Effets vasodilatateurs des composés polyphénoliques du vin : rôle de NO et EDHF

ARTICLE

Auteur(s) : Thierry Chataigneau, Mamadou Ndiaye, Valérie B. Schini-Kerth

Pharmacologie et physico-chimie des interactions cellulaires et moléculaires, UMR CNRS 7034, faculté de pharmacie, université Louis Pasteur de Strasbourg, Strasbourg, France

Les composés polyphénoliques du vin stimulent la formation endothéliale de NO

Augmentation de l'activité de la NO synthase

La NO synthase endothéliale, exprimée constitutivement, est l'enzyme qui catalyse la formation de NO à partir de L-arginine dans les cellules endothéliales. Le NO peut alors diffuser vers les cellules musculaires lisses sous-jacentes et induire leur relaxation suite à l'activation de la guanylyl cyclase soluble entraînant la formation de guanosine 3' :5' monophosphate cyclique (GMP cyclique), le second messager principal du NO. Les principaux stimuli de l'activation de la NO synthase endothéliale incluent les forces de cisaillement du flux sanguin, des substances libérées par les terminaisons nerveuses, des hormones circulantes, des produits plaquettaires et dérivés de la coagulation et des autacoïdes produits par les cellules vasculaires (pour revue [13]).
De nombreuses études récentes indiquent que les composés polyphénoliques du vin constituent une nouvelle classe de stimuli pour la formation endothéliale de NO. La capacité d'extraits de peau, de pulpe, de jus de raisin et de vins rouges et blancs à induire des relaxations dépendantes de l'endothélium et médiées par NO a été examinée initialement sur des anneaux d'aorte de rat isolés [9]. Dans cette étude, il a été montré que les vins rouges sont plus efficaces et plus puissants que les vins blancs et que, de même, les extraits de peau de raisin noir sont plus puissants que les extraits de peau de raisin blanc, en terme d'effet relaxant. D'autre part, si les extraits aqueux de pulpe de raisin et l'éthanol sont dépourvus d'effet, les extraits de peau de raisin induisent des relaxations dépendantes de l'endothélium associées à une augmentation de la synthèse tissulaire de GMP cyclique. L'effet relaxant et la formation de GMP cyclique sont sensibles à un inhibiteur compétitif de la NO synthase indiquant l'implication du NO [9]. Les composés polyphénoliques extraits de pépins de raisin sont également capables d'induire des relaxations dépendantes de l'endothélium dans l'aorte de rat [14]. Des relaxations dépendantes de l'endothélium impliquant la voie NO/GMP cyclique ont aussi été obtenues dans les artères coronaires humaines et dans l'aorte de lapin en réponse à des vins rouges [11, 15] et dans l'artère coronaire de porc en réponse aux composés polyphénoliques du vin rouge [12]. Une vasodilatation dépendante de l'endothélium et médiée en partie par le NO a été mise en évidence dans le lit mésentérique perfusé de rat en réponse à un extrait non alcoolisé de peau de raisin (Vitis labrusca) [16]. Des relaxations dépendantes de l'endothélium sont obtenues pour des concentrations allant jusqu'à 10^–2 g/L de composés polyphénoliques d'un extrait sec de vin rouge dans l'aorte de rat [10]. Cependant, pour des concentrations supérieures à 10^–2 g/L, un effet relaxant direct sur le muscle lisse est observé [10].
Par ailleurs, l'éthanol, testé seul à des concentrations équivalentes à celles contenues dans le vin, est dépourvu d'effet relaxant [11]. L'effet relaxant est corrélé avec la teneur en composés polyphénoliques, ce qui suggère très fortement que ces composés sont les molécules actives du vin [17]. Ceci est en accord avec les études indiquant que différents composés polyphénoliques isolés du vin tels que la quercétine, le resvératrol et l'acide tannique sont capables d'induire des relaxations dépendantes de l'endothélium des anneaux d'artère isolés impliquant le NO [9, 18]. Plus récemment, la démonstration directe d'une formation accrue de NO en réponse aux composés polyphénoliques du vin rouge et à la delphinidine a été obtenue dans des segments d'aorte de rat présentant un endothélium fonctionnel, à l'aide de la technique de résonnance paramagnétique électronique [9, 19].
Néanmoins, ces données n'excluent pas que les composés polyphénoliques du vin rouge pourraient aussi augmenter la biodisponibilité du NO en empêchant sa dégradation par les espèces réactives de l'oxygène. Ce sont les vins rouges qui ont la plus grande capacité anti-oxydante variant, in vitro, de 13,8 mmol/L à 25,2 mmol/L et cet effet est directement proportionnel à leur concentration en polyphénols [20]. Les propriétés anti-oxydantes des polyphénols s'expliquent en partie par leur aptitude à réagir directement avec les anions superoxydes, les radicaux hydroxyls et les radicaux produits par la peroxydation lipidique [21-23]. Les autres effets anti-oxydants des polyphénols incluent l'inhibition de la xanthine oxydase, une des principales sources enzymatiques d'espèces réactives de l'oxygène vasculaires, et une stimulation des systèmes antioxydants endogènes (pour revue, [23]). Il apparaît également que l'effet relaxant dépendant de l'endothélium du trans-resvératrol, un dérivé trihydroxy stilbène, pourrait s'expliquer par l'inhibition de la production d'anions superoxydes par la NAD(P)H oxydase dans l'aorte de rat [24].

