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Micro-ARN et oncogenèse

Bulletin du Cancer. Volume 92, Numéro 9, 757-62, Septembre 2005, point sur...

Résumé

Summary

Auteur(s) : Jean Bénard, Setha Douc-Rasy , Département de biologie et de pathologie médicale & UMR 8126-CNRS, Institut Gustave-Roussy, 94805 Villejuif Cedex.

Résumé : Les micro-ARN endogènes (miARN) régulent négativement l’expression d’une variété de gènes. Ces toutes petites molécules non codantes d’ARN (18 à 25 ribonucléotides) assurent un mécanisme, spécifique et efficace, de répression de l’expression d’ARNm cibles en régulant leur traduction en protéines, généralisant ainsi le phénomène d’ARN interférence. Ils jouent donc un rôle majeur dans le développement tissulaire des règnes végétal et animal en participant au contrôle spatiotemporel strict des niveaux de protéines régulatrices de chacun des tissus. Des travaux parus durant l’été 2005 montrent qu’ils participent aussi à l’oncogenèse. Certains miARN exercent des propriétés oncogéniques dans des modèles de lymphomes, d’autres manifestent des propriétés anti-apoptotiques dans les glioblastomes. Le profil d’expression des miARN humains découverts aujourd’hui (environ 200) signe le lignage d’un tissu tumoral, ce qui peut être utile pour le diagnostic. L’existence de miARN dans les tumeurs solides et les hémopathies ouvre des perspectives inédites pour la compréhension de l’oncogenèse et, peut-être, la prise en charge des maladies cancéreuses.

Mots-clés : micro-ARN, oncogenèse

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ARTICLE

Auteur(s) : Jean Bénard, Setha Douc-Rasy

Département de biologie et de pathologie médicale & UMR 8126-CNRS, Institut Gustave-Roussy, 94805 Villejuif Cedex

