Dosage direct du calcium ionisé plasmatique ou estimation par calcul : intérêts et limites

ARTICLE

Auteur(s) : S. Gidenne¹, J.-F. Vigezzi¹, H. Delacour¹, J. Damiano², Y. Clerc¹

¹ Service de biochimie, sgidenne@free.fr

² Service de médecine, Hôpital d’instruction des armées du Val-de-Grâce, 74, boulevard Port Royal 75005 Paris

Article reçu le 16 octobre 2002, accepté le 11 décembre 2002

Il y a 10 ans on pouvait penser que la mesure directe du calcium ionisé par électrode sélective allait rapidement supplanter celle du calcium total [1]. Or il n’en est rien à l’heure actuelle et l’immense majorité des laboratoires d’analyse en sont restés au dosage du calcium total. Par exemple en 2001, sur 870 laboratoires ayant participé au contrôle national de qualité de gazométrie 01GAZ1 incluant le calcium ionisé, seuls 156 laboratoires ont été pris en compte pour ce paramètre. Inversement, la même année, ils étaient 3 713 pour le calcium total (campagne 01BIO2). C’est pourquoi il nous paraît utile de rappeler les dangers de l’estimation par calcul du calcium ionisé à partir du calcium total (ou de la correction de la calcémie totale) et de souligner l’intérêt de la mesure directe de cet ion par électrode sélective alors qu’une méthode internationale vient d’être proposée et qu’un parc très satisfaisant d’analyseurs est à la disposition du biologiste.

Rappels biochimiques

Rôle physiologique

Quatre-vingt-dix-neuf pour cent du stock calcique est localisé dans le squelette, ce qui représente une masse voisine de 1 kg pour un adulte pesant 70 kg. Le reste, soit 1 %, est présent dans le liquide extracellulaire. Le calcium relaie de nombreuses actions hormonales en tant que second messager et sa présence est indispensable au fonctionnement de multiples transporteurs membranaires et enzymes. Il joue de ce fait un rôle capital dans des processus aussi essentiels que la croissance, la multiplication et la différenciation cellulaires, la coagulation sanguine, la conduction nerveuse, la transmission neuro-musculaire et la contraction musculaire. On sait depuis 1935 que la fraction biologiquement active du calcium est la forme ionisée (Ca^2 + ) [2].

Différentes fractions sanguines

Une faible fraction du calcium osseux s’échange quotidiennement avec le compartiment extracellulaire, en particulier avec le plasma, contribuant au maintien stable de la calcémie. Dans le sang, le calcium circule sous différentes formes (figure 1). Près de 40 % du calcium total (1 mmol/L en moyenne) est fixé aux protéines plasmatiques, c’est le calcium non ultrafiltrable. Les trois-quarts sont liés à l’albumine et un quart aux globulines dont le rôle ne doit pas être oublié. Il existe une compétition entre le calcium et les protons vis-à-vis des groupements carboxylés des protéines et principalement l’albumine. Le logarithme de la concentration du calcium ionisé est une fonction linéaire du pH entre 7,20 et 7,60. In vitro, la pente est de – 0,24 pour le plasma et – 0,22 pour le sang total, in vivo elle est de – 0,21 chez le sujet normal [3, 4]. Une acidose aiguë augmente la fraction de calcium ionisé et cette propriété peut être mise à profit pour faire céder une crise de tétanie en provoquant une acidose respiratoire. Si cette situation se prolonge, la concentration en calcium ionisé se normalise par baisse de la calcémie totale après l’intervention des hormones calciotropes : la parathormone et le métabolite actif de la vitamine D (1,25 dihydroxy-vitamine D ou calcitriol). À l’inverse, une alcalose aiguë diminue la fraction ionisée (tableau I).

Tableau I. Variation des fractions plasmatiques du calcium en fonction de l’équilibre acido-basique

Les 60 % restants (1,26 à 1,52 mmol/L) sont dits ultrafiltrables. Un cinquième est complexé par différents anions : citrates, phosphates, lactates, bicarbonates, oxalates, acétates, acides gras. Le reste existe sous la forme ionisée, seule responsable de l’activité biologique et de la régulation parathyroïdienne mais, la force ionique du plasma étant de 0,16 mol/kg en moyenne, son coefficient d’activité n’est que de 0,34 [5]. Tout se passe comme si la fraction ionisée active ne représentait que 15 % du calcium total plasmatique.
Ainsi les seules situations où la valeur du calcium total possède une efficacité clinique sont celles où l’équilibre de ces différentes formes n’est pas modifié. Dans le cas contraire, la mesure directe du calcium ionisé s’impose alors, mais en l’absence d’appareillage disponible, de nombreuses formules de correction du calcium total ont été proposées dans le passé pour y remédier.