Rôle du calcium intracellulaire

L'activité de la NO synthase endothéliale en réponse aux hormones est principalement régulée par la concentration cytosolique en calcium libre. Dans les cellules endothéliales au repos, l'enzyme est préférentiellement localisée au niveau des caveolae et son activité est régulée négativement par la cavéoline. Après stimulation endothéliale par les agonistes tels que la bradykinine, le complexe cavéoline/NO synthase est dissocié permettant l'activation de la NO synthase par le complexe calcium/calmoduline consécutive à l'augmentation de la concentration cytosolique en calcium libre [25, 26]. Des études récentes indiquent que les composés polyphénoliques du vin rouge et la delphinidine, à la concentration de 10^–2 g/L, sont capables d'induire une augmentation de la concentration cytosolique en calcium libre entraînant la formation de NO dans les cellules endothéliales [19, 27]. Le signal calcique implique à la fois un relargage d'ions calcium de stocks intracellulaires et un influx calcique. Néanmoins, l'amplitude du signal, qui avoisine les 100 nmol/L et 200 nmol/L pour les composés polyphénoliques du vin rouge et la delphinidine, respectivement [27], est très faible en comparaison à celles induites par les agonistes classiques tels que la bradykinine et la thrombine. L'ensemble de ces observations indique que le signal calcique est un mécanisme important de la régulation de l'activité de la NO synthase endothéliale par les composés polyphénoliques du vin ; cependant, il est vraisemblable que d'autres mécanismes puissent être impliqués.

Rôle de la voie PI3-kinase/Akt

Une autre voie d'activation de la NO synthase endothéliale a récemment été démontrée. Elle est indépendante du calcium et fait intervenir la voie phosphoinositide-3 kinase (PI3-kinase)/Akt aboutissant à la phosphorylation de la NO synthase sur le résidu sérine 1177. Dans cette voie de signalisation, les lipides membranaires phosphatidylinositol-4,5-bisphosphates sont convertis en phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphates par la PI3-kinase. Il s'ensuit le recrutement de Akt (ou protéine kinase B) au niveau des phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphates et son activation après phosphorylation par la protéine kinase 1 dépendante des phosphoinositides (PDK1). Cette voie PI3-kinase/Akt est impliquée dans l'activation de la NO synthase endothéliale en réponse aux forces de cisaillement qu'exerce le flux sanguin sur la surface luminale des cellules endothéliales [28] et aussi en réponse aux estrogènes et à certains facteurs de croissance tels que le vascular endothelial growth factor. Récemment, nous avons pu montrer que, dans des cellules endothéliales d'artère coronaire de porc, les composés polyphénoliques du vin induisent une phosphorylation rapide de Akt, maximale après 1 à 3 min, et de la NO synthase endothéliale [29]. Le fait que des inhibiteurs de la voie de signalisation PI3-kinase/Akt, la wortmannine et le LY 294002, inhibent la phosphorylation de Akt et de la NO synthase endothéliale indique que Akt est située en amont de la NO synthase endothéliale. Un rôle majeur de la voie PI3-kinase/Akt dans la formation endothéliale de NO est aussi suggéré par les données indiquant que les inhibiteurs de cette voie réduisent fortement les relaxations dépendantes de l'endothélium et médiées par le NO en réponse aux composés polyphénoliques dans des anneaux isolés d'artère coronaire de porc [29].

