ped	Sang	A	a	XVII
44	18/06/2002	Réa	PDP	L	c*	AB*
45	19/06/2002	Ped	PL	A	a	XXIIb
46	26/06/2002	Ped	Urine	A	d	AB*
47	26/06/2002	Ped	Urine	A	d	XXVII
48	26/06/2002	Ped	Urine	G	a	XXVIII
49	11/07/2002	Réa	Lp	M	p	-----------
E1	04 /02/1999	Réa	Potence	B	i	AB
E2	04 /02/1999	Réa	Bocal d’aspiration	K	q	XXc
E3	09/02/1999	Réa	Potence	I	n	IXXX

Aspects épidémiologiques

Le même génotype (antibiotypie, analyse du profil plasmidique et RAPD) a été observé pour trois souches (20, 23 et 43) isolées de trois patients différents (tableau 3, ( figures 1 ) et ( 2) ). Dans trois cas, les souches isolées d’un même patient se sont révélées différentes après analyse par RAPD (tableau 3, ( figure 2) ). Ainsi, le premier cas considère les isolats 6, 12 et 14 isolés d’urines provenant du patient 1 au cours de deux mois et demi. Le deuxième cas représente les souches 17 et 18 isolées d’urines provenant du patient 3 dans un délai de un mois. Enfin, les isolats 40 et 41 qui ont été isolés d’urines provenant du patient 4 pendant une période de un mois et demi. Le patient 1 qui est hospitalisé en réanimation pourrait être considéré comme un réservoir possible de souches de K. pneumoniae BLSE. Les souches 6, 12 et 14 isolées de ce patient avaient une relation avec d’autres souches isolées chez d’autres patients. En effet, d’après la RAPD la souche 6 était identique à la souche 28 isolée du patient 5 et pourrait avoir aussi une relation avec la souche 29 isolée du patient 6. D’autre part, la souche 12 s’est révélée identique à la souche 18 isolée du patient 3. Par ailleurs, la souche 14 avait le même antibiotype ainsi que le même profil plasmidique que les souches 15 et 24 isolées, respectivement, des patients 7 et 8. Les résultats obtenus pour les souches E1, E2 et E3 suggèrent une implication de l’environnement dans la transmission des souches de K. pneumoniae BLSE comme cela a été décrit dans la littérature [2, 23]. En effet, la souche E1 isolée d’une potence dans le service de réanimation a le même profil plasmidique que les souches 28 et 33 isolées de deux enfants différents hospitalisés en pédiatrie. La souche E3 et la souche clinique 13 ont présenté des profils plasmidiques similaires. En outre, la souche E2 ainsi que les souches cliniques 25 et 41 serait issues de la même souche ancestrale.