Estimation par calcul du calcium ionisé à partir du calcium total

Dosage du calcium total

Le prélèvement doit être fait à jeun car l’augmentation de la calcémie en période post-prandiale peut atteindre 0,15 mmol/L (0,08 mmol/L en moyenne) chez les sujets sains, voire plus chez les sujets présentant une « hyper-absorption » intestinale du calcium [6]. Il faut également souligner que l’exercice musculaire et la stase veineuse peuvent majorer la calcémie.
Le calcium total est principalement dosé par des techniques colorimétriques à l’ortho-crésol-phtaléine, au bleu de méthyle thymol ou à l’arsenazo III (82 % des laboratoires selon les annales du contrôle national de qualité n° 21), plus rarement par réflectométrie (12 %), ou par électrode sélective après acidification (2 %). La spectrophotométrie d’émission ou d’absorption atomique sont devenues des techniques anecdotiques (0,3 % des utilisateurs pour chacunes) bien que cette dernière soit la méthode de référence.
Avec les techniques courantes les valeurs de référence s’échelonnent de 2,25 à 2,60 mmol/L chez l’adulte.

Les formules d’estimation

Le tableau II en regroupe les principales, certaines ne prennent en compte que les protides totaux [7, 8], d’autres uniquement l’albuminémie [8-13] ou encore le rapport albuminémie/protidémie. Des formules plus complexes intégrant l’albumine plasmatique, le taux de globulines et le pH [14], la kaliémie [1], voire le trou anionique [15, 16] ont même été proposées. La commercialisation des analyseurs mesurant de façon fiable le calcium ionisé date du début des années 1980, ce qui permet de comprendre l’ancienneté des formules proposées. Leur grande diversité montre qu’aucune ne s’est imposée, ce qui n’est pas une preuve d’efficacité, et les plus utilisées semblent être les formules de Parfitt [8]. À l’exception de leurs inventeurs, rares sont les auteurs qui constatent une bonne corrélation entre la calcémie ionisée et les formules de calcul. Certains auteurs se satisfont de ne retrouver que 11 % de faux négatifs (Ca⁺⁺  calculé normal alors que le Ca⁺⁺  mesuré est augmenté) chez 31 insuffisants rénaux [17]. Mais leur formule est complexe et fait intervenir en outre les constantes d’affinité du calcium ionisé à l’albumine et aux globulines. Ils attribuent ces bons résultats au type d’électrode employé, qui selon eux est plus stable et plus robuste que celles utilisées lors des études précédentes. De même une bonne corrélation entre mesure et calcul du Ca⁺⁺  a pu être retrouvée au cours de certaines études [18]. En y intégrant le pH, la corrélation a pu être améliorée [18]. D’autres prennent en compte les concentrations de calcium total, de globulines et d’albumine dans une formule cubique complexe et peu utilisable en routine [19].

Tableau II. Exemples de formules d’estimation de la calcémie ionisée ou de correction de la calcémie totale

Ca tot : calcium total en mmol/L ; prot : protides totaux en g/L ; alb : albumine en g/L ; K⁺ : potassium en mmol/L ; TA : trou anionique en mmo/L ; H⁺ : protons en mmol/L.

Les limites des formules d’estimation

Un grand nombre d’auteurs les soulignent et selon Siggaard-Andersen, le calcul de la calcémie ionisée est entaché, dans le meilleur des cas, d’une erreur deux fois plus élevée que sa mesure directe [20].

Erreurs dues à la liaison variable avec l’albumine

La quantité de calcium fixée par l’albumine varie dans de larges proportions selon les individus. Dans une série de 62 sujets souffrant de pathologies diverses, la quantité de calcium fixé par gramme d’albumine a été évaluée à 0,025 mmole avec des variations du simple au sextuple selon l’individu [21].

Erreurs analytiques

Chaque élément intégré dans la formule de correction apporte aussi son erreur analytique. Le dosage de l’albumine est particulièrement médiocre : 6,8 à 7,4 % de coefficient de variation toutes techniques selon les derniers contrôles nationaux de qualité contre 3 à 4,2 % pour le dosage des protéines totales. De plus, il est perturbé par certaines situations pathologiques. Ainsi, un état inflammatoire provoque une surestimation de l’albuminémie mesurée par le vert de bromocrésol (BCG) [22]. Le sérum des patients hémodialysés contiendrait un ligand capable d’entrer en compétition avec le calcium vis-à-vis du rouge de bromocrésol (BCP) ce qui aurait pour conséquence de minorer l’albuminémie [23]. Ainsi, chez le patients dialysés, les écarts peuvent être importants, compris entre 5 à 16 g/L selon que l’albuminémie est dosée avec le BCG ou le BCP [24].