Augmentation de l'expression de la NO synthase endothéliale

La modulation du niveau d'expression de la NO synthase endothéliale constitue un autre mécanisme de régulation de la formation endothéliale de NO. Ainsi, il a pu être montré que l'exposition des cellules endothéliales à différents vins rouges entraîne une augmentation de l'expression de la NO synthase endothéliale [30, 31]. Cependant, cet effet stimulateur nécessite des volumes importants de vin (1 % vol/vol du milieu de culture pour une exposition de 10 jours, 3 % vol/vol pour une exposition de 24 h et 10 % vol/vol pour une exposition de 12 h) [31]. De tels rapports de volume sont probablement difficiles à atteindre in vivo. L'effet est attribuable à la composante polyphénolique des vins puisque l'éthanol seul n'affecte pas l'expression de la NO synthase endothéliale [31] alors qu'une augmentation est obtenue en réponse à un extrait de vin rouge sans alcool [32]. Néanmoins, l'augmentation de l'expression de la NO synthase n'est obtenue qu'à des concentrations élevées d'extrait, de l'ordre de 4 × 10^–1 g/L [32]. De plus, il a été montré que le resvératrol est aussi capable de stimuler l'expression de la NO synthase endothéliale dans une gamme de concentrations de 10 à 100 µmol/L [30, 33]. L'augmentation de l'expression de l'ARN messager de la NO synthase endothéliale s'accompagne d'une augmentation de l'expression de la protéine et de l'activité de l'enzyme ; elle met en jeu un accroissement de l'activité du promoteur de la NO synthase endothéliale (effet transcriptionnel) et une stabilisation de l'ARN messager de la NO synthase endothéliale (effet post-transcriptionnel) [30]. Ces effets se traduisent par une augmentation de la formation de NO biologiquement actif [30].

Les composés polyphénoliques du vin induisent des relaxations et hyperpolarisations médiées par EDHF

Dans la plupart des vaisseaux résistifs et de moyen diamètre, y compris les artères coronaires, il existe une composante des relaxations dépendantes de l'endothélium qui est résistante à la combinaison d'inhibiteurs de la synthèse de NO et de prostaglandines et qui peut être stimulée par les agonistes classiques tels que la bradykinine et l'acétylcholine. Les études électrophysiologiques ont montré que ces relaxations sont associées à une hyperpolarisation dépendante de l'endothélium des cellules musculaires lisses, elle aussi résistante à la combinaison d'inhibiteurs de la synthèse de NO et de prostaglandines. Ces réponses ont ainsi été attribuées au facteur hyperpolarisant EDHF [34]. L'hyperpolarisation endothéliale, abolie par la combinaison de deux toxines, la charybdotoxine et l'apamine inhibant respectivement des canaux potassiques dépendants du calcium de moyenne et faible conductance, semble être un pré requis pour l'hyperpolarisation des cellules musculaires lisses dans la signalisation d'EDHF. La transmission de l'hyperpolarisation entre les deux types cellulaires implique vraisemblablement soit des jonctions gap myo-endothéliales soit les ions K⁺ issus de l'efflux potassique endothélial ; à faible concentration dans l'espace intercellulaire, les ions K⁺ peuvent activer à la fois l'ATPase Na⁺/K⁺ et des canaux potassiques rectifiants dans le sens entrant des cellules musculaires lisses et ainsi induire leur hyperpolarisation. Cette hyperpolarisation a pour principal effet d'empêcher l'activation des canaux calciques dépendants du potentiel, ce qui a pour conséquence une diminution de la concentration cytosolique en calcium libre et la relaxation (pour revue, [35]). Récemment, nous avons pu montrer qu'un extrait de composés polyphénoliques du vin rouge induit des relaxations dépendantes de l'endothélium dans des anneaux isolés d'artères coronaires de porc mettant en jeu le NO mais aussi EDHF. Les relaxations résistantes aux inhibiteurs de la synthèse de NO et de prostaglandines sont attribuées à EDHF car elles sont abolies par la combinaison de la charybdotoxine et l'apamine. Elles sont observées dans une gamme de concentration de 10^–3 à 10^–1 g/L d'extrait de vin rouge et l'effet relaxant maximal, environ 80 % du tonus développé, est atteint à 10^–1 g/L. Les relaxations sont associées à des hyperpolarisations des cellules musculaires lisses sensibles à la combinaison de la charybdotoxine et l'apamine et donc attribuables à EDHF [12]. Des études récentes ont indiqué que le resvératrol est capable d'activer les canaux potassiques dépendants du calcium de moyenne conductance (IK _Ca, 24 pS) en augmentant leur probabilité d'ouverture dans une lignée de cellules endothéliales [36]. Cette caractérisation ayant été réalisée en grande partie avec la configuration inside-out de la technique du patch-clamp, la participation d'un métabolite intracellulaire aux effets du resvératrol semble pouvoir être exclue. La possibilité que l'hyperpolarisation endothéliale consécutive à cet effet activateur contribue aux relaxations attribuées à EDHF et induites par le mélange de composés polyphénoliques de vin rouge dans l'artère coronaire de porc [12] reste à être étudiée.