L’existence de microARN (miARN) endogènes représente, pour la biologie cellulaire, la découverte majeure de ces toutes dernières années. Régulateurs négatifs puissants de l’expression génique, ces petites molécules d’acide ribonucléique longues de 18 à 25 nucléotides peuvent, en effet, réguler un très grand nombre de fonctions biologiques qui sous-tendent les processus cellulaires fondamentaux [1]. Transcrits à partir de la séquence intronique d’un gène, elles vont entraîner, à l’issue d’un processus multi-étapes de maturation, le silence du gène soit par la destruction de l’ARNm cible, soit par l’inhibition de sa traduction protéique (( figure 1 )). Ce mécanisme de répression de l’expression génique, spécifique et efficace, généralisait en fait celui d’ARN interférence découvert dans les années 1990 chez les plantes. L’introduction ou la formation d’un ARN double brin dans une cellule conduit à la dégradation de l’ARNm endogène homologue [2], une découverte qui a débouché sur l’utilisation des ARN interférents (ARNi) comme outils d’étude de l’expression génique, une technique aujourd’hui incontournable pour démontrer le rôle d’un gène dans une fonction biologique.D’emblée, précisons qu’un miARN est le produit d’un gène situé sur un locus distinct de celui du gène dont il va « éteindre » l’expression. Ce processus endogène « d’hétérosilence », propre aux plantes et aux métazoaires, s’oppose à celui « d’autosilence » d’un siARN consécutif à l’intrusion d’un ARN double brin (transposon, virus) dans la cellule eucaryote.Les premiers miARN identifiés furent les produits des gènes Lin4 et Let7 de Caenorhabditis elegans au rôle capital dans le contrôle de l’horloge du développement de la larve, leur inactivation conduisant à la poursuite des divisions de certaines cellules épithéliales programmées normalement pour se différencier [3].L’existence de ces miARN interférents endogènes et leur spécificité ouvrent des perspectives de régulation qui concerneraient la formation de tout organe. Par exemple, le cœur qui vient de faire l’objet d’un article dans le numéro du 14 juillet de Nature [4]. La formation des tissus, on le sait, est régie par des gradients continus de facteurs de transcription et de signalisation, reflétant la nécessité d’un contrôle spatiotemporel strict des niveaux de protéines régulatrices. Aussi, en régulant la traduction d’ARNm cibles, les miARN offrent-ils un mécanisme inédit de régulation de dosage protéique.L’équipe de Srivastava à Dallas et San Franscisco [4] a caractérisé deux miARN homologues, miR1-1 et miR1-2 (regroupés sous le nom de miR1), spécifiquement exprimés dans les cellules précurseurs du muscle et du cœur, et dont ils ont pu suivre la localisation dans les structures cardiaques lors de leur développement embryonnaire. Zhao et al. [4] montrent que les gènes spécifiant ces deux miARN sont les cibles transcriptionnelles directes des régulateurs de la différenciation musculaire, facteurs de transcription avérés, que sont le facteur de réponse sérique et son co-activateur, la myocardine, ainsi que MyoD et Mef2. Les miARN se comportent donc comme des gènes de développement classiques en ce qu’ils répondent aux signaux de différenciation. En utilisant des souris génétiquement modifiées pour exprimer miR1 dès l’étape la plus précoce du développement cardiaque, ces auteurs montrent qu’un excès de miR1 conduit à une diminution du contingent des cardiomyocytes ventriculaires en prolifération. Ils en concluent que miR1 régule l’équilibre entre la différenciation cardiaque (spécialisation) et la division cellulaire, en ralentissant la prolifération au bon moment. Mais, en agissant sur quel(s) gène(s) cible(s) ?La structure et l’accessibilité de la molécule d’ARN représentent les facteurs primordiaux permettant d’identifier les cibles des miARN. En concevant un algorithme approprié, Zhao et al. ont découvert que le transcrit du facteur de transcription Hand2, capable d’activer l’expansion des cardiomyocytes ventriculaires, est la cible même de miR1 [4]. En résumé, ce travail indique que les gènes miR1 modulent les effets des protéines régulatrices du développement cardiaque, en contrôlant l’équilibre prolifération-différenciation des cardiomyocytes (( figure 2 )).Le concept de miARN ne pouvait se limiter à la compréhension d’un mécanisme de régulation concernant le seul développement. Il appelait à être généralisé aux processus cellulaires fondamentaux endogènes (prolifération, différenciation, apoptose) des cellules somatiques adultes.Pour un miARN, le choix entre la dégradation de l’ARN (processus similaire à l’ARN interférence) et l’inhibition de sa traduction est dicté par l’appariement qu’il réalise avec son ARNm cible : si un bon appariement conduit à sa dégradation, un appariement imparfait (mésappariement de 1 à 2 bases) entraîne une inhibition de sa traduction (( figure 1 )). Aussi peut-on concevoir pour un miARN d’avoir plusieurs gènes cibles et, a contrario, pour plusieurs ARNm d’avoir un même gène pour cible. La dérégulation de l’expression génique étant à l’origine de l’apparition d’un grand nombre de cancers, l’implication des miARN aux processus de l’oncogenèse représentait une hypothèse de travail très solide, rendue plausible déjà par la localisation de nombreux miARN aux sites de translocation et de délétions, deux phénomènes souvent associés aux leucémies humaines [5]. Une « rafale » de trois publications parues dans le numéro du 9 juin de Nature [6-8] vient de briser définitivement le silence assourdissant que la littérature propage chaque jour sur ce thème !

Profil miARN des tumeurs humaines

Des données préliminaires rapportaient déjà une expression anormale – comparée à celle du tissu originel – de miARN spécifiques à certains types tumoraux, des cancers coliques, des leucémies lymphoïdes chroniques et des lymphomes à cellules B [9], en particulier. Mais, à ce jour, aucun travail exhaustif n’avait abordé l’intérêt du profil d’expression de l’ensemble des miARN humains connus appliqué à l’ensemble des types de cancers humains.

L’existence de plus de 200 miARN humains identifiés conduisait à une approche globale utilisant une technologie d’analyse multiparamétrique, celles des microréseaux par exemple. Mais, s’agissant des miARN, compte tenu de la similarité de séquences pouvant exister entre eux, l’établissement de leur profil d’expression constituait un défi technologique inversement proportionnel à leur petite taille ! Les microréseaux sur verre se révélaient en effet peu performants, l’hybridation croisée étant trop importante.