Impossibilité de tenir compte de toutes les pathologies ou de leur traitement

Un grand nombre de pathologies bouleversent l’équilibre des différentes formes du calcium et aucune formule ne peut en pratique tenir compte de tous les facteurs perturbateurs. Elles ne prennent en compte, le plus souvent, que l’albuminémie ou la protidémie et le pH. Aucune d’entre elles n’intègre des éléments habituellement mineurs mais qui peuvent être majorés par la pathologie. Une étude déjà ancienne, mais portant sur 1 213 sujets atteints de désordres du métabolisme phosphocalcique, montrait une discordance entre la mesure directe du calcium ionisé et son estimation par une formule de correction intégrant l’albumine dans 18 % des cas [25].

Cas de l’insuffisance rénale

Au cours des atteintes de la fonction rénale surviennent des hypercalcémies comme des hypocalcémies. Certaines sont liées à des troubles de la fonction parathyroïdienne ou du métabolisme de la vitamine D. L’insuffisance rénale chronique évolue vers l’acidose avec l’augmentation des concentrations plasmatiques en protons, en phosphates et en sulfates. D’autres agents complexants tels que les oxalates ou les lactates peuvent voir leur concentration augmenter. Ainsi, les différentes études réalisées chez l’hémodialysé concluent à la nette supériorité de la mesure directe du calcium ionisé par rapport à celle du calcium total pour l’exploration du statut calcique [16, 26]. Cependant, chez les sujets insuffisants chroniques stables, les causes majeures d’hypercalcémie sont l’hémoconcentration et l’hypophosphorémie. Chez ces patients, le pourcentage de calcium ionisé est le même que chez les témoins et il ne varie pas en fin de dialyse en dépit d’une légère augmentation de 0,09 unités pH. Le dosage direct du calcium ionisé est donc préconisé, mais en cas d’impossibilité technique, une simple division de la calcémie totale par 2 permettrait d’apprécier de façon plus fine sa valeur que l’application de certaines formules de calcul [26].

Myélome multiple

Cette affection provoque une hypercalcémie car les ostéoclastes stimulés par les cytokines des cellules myélomateuses ou induites par leurs effets sur le stroma médullaire (interleukine 6 ou IL6, tumor necrosis factor ou TNFβ) détruisent la structure osseuse. L’expertise du biologiste est ici indispensable. La valeur du calcium total, associée aux critères suivants : hémoglobinémie, concentration sanguine et urinaire de l’immunoglobuline monoclonale, aspect osseux, est à la base de la classification de Salmon et Durie ; classification des myélomes en trois stades, universellement adoptée et dont l’objectif est d’évaluer la masse tumorale. C’est bien ici le calcium total, reflet de l’ostéolyse, qui doit être pris en compte comme critère : s’il dépasse 120 mg/L (3 mmol/L) il s’agit d’un stade III.
En revanche, pour évaluer l’hypercalcémie génératrice de graves désordres fonctionnels chez un tiers des patients [27] et pour décider d’un traitement hypocalcémiant, il est essentiel de s’appuyer sur un dosage direct du calcium ionisé.
D’une part, nous avons vu combien les estimations par calcul sont hasardeuses et, d’autre part, dans quelques cas, un calcium total très augmenté peut coexister avec une concentration normale en calcium ionisé. C’est en 1948 que la possibilité d’une liaison accrue de calcium par certaines protéines monoclonales fut pour la première fois évoquée [28]. Cette hypothèse ne fut prouvée que 30 années plus tard pour un myélome à IgG monoclonale [29], puis par d’autres auteurs [30-41]. Une douzaine de cas seulement ont été rapportés en 25 ans mais ce nombre est certainement sous-estimé : les différentes études menées, dans le cas du myélome, laissent penser qu’une fausse hypercalcémie est retrouvée chez 2 à 7 % des patients [29-32]. Pour illustrer ces propos reprenons l’exemple décrit par Ladenson et Mc Donald en 1979 [33]. Il s’agissait d’un sujet atteint de myélome à IgG λ sans signes cliniques d’hypercalcémie apparents et dont les valeurs biologiques sont reproduites dans le tableau III. Cet exemple illustre parfaitement les imperfections des formules de calcul, mais également les insuffisances du dosage du calcium total dans certaines situations pathologiques.