Rôle des anions superoxydes

De façon tout à fait surprenante, les réponses médiées par EDHF en réponse aux composés polyphénoliques de vin rouge se sont révélées dépendantes de la production intracellulaire d'espèces réactives de l'oxygène, plus précisément d'anions superoxydes dans les cellules endothéliales. En effet, ces réponses sont abolies par des antioxydants, des mimétiques perméants membranaires de la superoxyde dismutase (SOD) tels que le Mn(III)tetrakis(1-méthyl-4-pyridyl)porphyrine (MnTMPyP) et la polyéthylèneglycol-SOD, et peu ou pas affectées par la SOD extracellulaire, la catalase et la polyéthylèneglycol-catalase. De plus, nous avons pu observer, à l'aide d'une sonde fluorescente (hydroéthidine) en microscopie confocale, que les composés polyphénoliques stimulent la formation d'anions superoxydes dans les cellules endothéliales isolées d'artère coronaire de porc ; cette production est abolie par le MnTMPyP. La source enzymatique d'anions superoxydes ne correspond, ni à la xanthine oxydase, ni aux cytochromes P450 monoxygénases et ni à la chaîne respiratoire mitochondriale comme le révèle l'absence d'effet des inhibiteurs respectifs de ces différentes voies sur les relaxations EDHF induites par les composés polyphénoliques [12, 37].

Rôle de la voie PI3-kinase/Akt

Les relaxations médiées par EDHF, et induites par les composés polyphénoliques du vin rouge, sont fortement réduites par des inhibiteurs de la voie PI3-kinase/Akt, la wortmannine et le LY 294002 alors que celles induites par la bradykinine et la lévcromakalime, un activateur des canaux potassiques sensibles à l'ATP, ne sont pas affectées [38]. Les composés polyphénoliques du vin sont également capables d'induire, en présence d'inhibiteurs de la synthèse de NO et de prostaglandines, la phosphorylation de Akt dans les cellules endothéliales d'artère coronaire de porc et cet effet est aboli par le MnTMPyP. L'ensemble de ces résultats indique que la formation d'anions superoxydes et l'activation de la voie PI3-kinase/Akt sont des étapes cruciales dans les réponses médiées par EDHF et induites par les composés polyphénoliques du vin dans les artères coronaires de porc [38]. Les cibles potentielles de cette voie de signalisation originale pourraient correspondre aux canaux potassiques endothéliaux de moyenne et faible conductance, dépendants du calcium et sensibles à la charybdotoxine et l'apamine. Ces cibles restent toutefois à être identifiées.