Discussion

La grande majorité de nos patients (84 %) infectés par cette bactérie multirésistante était hospitalisée dans les services de réanimation et de pédiatrie. D’après la littérature, les patients admis dans ces services sont les plus impliqués dans les épidémies à K. pneumoniae BLSE [3, 11]. Ceci est en rapport avec l’utilisation abusive d’antibiotiques à large spectre (pénicillines, céphlosporines, chloramphénicol, tétracyclines, fluoroquinolones, aminosides), l’hospitalisation au long cours, les manœuvres invasives fréquentes et le statut immunitaire des patients dans ces services [12]. Nos patients présentaient surtout des infections urinaires et des septicémies (74,2 %). Ceci concorde avec les résultats de Rebuck et al. [13]. Dans notre étude, 10 % des souches de K. pneumoniae étaient productrices de BLSE. D’après la littérature, les taux de prévalence des souches de K. pneumoniae BLSE varient beaucoup (de 4 à 60 %) selon les pays, les hôpitaux et les types d’unité [1, 14, 15]. Le typage par antibiotypie, analyse du profil plasmidique et RAPD a suggéré une diversité des souches impliquées dans les infections à K. pneumoniae BLSE survenues dans notre hôpital. Dans trois cas, les souches isolées d’un même patient sur une période de plusieurs mois se sont révélées différentes après analyse par RAPD (tableau 3 et ( figure 2 ). La diversité des souches de K. pneumoniae BLSE responsables d’épidémies hospitalières a été décrite dans plusieurs pays [5, 10, 14]. Ainsi, en 2001, Essack et al., ont décrit la complexité et la diversité des souches de K. pneumoniae BLSE responsables d’épidémie dans un hôpital universitaire en Afrique du Sud [16]. Les souches variaient d’après leurs antibiogrammes, leurs profils plasmidiques et leurs profils d’électrophorèse en champs pulsés. Tous les isolats exprimaient une à cinq β-lactamases chacun. Par contre, d’autres études ont rapporté une dissémination clonale des souches de K. pneumoniae BLSE [2, 17]. Cette grande diversité des profils RAPD des souches de K. pneumoniae BLSE au CHU Mongi Slim, indique vraisemblablement un état d’endémicité et une dissémination de plasmides. En effet, plusieurs isolats ont montré des profils plasmidiques similaires (tableau 3 et ( figure 1) ). Les profils plasmidiques a et d prédominaient dans le service de pédiatrie, alors que les profils b et e étaient retrouvés exclusivement en réanimation (tableau 3). En plus, la présence de bandes plasmidiques communes très fréquentes chez les souches étudiées est en faveur d’une dissémination de plasmides. Notre étude a montré que la RAPD avait un pouvoir de discrimination important ce qui est également décrit dans la littérature [10]. Cependant, certaines souches n’ont montré aucune bande (tableau 3). Cela était probablement en relation avec le fait que ces souches n’avaient pas la séquence de l’amorce AP4 dans leur génome. L’utilisation d’autres amorces pourrait être plus performante comme cela a été décrit dans la littérature [18]. Nos résultats ont montré la présence de la même souche chez trois patients. L’éloignement dans le temps (isolats 20 et 23 : six mois, isolats 23 et 43 : deux ans et vingt deux jours) et dans l’espace (isolats 20 et 43 : service de pédiatrie, isolat 23 : service de réanimation) atteste vraisemblablement d’une contamination récurrente par une souche endémique. Deux autres disséminations clonales ont été détectées par RAPD (souches 12 et 18, souches 6 et 28 ; (tableau 3 et ( figure 2) ). Elles ont montré des antibiotypes et des profils plasmidiques différents. En plus, elles ont été isolées de services différents : réanimation et pédiatrie. L’existence de plasmides différents chez deux isolats correspondant à une même souche clonale suggère l’existence d’une unité plus petite, comme les intégrons et les transposons, ou bien l’existence de plasmides instables qui peuvent changer facilement [19]. Le patient 1 hospitalisé en réanimation pourrait être considéré comme un réservoir possible de souches de K. pneumoniae BLSE. Le rôle du réservoir intestinal comme source endogène d’infections à K. pneumoniae BLSE endémiques ou épidémiques dans les services de réanimation a été documenté dans la littérature [11, 20-22]. Les moyens de lutte entrepris au CHU Mongi Slim pendant l’année 1999 ont permis une diminution importante du nombre de souches de K. pneumoniae BLSE (3 en 2000 contre 21 en 1999). Mais ces mesures d’hygiène n’ont concerné que les services de réanimation et de pédiatrie et n’ont pas été continues au cours du temps. Ceci pourrait expliquer l’augmentation du nombre de souches isolées pendant les années 2001 et 2002 (12 et 13). L’identification d’un état d’endémicité sévissant dans notre hôpital avec à la fois une diversité des souches, une transmission possible de plasmides et une persistance de quelques souches clonales suggèrent une stratégie de prévention à long terme combinant une observance stricte des règles d’hygiène et une utilisation rationnelle des antibiotiques [24].

Références

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