Les ARN défectifs interférents chez les coronavirus

La propagation des virus à ARN s'accompagne fréquemment de celle d'objets pseudoviraux tels que ARN satellites, virus satellites, virus défectifs et, enfin, ARN chimériques. Les virus et ARN satellites requièrent la présence d'un virus auxiliaire fonctionnel pour leur infectiosité, ce en dépit d'une faible analogie de séquence avec l'ARN génomique viral. À l'inverse, les ARN défectifs interférents (DI) sont dérivés du génome du virus sauvage, mais leur propagation reste strictement dépendante de celle du génome parental. Les ARN DI se singularisent par leur capacité à interférer négativement avec la réplication du virus parental. Il existe néanmoins des éléments défectifs pour lesquels aucune activité interférante ne s'observe, et ils sont alors désignés par ARN D. Les virus défectifs sont également dérivés du virus sauvage, et ne nécessitent la présence de ce dernier que dans certaines conditions. Les ARN chimériques, quant à eux, sont des molécules recombinantes qui associent des séquences issues du virus sauvage mais aussi d'autres sources.

Nous proposons dans cette revue de nous focaliser sur les ARN DI des coronavirus, dont l'intérêt en vue d'une meilleure connaissance a été souligné par les travaux effectués depuis une vingtaine d'années. Auparavant, quelques notions relatives à leur organisation génomique ainsi qu'à leur mode de réplication seront présentées. Elles sont nécessaires afin d'intégrer les différents aspects des ARN DI au sein de leurs mécanismes réplicatifs et transcriptionnels, lesquels sont complexes et étroitement liés avec ceux de phénomènes de recombinaison, particulièrement importants chez ces virus.

Organisation génomique et transcription

La famille des Coronaviridae représente un groupe de virus enveloppés avec un génome constitué par un ARN monocaténaire de polarité positive. Elle comprend deux genres, les Coronavirus et les Torovirus. Récemment, les Coronaviridae et les Arteriviridae ont été regroupés dans un nouvel ordre appelé Nidovirales. À ce jour, 14 coronavirus ont été répertoriés, 12 ayant fait l'objet d'études plus approfondies (tableau 1). Ce sont des agents pathogènes spécifiques des vertébrés, capables d'infecter plusieurs espèces de mammifères et d'oiseaux avec des spécificités d'hôte et de tissu assez marquées [1]. Transmis par voie oro-fécale ou aérienne, ils engendrent préférentiellement des désordres digestifs ou respiratoires.

Structure et transcription du génome

Les coronavirus possèdent un génome d'une taille inhabituelle (27-32 kb), en fait le plus grand génome ARN connu à ce jour. L'organisation génomique ainsi que l'ordre séquentiel de la plupart des cadres ouverts de lecture (ORF) sont conservés (figure 1, A). Cet ARN de polarité positive, coiffé en 5' et polyadénylé en 3', est infectieux, c'est-à-dire qu'après transfection dans des cellules sensibles il peut initier un cycle viral, lequel se déroule entièrement dans le cytoplasme. Le génome dirige à la fois les processus réplicatifs et ceux correspondant à la synthèse des ARN messagers (ARNm). À l'extrémité 5' des ARN génomiques et sous-génomiques se trouve une séquence de tête d'une centaine de bases appelée leader. Les deux premiers tiers du génome correspondent au locus polymérase (20 kb), le reste codant pour les protéines de structure et un certain nombre de gènes dont les fonctions restent indéterminées.

La figure 1, B illustre les étapes simplifiées du cycle réplicatif chez les coronavirus. Comme pour tout virus à ARN de polarité positive, la première étape, après synthèse de novo d'un complexe polymérase fonctionnel (traduction du locus polymérase et maturation post-traductionnelle), consiste en la synthèse d'ARN négatif. Ce dernier sera ensuite utilisé comme matrice pour la synthèse des ARN positifs génomiques et pour celle des ARN positifs sous-génomiques à partir desquels seront traduites les protéines de structure. De nouveaux virions peuvent alors être assemblés.