Effets vasodilatateurs in vivo

Chez le rat normotendu, l'administration intragastrique de composés polyphénoliques du vin rouge pendant 7 jours à raison de 20 mg/kg/jour réduit significativement la pression artérielle dès le 4^e jour [39]. D'autre part, les effets de l'administration orale d'un extrait non alcoolique de peau de raisin (Vitis labrusca), à raison de 100 mg/kg/jour, sur la pression artérielle ont été examinés sur deux modèles de rats hypertendus, l'un obtenu par l'inhibition chronique de la NO synthase avec le L-NAME et l'autre par l'administration de sel d'acétate de désoxycorticostérone (DOCA-salt) [16]. Cette étude indique que l'extrait réduit significativement les pressions systolique, moyenne et diastolique des rats hypertendus dans les deux modèles. Une autre étude montre que l'administration de composés polyphénoliques du vin rouge (40 mg/kg/jour dans l'eau de boisson) accélère la normalisation de la pression artérielle, après arrêt d'administration de L-NAME chez le rat, et que cet effet est associé à une diminution significative de l'épaississement de la paroi aortique et de la fibrose myocardique [40]. De plus, l'étude ex vivo de la réactivité vasculaire d'aortes de rats recevant un régime alimentaire enrichi en vin rouge sans alcool pendant 10 jours (35 % vol/poids) démontre une faible potentialisation des relaxations dépendantes de l'endothélium induites par l'acétylcholine ainsi qu'une augmentation de l'activité de la NO synthase endothéliale et une formation accrue de NO [41]. De manière comparable aux résultats obtenus avec les extraits de vin et de raisin, la prise orale de quercétine, à raison de 10 mg/kg/jour pendant 5 semaines, diminue la pression artérielle ainsi que les hypertrophies rénales et cardiaque chez les rats spontanément hypertendus [42]. De plus, l'administration chronique de régimes enrichis soit en quercétine (0,3 % poids/poids) soit en catéchine (0,3 % poids/poids), à des rats durant 10 jours, entraîne une augmentation de l'activité basale de la NO synthase endothéliale détectée ex vivo dans des homogénats d'aorte [41].
Des études chez l'homme sain indiquent que l'ingestion de 500 mL de vin rouge avec ou sans alcool est associée à une augmentation de la vasodilation médiée par le flux sanguin, en réponse à une hyperémie réactionnelle [43]. La vasodilation médiée par le flux sanguin est aussi augmentée par l'ingestion à court terme (14 jours) de jus de raisin noir (4 mL/kg/jour) chez les patients atteints de maladie coronarienne [44].

Conclusion

De nombreuses études expérimentales indiquent clairement que les composés polyphénoliques du vin induisent des relaxations nécessitant un endothélium fonctionnel, dans de nombreux types d'artères isolées. Ces relaxations impliquent principalement le NO et dans certains types de vaisseaux, comme les artères coronaires, l'EDHF, deux puissants facteurs vasorelaxants. Cet effet vasorelaxant est observé non seulement avec le vin mais aussi le vin sans alcool, le jus de raisin et des extraits de peau et de pépins de raisin, ce qui suggère que les composés polyphénoliques sont les molécules actives. Malgré le faible nombre d'études in vivo, l'ensemble des données suggère que les composés polyphénoliques sont capables de diminuer la pression artérielle et d'améliorer les relaxations dépendantes de l'endothélium dans les modèles expérimentaux d'hypertension artérielle et chez l'homme. Néanmoins, il reste encore à déterminer quels sont les mécanismes responsables des effets vasodilatateurs et quels sont les composés actifs. D'autre part, il semble que l'effet vasorelaxant sur les artères isolées puisse être obtenu à des concentrations similaires à celles présentes dans le sang après ingestion de vin chez l'homme. En effet, l'ingestion de 100 mL de vin rouge entraîne une augmentation de la concentration plasmatique totale de phénols d'environ 3 × 10^–3 g/L après 30 min [45]. De plus, la consommation moyenne de vin avoisine les 180 mL/jour/personne en France [20]. L'identification et la compréhension des mécanismes des compo-sés polyphénoliques du vin au niveau des vaisseaux sanguins sains et pathologiques devraient permettre de mieux comprendre leurs effets protecteurs vasculaires chez l'homme n

Remerciements. Les auteurs remercient l'EVSRV (Institut européen vin et santé des régions viticoles et l'ONIVINS (ministère de l'Agriculture, France) pour leur soutien financier.

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