Tableau III. Valeurs biologiques d’entrée d’un patient présentant un myélome, lors de deux admissions [33]

(1) selon la formule de Parfitt.

Le site de liaison du calcium a été localisé au niveau du frament Fab de la protéine monoclonale [31, 37]. Par ailleurs, il semble que les différents polymères d’une IgA monoclonale puissent fixer dans certains cas le calcium avec une affinité très supérieure à celle de l’albumine [40]. Enfin, certaines méthodes de dosage du calcium total peuvent être faussées par la présence d’une immunoglobuline monoclonale hyperfixante. Sont concernées par ce phénomène, les méthodes colorimétriques qui reposent sur une réaction directe du calcium avec un complexon, sans acidification préalable. Dans ce cas, l’immunoglobuline monoclonale entre en compétition avec le complexon et minore la calcémie.
Ainsi, Ladenson et al. rapportent pour un myélome à IgG lambda des valeurs de calcémies très discordantes selon la méthode de dosage utilisée : pour un calcium ionisé de 1,30 mmol/L, le calcium total passe de 2,70 mmol/L s’il est dosé par réaction directe avec l’orthocrésolphtaléine à 3,50 mmol/L s’il est dosé par spectrophotométrie d’absorption atomique [33].
Outre les cas particuliers rapportés précédemment, d’autres pathologies ou situations nécessitent des dosages directs du calcium ionisé. C’est le cas des déséquilibres acidobasiques quelle qu’en soit l’étiologie, les dysfonctionnements parathyroïdiens, l’insuffisance cardiaque, les grands brûlés, les transfusions ou perfusions de liquides citratés.

Dosage direct du calcium ionisé

Actuellement, le dosage du calcium ionisé par électrode sélective est fiable à condition de respecter certaines précautions.

Prélèvement

Le prélèvement peut être veineux, artériel ou capillaire mais doit être strictement anaérobie afin d’éviter toute augmentation du pH par perte de gaz carbonique. En cas de dosage différé, il convient de le placer à + 4 °C afin de limiter la glycolyse à partir des globules rouges sanguins et éviter ainsi la formation de lactates responsables de l’acidification du spécimen. Une fois centrifugés, plasma et sérum peuvent être conservés 4 heures à température ambiante, 24 heures à + 4 °C et plusieurs mois à – 18 °C [42].
Il est préférable de travailler sur tube sec sans gel séparateur [43], mais il faudra attendre une coagulation complète et ne le déboucher qu’au moment du dosage, ce qui est peu compatible avec l’urgence et impose pratiquement le remplissage d’un tube supplémentaire. Le prélèvement sur anticoagulant non chélateur est donc plus répandu, les plus appropriés étant l’héparinate de sodium ou de lithium. Le récipient peut être soit une seringue de gazométrie avec mesure sur sang total, soit un tube classique avec mesure sur sang total ou plasma selon l’appareillage. Il faut noter que l’héparine peut aussi légèrement chélater du calcium : 1 unité par millilitre de sang diminue le calcium ionisé de 0,01 mmol/L. Il est donc préférable que l’héparine soit « compensée » en calcium, c’est-à-dire prééquilibrée avec une solution titrant 1,25 mmol/L de calcium. Seringues et tubes doivent être remplis à leur capacité nominale pour respecter la proportion héparine/sang et minimiser ce risque de chélation. Une héparine sèche est préférable à la forme liquide pour éviter toute dilution de l’échantillon, une « présentation » judicieuse étant l’imprégnation d’un disque poreux servant d’agitateur au sein de la seringue. L’emploi d’un piège à micro-caillots est recommandé, particulièrement si l’analyseur est à système jetable.

En résumé, pour le dosage du calcium ionisé, le sang doit être prélevé le matin à jeun dans un tube hépariné, une seringue ou un capillaire avec les mêmes précautions que pour la mesure du pH et des gaz du sang. Le plus souvent, le matériel de prélèvement utilisé est le même que celui des gaz du sang.