Du réseau aux billes : quand la technologie s’adapte aux miARN

Aussi, l’équipe de Todd Golub du MIT et du Dana Farber à Boston a-t-elle conçu une technologie nouvelle décrivant des profils tumoraux fonctionnant à l’aide de billes permettant à l’hybridation de se faire dans des conditions proches d’une hybridation en solution, c’est-à-dire de manière plus spécifique et efficace [6]. Dans ce but, Lu et al. [6] ont couplé, par une liaison sur un groupement carboxyle, les miARN à des billes de polystyrène de 5 μm, lesquelles sont imprégnées de quantités variables de deux molécules fluorescentes permettant d’obtenir plus de 100 couleurs, chacune spécifique d’un miARN. Après avoir subi une ligation utilisant leurs groupements 5’ phosphate et 3’-OH de miARN, une transcription inverse et une amplification PCR à l’aide d’une amorce biotinylée commune, les miARN ont été hybridés aux billes de capture et colorées par un mélange streptavidine-phycoérythrine. Les billes sont alors prêtes à l’analyse dans un cytofluorimètre mesurant les deux paramètres d’intérêt : la longueur d’onde de l’émission de fluorescence identifiant le miARN et l’intensité de la phycoérythrine quantifiant son expression. Validée par northern-blot, cette technologie capable de s’appliquer à une centaine d’espèces de miARN s’est avérée être plus spécifique et mieux adaptée que celle des microréseaux sur verre.

Profil d’expression des miARN, empreinte du lignage d’un tissu

En analysant le niveau d’expression des miARN des tissus sains de différents lignages, Lu et al. montrent qu’il est facilement détectable d’une part et qu’il est régulé de manière très stricte, d’autre part. Quant au niveau d’expression des miARN (n = 217), obtenu à partir de nombreux échantillons tumoraux (n = 334), il s’est révélé être anormalement et globalement bas. Plus intéressant encore pour le diagnostic, le profil d’expression des gènes transcrivant les miARN varie énormément d’un type tumoral à l’autre, et ce, en accord avec le lignage du tissu originel. La branche du dendrogramme portant les tumeurs épithéliomateuses est très distante de celle portant les hémopathies, et donc parfaitement distincte. Et même pour un lignage donné, la classification hiérarchique permet de répartir les différentes entités nosologiques d’une maladie.

S’agissant, par exemple, des tumeurs épithéliales du tractus gastro-intestinal, les chercheurs observent que les tumeurs coliques, hépatiques, pancréatiques et gastriques se regroupent ensemble, reflétant une origine embryonnaire endodermique commune.

Concernant les hémopathies, les leucémies aiguës lymphoblastiques dessinent au contraire un tronc portant trois branches distinctes : les leucémies t(9;22) BCR/ABL positives et TEL/AML1, les leucémies à cellules T, enfin celles à gène MLL réarrangé. Cette distinction des profils d’expression des miARN pourrait bien refléter les mécanismes de transformation propres à chaque sous-type leucémique. En tout cas, qu’il s’agisse des carcinomes gastro-intestinaux ou des hémopathies, le profil d’expression des miARN récapitule l’histoire embryonnaire des cancers humains.

Alors les chercheurs ont voulu savoir si cette nouvelle classification des tumeurs recouvrait celle obtenue par l’analyse du transcriptome [10, 11]. L’analyse de l’ARN des mêmes 217 échantillons sur des puces à 16 000 gènes et la classification hiérarchique n’aboutissent pas au regroupement des tumeurs gastro-intestinales, indiquant là une précision inférieure à celle du profil d’expression des miARN.

Le niveau d’expression des miARN retrouvé supérieur dans le tissu sain à celui du tissu tumoral a conduit à l’hypothèse que l’expression globale des miARN serait corrélée avec l’état de différenciation. Comme attendu, l’induction de la différenciation de la lignée HL60 par l’acide rétinoïque s’accompagna de l’induction de nombreux miARN, de même lors de la différenciation érythrocytaire in vitro de progéniteurs hématopoïétiques humains. D’où la question : la perte globale d’expression des miARN marque-t-elle la transformation ?