La transcription discontinue des messagers

Un des aspects marquants de la transcription chez les coronavirus est la production d'une série d'ARNm sous-génomiques formant un ensemble de type « emboîté » (figure 2), particularité dont l'ordre des Nidovirales tire son nom. Les ARNm sont en effet coterminaux en 3', et ils ont aussi en commun la séquence de tête leader en 5'. Cette dernière séquence, dérivée de l'extrémité 5' du génome viral, est fusionnée au corps des ARNm selon un mode particulier de transcription, dit « discontinu ». Les ARNm sont donc constitués par la fusion de deux régions non contiguës du génome. La connexion entre ces deux segments met en jeu une séquence consensuelle que l'on retrouve sur le génome à la fois dans la partie 3' du leader et en 5'-proximal de chaque unité transcriptionnelle. Le corollaire d'une telle structure est que le leader est complémentaire, au niveau de ce même consensus, de l'ARN sous-génomique négatif. Par ailleurs, chaque ARNm contient en totalité les ARNm de taille inférieure, et seule la région 5' ne chevauchant pas l'ARNm de taille immédiatement inférieure est traduite. Les ARNm sont donc de structure polycistronique, mais fonctionnent pour la plupart comme des ARNm monocistroniques. Deux modèles majeurs, chacun s'appuyant sur des observations expérimentales effectuées en majorité sur des DI, sont actuellement proposés pour tenter d'expliquer le mode opératoire de la transcription discontinue des coronavirus.

* Acquisition du leader lors de la synthèse d'ARN positif (figure 2, B). Ici, le leader jouerait en quelque sorte un rôle d'amorce, permettant la synthèse d'une molécule d'ARN sous-génomique à partir de la matrice antigénomique [2, 3]. Dans un tel contexte, des molécules de leader seraient générées en excès, via un mode de fonctionnement non processif de la polymérase virale. Les séquences leader « libres » seraient ensuite transloquées ­ vraisemblablement au sein d'un complexe ribonucléo-polymérasique ­ vers la partie complémentaire des sites consensus présents sur la matrice négative. Un appariement base à base complémentaire, seul mécanisme postulé initialement, est très probablement renforcé par des interactions protéine-ARN, faisant également intervenir des protéines cellulaires [4].

* Acquisition du leader lors de la synthèse d'ARN négatif (Figure 2, C). Ce modèle, qui repose en grande partie sur la mise en évidence, dans les cellules infectées, d'ARN sous-génomiques négatifs doté d'un anti-leader [5], propose que ces derniers servent de matrices pour la synthèse des ARNm. Les séquences consensus intergéniques fonctionneraient alors, non comme des promoteurs internes, mais comme des atténuateurs transcriptionnels de la polymérase lors de la synthèse d'ARN négatif. La polymérase viendrait ensuite copier un leader en cis à l'extrémité 5' du génome ou en trans sur un autre ARN sous-génomique. Les différents ARN sous-génomiques négatifs ainsi produits serviraient à leur tour de matrice pour la synthèse des ARNm.

Les ARN défectifs interférents

La figure 3 illustre l'ensemble des molécules d'ARN défectives naturelles décrites à ce jour chez les coronavirus. On peut remarquer que ces DI sont issus de 4 des 14 espèces de coronavirus connus, mais qui sont représentatifs des 3 sous-groupes génétiques (tableau 1). D'autre part, la taille de ces DI s'échelonne entre 2,2 et 25 kb, soit pour certains une taille assez proche de celle du génome viral complet.