La technique de référence de l’IFCC

Dans le passé, de nombreux auteurs avaient pu regretter l’absence de consensus international sur une méthode et des étalons de référence. Cette lacune a été comblée en 2000 par l’International federation of clinical chemistry and laboratory medicine [5]. Nous en résumons ci-après les principaux points (figure 2).
La membrane sélective est en polychlorure de vinyle imprégné d’une substance électroactive aux ions calcium. Son indice de sélectivité vis-à-vis des cations (Mg⁺⁺ , Na⁺, K⁺, NH4⁺, Zn⁺⁺ ) doit être tel que l’erreur possible sur le Ca⁺⁺  ne dépasse pas 1 %. Un fil d’argent recouvert de chlorure d’argent est immergé dans la solution de référence interne qui contient du chlorure de calcium. L’électrode de référence externe est au calomel. Une solution saturée de chlorure de potassium assure le contact électrique entre l’électrode de référence et l’échantillon par un dispositif en « T ». Le choix du chlorure de potassium, dont chaque ion présente la même mobilité, vise à minimiser le potentiel de jonction parasite.
L’IFCC recommande trois étalons primaires aqueux titrés à 0,40, 1,25 et 2,50 mmol/L, de composition soigneusement définie et dont la force ionique est égale à celle du plasma (0,16 mol/kg). Elle formule aussi des recommandations précises pour la préparation des étalons secondaires et d’échantillons de contrôle certifiés. Les résultats doivent être exprimés en molarité (mmol/L).
Tout le système doit être thermostaté à + 37 °C, d’autres caractéristiques étant en outre spécifiées : sensibilité, temps de réponse, stabilité, performances du voltmètre, etc.
La nécessité d’opérer sur des prélèvements strictement anaérobies, principalement avec des analyseurs type gaz du sang, le caractère d’urgences technique et clinique expliquent la faible popularité de ce dosage et le recours fréquent à des approximations calculées. D’ores et déjà, la campagne 01GAZ1 traduit une qualité encourageante avec des coefficients de variation tout appareil de 3,76 à 4,20 % et qui devraient s’améliorer dans le futur avec la mise en application du consensus international.

Le parc actuel des analyseurs disponibles en France

Dès 1988 le parc des appareils disponibles présentait des caractéristiques très satisfaisantes selon une étude interlaboratoire de la Société française de biologie clinique [44].
Actuellement la plupart sont d’abord des analyseurs de gazométrie qui proposent en outre, la co-oxymétrie, les électrolytes, les lactates voire le glucose et d’autres substrats. Un certain nombre ont récemment fait l’objet d’une description exhaustive [45]. Parmi les appareils permettant la mesure du calcium ionisé, seuls deux systèmes sont dédiés essentiellement aux ISE : version Mercury 8^® (Société Nova Biomedical) et Konelab 30 I^® et 60 I^® (Société Thermo Clinical Labsystems Kone). Sur ces analyseurs, il est possible de corriger la valeur du calcium mesuré en la ramenant à pH 7,40 afin de pallier au non-respect des conditions d’anaérobiose. Mais le biologiste doit garder à l’esprit que l’algorithme peut être inadapté aux malades présentant des troubles acido-basiques aigus, respiratoires (pente de – 0,17) ou métaboliques (pente de – 0,39) [3]. De plus, quand le pH diffère chroniquement de 7,40, c’est bien le Ca ionisé mesuré qui est signifiant et non le Ca ionisé corrigé, et il convient donc de communiquer systématiquement les deux types de résultats au clinicien [1].
Les modules de mesure des électrolytes et du Ca⁺⁺  par électrodes sélectives (ISE), isolés ou intégrés au sein d’un analyseur multiparamétrique, sont plus rares. Quant aux appareils uniquement dédiés au calcium ionisé, ils ne sont plus commercialisés.

Conclusion

La mesure du calcium ionisé plasmatique reste le paramètre de choix pour le diagnostic d’une hypocalcémie ou d’une hypercalcémie. Cependant, pour des raisons techniques et économiques, la détermination de la calcémie totale reste l’examen le plus souvent prescrit pour diagnostiquer un trouble de l’équilibre calcique. Le résultat du dosage du calcium total est lié à de nombreux paramètres (ions divalents, pH, albuminémie, protéinémie) expliquant les écarts fréquents retrouvés entre calcium total et calcium ionisé. En l’absence d’anomalies des protéines sanguines et du pH extracellulaire, une variation de la concentration en calcium ionisé peut être détectée de manière fiable par le dosage de la calcémie totale.
Les formules d’estimation du calcium ionisé ou de correction de la calcémie totale ne résolvent qu’en partie ce problème et parfois ne peuvent dispenser du dosage de la fraction ionisée. Certaines circonstances, au cours desquelles il peut exister une discordance entre calcémie totale et calcémie ionisée, devraient justifier de la mesure du calcium ionisé :
– modification de l’équilibre acido-basique (insuffisance rénale, hyperventilation…) ;
– modification de l’albuminémie (brûlés, syndrome néphrotique, malabsorption, affections malignes…) ;
– modification de la concentration sérique des globulines (myélomes) ;
– modification de la concentration sériques des bicarbonates, des lactates, des citrates, d’acétate (transfusions de sang citraté massives ou répétées…).

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