Profil d’expression des miARN, un outil de classification des cancers

En tout cas, la connaissance de la nature tissulaire d’une tumeur et de son lignage a induit tout naturellement les chercheurs à utiliser le profil d’expression des miARN comme un outil de classification, surtout pour les tumeurs d’histologie ambiguë qui posent au pathologiste de gros problèmes de diagnostic. Dix-sept tumeurs peu différenciées, à l’histologie confondante et dont le diagnostic s’appuyait uniquement sur des arguments cliniques et anatomiques directs ou indirects, ont ainsi été soumises à une analyse comparée profil de miARN-transcriptome ; cette analyse s’est appuyée sur un descripteur d’apprentissage obtenu après analyse de 68 tumeurs plus différenciées représentant 11 types tumoraux. Appliqué aux 17 tumeurs peu différenciées, au niveau global d’expression de miARN, qui est beaucoup plus bas que celui du descripteur d’apprentissage des tumeurs plus différenciées, le « classifieur-miARN » conduit à un diagnostic beaucoup plus précis (12/17 à la classification correcte, p < 5 x 10^-11) que le « classifieur ARNm » (1/17, à la classification correcte, p = 0,47). Ces toutes nouvelles données indiquent la puissance du profil d’expression des miARN pour la classification des tumeurs et leur diagnostic. Une application immédiate de cette découverte serait, bien sûr, les cancers à site primitif inconnu (CAPI), offrant alors aux cliniciens une thérapeutique adaptée au type tumoral bien « étiqueté ».

Certes, ces données inédites méritent-elles d’être confirmées et étendues, mais on peut retenir qu’une classification des tumeurs est aujourd’hui possible à partir d’un nombre restreint de miARN (de l’ordre de 200). De plus, contrairement aux ARNm monocaténaires labiles, les miARN, de par leur structure en double brin, s’avèrent stables dans les tissus fixés au formol [12] : les perspectives de routine en clinique sont là, à portée de main !

Beaucoup de questions se posent à partir de cette découverte. La perte d’expression de certains miARN déterminerait-elle l’induction et/ou le maintien des tumeurs ? Contribuerait-elle à la génération ou au maintien des cellules souches cancéreuses ?

Un polycistron de miARN à l’activité oncogénique

Certains lymphomes humains se caractérisent par une amplification de la région 13q31-32 : c’est le cas des lymphomes diffus à grandes cellules B, des lymphomes folliculaires, du lymphome du manteau et des lymphomes cutanés à grandes cellules B. Dans « l’épicentre » de l’amplicon se distinguent deux gènes annotés C13orf25 et GPC5. C’est à cette anomalie récurrente, décrite de longue date mais non encore élucidée au plan moléculaire, que Scott Hammond et son équipe de Chapel Hill (North Carolina) se sont attaqués [7]. Des études antérieures ayant montré que seul C13orf25 était hyperexprimé, ce gène est apparu comme un marqueur candidat de cet amplicon associé à la transformation. Mais le cadre de lecture prédit du gène C13orf25 ne conduit qu’à un tout petit peptide, non conservé d’ailleurs dans des espèces proches l’une de l’autre. En fait, le transcrit C13orf25 apparaît comme étant le précurseur fonctionnel d’une série composée de sept miARN : miR17-5p, miR17-3p, miR18, miR19, miR20, miR19b-1 et miR92-1. Une comparaison du locus humain et de son orthologue murin révéla une conservation de séquence restreinte au polycistron miR17-92 et à ses séquences flanquantes immédiates. La conséquence majeure de l’amplicon 13q31-q32 pourrait donc être l’abondance du miARN mature de ce cluster mi17-92. Effectivement, l’expression de ce gène se révéla être significativement élevée dans des lignées de lymphome à amplicon 13q31-q32.

Le profil d’expression de 191 miARN matures dans les lignées et des lymphomes présentant cet amplicon, comparé à celui des échantillons tumoraux qui en étaient dépourvus et à des lymphocytes B normaux, a permis d’identifier six miARN dont le haut niveau d’expression était corrélé à l’accroissement du dosage génique de C13orf25. L’expression du miARN mature miR17-92 dans 46 lymphomes (13 diffus à grandes cellules et 6 folliculaires) est significativement supérieure (plus de 5 fois) dans 65 % des cas à celle des tissus normaux.

Pour savoir si cet accroissement de miARN contribuait à la lymphogenèse, les chercheurs ont utilisé des souris transgéniques prédisposées au lymphome humain à cellules B car porteuses de l’oncogène c-myc sous le contrôle de l’activateur Eμ d’une chaîne lourde d’immunoglobuline. Les cellules souches hématopoïétiques de ces souris, après avoir été infectées par un rétrovirus porteur d’une portion du cluster mi17-92 polycistronique, ont été injectées aux souris transgéniques qui, généralement, développent un lymphome en 4 à 6 mois. Comparées aux souris témoins ayant reçu un rétrovirus dépourvu de miARN, les souris chez qui le cluster mi17-92 s’exprime développent une hémopathie immature pré-B en 51 jours suivant la transplantation, pour ensuite mourir de lymphome à cellules B en 65 jours. Le mécanisme explicatif reste à éclaircir puisque l’on ignore encore quels sont les éléments du cluster miARN C13orf25 responsable de cette lymphogenèse. Quoi qu’il en soit, cette étude montre que ce cluster de miARN est capable de moduler la tumorogenèse, ce qui le désigne comme le premier micro-oncogène non codant.

Les miARN, des modulateurs du signal prolifératif médié par l’activation réciproque myc-E2F1

En droite ligne du travail précédent, l’équipe de Josuah Mendell du John Hopkins à Baltimore s’est intéressée au rôle des miARN sur l’expression de c-myc et de ses gènes cibles dans le contrôle de la prolifération [8]. Rappelons que c-myc est un facteur transcriptionnel puissant qui induit des effets cellulaires pléïotropes, voire opposés : prolifération, apoptose et différenciation. La dérégulation du taux de cette oncoprotéine accompagne la transformation de nombreux tissus. Et comme on sait que c-myc et les miARN sont impliqués à la fois dans la prolifération et la mort cellulaire lors du développement embryonnaire, O’Donnel et al. [8] ont voulu comprendre si certains miARN interagissaient avec c-myc pour déterminer l’une ou l’autre de ces fonctions cellulaires.

Dans ce but, les auteurs ont utilisé une lignée de lymphome porteuse du gène c-myc s’exprimant de manière conditionnelle. Clairement, l’hyperexpression de l’oncoprotéine induit l’expression de six miARN dont, fait remarquable, deux (miR17-5p et miR20a) sont codés par le cluster C13orf25 déjà décrit [7], les quatre autres étant codés par deux autres clusters localisés sur les chromosomes humains 7 et X. Des expériences d’immunoprécipitation chromatinienne ont indiqué que c-myc se fixait directement sur le cluster C13orf25, suggérant ainsi un site régulateur sur ce locus. Une cible prédite comme régulée par miR17-5 et miR20a est le facteur de transcription E2F1, qui assure la progression G1-S du cycle cellulaire en activant les gènes de réplication et de contrôle des cycles cellulaires. On sait également que l’expression d’E2F1 est induite par c-myc et, a contrario, que c-myc est aussi induit par E2F1, selon une régulation positive en feed-back. Une telle activation réciproque (c’est-à-dire une hyperexpression des deux gènes) entraîne un emballement de la boucle qui, in fine, conduit à une prolifération incontrôlée. Les auteurs ont donc fait l’hypothèse que la régulation négative de la traduction du messager E2F1 par miR17-5 et miR20a serait le mécanisme freinateur de cette activation réciproque c-myc-E2F1, permettant ainsi un contrôle approprié de l’expression de ces deux facteurs de transcription. O’Donnel et al. ont démontré que leur hypothèse était valide et que l’expression d’E2F1 était affectée si, et seulement si, le site d’interaction du miARN existait sur l’ARNm d’E2F1. En régulant négativement E2F1, les deux miARN induits par c-myc « amortissent » l’effet d’emballement, régulant ainsi la dynamique de l’action d’E2F1 sur le cycle cellulaire.

Le miARN21, un facteur anti-apoptotique des glioblastomes

Un travail tout récent paru dans le numéro du 15 juillet de Cancer Research assigne une fonction biologique précise à un miARN hyperexprimé dans un cancer redoutable, le glioglastome de haut grade [13]. En utilisant un microréseau permettant l’analyse de l’expression de 180 miARN de mammifères, l’équipe de Kosik du Dana Farber à Boston montre en effet qu’un miARN, le miR21, présente un taux spécifiquement élevé dans les tumeurs fraîches, les primocultures et les lignées établies de glioblastome, comparé aux taux des tissus sains correspondants fœtaux et adultes. Une approche « perte de fonction » du miARN, utilisant des oligonucléotides antisens chimiquement modifiés (2’-O-méthyl oligoribonucléotides) et conduisant soit à une perte d’appariement des bases, soit à une inhibition de l’activité du RISC (( figure 1 )), induit l’activation des caspases exécutrices (caspases 3 et 7) et donc un accroissement de mort cellulaire par apoptose. Ainsi, l’hyperexpression du miR21 peut contribuer au phénotype malin des glioblastomes en bloquant l’expression de gènes critiques pour l’apoptose.

Questions ouvertes et perspectives

Leur implication dans la détermination du lignage et la perte de prolifération lors du développement, leur localisation aux sites fragiles du génome sujets à remaniements dans les cancers sont autant d’éléments qui induisent à penser que les miARN jouent un rôle important dans la cancérogenèse. Mais on ne sait encore s’ils accompagnent ou déterminent l’oncogenèse et la progression tumorale. Oui, beaucoup reste à faire pour comprendre leur régulation, leur rôle biologique et établir leur champ d’application en clinique.

S’agissant de leur régulation, on ne connaît pas encore les molécules qui les induisent. Leur nombre restreint actuel (un peu plus de 200) peut conduire à spéculer que chaque miARN serait capable de réguler un très grand nombre de gènes composant le génome, mais cela reste à prouver. De même, nous ne savons que peu de chose sur leur mode d’action : pour un gène cible donné, agissent-ils toujours comme interrupteur ou comme rhéostat ?

Quant aux fonctions biologiques qu’ils médient, les travaux originaux présentés [7, 8, 13] ne permettent pas de leur assigner, avec certitude, un rôle d’oncogène plutôt qu’un rôle de gène suppresseur de tumeur.

Enfin, au plan clinique, une fois confirmées, les variations de profils d’expression signant le lignage originel pourront être l’outil incontournable du pathologiste dans les cas de doute sur la nature du tissu tumoral examiné. L’intérêt pronostique des miARN, comparé au profil du transcriptome obtenu par microréseaux, reste aussi à démontrer.

Ces réserves émises, l’avènement des miARN est enthousiasmant. Ces toutes petites molécules aux très grands effets nous obligent, en effet, à comprendre la régulation fine de l’expression génique et ses conséquences sur les fonctions biologiques de la cellule, qu’elle soit normale ou pathologique.

Remerciements

Au docteur Lydie Da Costa (service d’hémato-immunologie, IGR) pour sa relecture critique du manuscrit.

Références

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4 Zhao Y, et al. Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis. Nature 2005 ; 436 : 214-20.

5 Calin G, et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci USA 2004 ; 101 : 2999-3004.

6 Lu J, et al. Micro RNA expression profiles classify human cancers. Nature 2005 ; 435 : 834-8.

7 He L, et al. A micro RNA polycistron as a potential human oncogene. Nature 2005 ; 435 : 828-33.

8 O’Donnel K, et al. C-myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature 2005 ; 435 : 839-43.

9 Eis P, et al. Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas. Proc Natl Acad Sci USA 2005 ; 102 : 3627-32.

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12 Nelson PT, et al. Microarray-based, high through put gene expression profiling of microRNAs. Nature Methods 2004 ; 1 : 155-61.

13 Chan J, et al. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res 2005 ; 65 : 6029-33.

14 Bruneau BG. Tiny brakes for a growing heart. Nature 2005 ; 436 : 181-2.