Recombinaison et origine des DI

Les ARN DI naturels sont générés spontanément à la suite d'événements de recombinaison au cours de la réplication virale. En l'absence d'évidence d'un quelconque processus d'épissage chez les coronavirus, le mécanisme fondamental adopté dans cette revue sera celui qui fait intervenir un saut en cis ou en trans de la polymérase en cours de synthèse, à partir d'une matrice donneuse vers une matrice acceptrice de même polarité (copy-choice) [6]. Dans le cas des coronavirus, on ignore si cette recombinaison intervient ou non préférentiellement pendant la synthèse d'ARN négatif. Par ailleurs, les données de séquence disponibles ne faisant pas apparaître d'homologies à proximité des régions de jonction, il est admis que les DI des coronavirus seraient en majorité les produits d'une recombinaison de type illégitime.

Caractéristiques structurales et fonctionnelles des DI

Les règles de base auxquelles obéit l'organisation des DI naturels laisse place à une grande diversité. Premièrement, les DI doivent posséder deux segments identiques aux extrémités 5' et 3' du génome parental, dont la taille varie plus ou moins selon les virus. Ces extrémités incluent les régions minimales en cis promotrices de la synthèse d'ARN positif ou négatif, indispensables à une réplication efficace des DI. Deuxièmement, les DI présentent des réarrangements internes, issus de délétions d'importance variable, aboutissant à une mosaïque linéaire de segments discontinus par rapport à l'ARN génomique. Ces réarrangements pourraient conférer de nouvelles propriétés aux DI. Troisièmement, des signaux tels que ceux dirigeant l'encapsidation doivent être préservés chez les DI aptes à se propager lors de passages en série en culture cellulaire. L'aptitude à interférer efficacement ou non avec le virus parental n'est pas prévisible sur la base de ces seuls éléments structuraux.

Les DI naturels ont été décrits chez les coronavirus murin (MHV) [7, 8], bovin (BCV) [9], aviaire (IBV) [10] et, enfin, chez le coronavirus porcin (TGEV) [11]. Une particularité remarquable des DI coronavirus de grande taille, hormis leur « gigantisme » (DissA, 25 kb chez le MHV-JHM ; DI-A, 22 kb chez le TGEV), tient à leur aptitude potentielle à se répliquer de façon autonome [11, 12], contrairement aux DI de taille plus restreinte. Ces « maxi-DI » ont en effet été décrits comme possédant toute la région du locus polymérase, tandis qu'ils seraient délétés de la quasi-totalité de la partie 3' du génome. Ils sont donc virtuellement indépendants du virus parental, en tout cas au plan réplicatif et/ou transcriptionnel, à défaut de celui de l'assemblage, qui reste tributaire du génome parental pour l'apport des protéines de structures, codées par la région 3'. Toutefois, en l'absence d'une telle molécule synthétique, susceptible d'être transfectée hors de tout contexte viral, l'autonomie de réplication de ces maxi-DI n'a pu encore être formellement démontrée.

* Les DI au sein de la machinerie transcriptionnelle

L'étude des DI de plus petite taille a largement contribué à l'exploration de nombreux aspects liés aux mécanismes réplicatifs et transcriptionnels des coronavirus. Cela n'est pas surprenant, compte tenu de la taille excessivement grande du génome des coronavirus et de l'absence d'un ADNc infectieux qui permette une approche de génétique inverse. De manipulation plus aisée, ces DI se sont révélés être les outils de choix pour l'étude de ces différents mécanismes, au demeurant fort complexes. Chez certains d'entre eux [13], mais pas chez d'autres [14, 15], la présence d'une grande phase ouverte de lecture, permettant une traduction en cis, apparaît conditionner une réplication et une propagation efficaces. Le rôle de ce cadre de lecture (dans lequel des segments discontinus, issus des réarrangements internes, se retrouvent en phase), est loin d'être clair. Dans le cas du DI de 2,2 kb du BCV, la présence d'un ORF codant pour la protéine N est nécessaire pour une réplication optimale de ce DI [13]. Le DI-91 de l'IBV supporte la délétion de son ORF sans grand préjudice, mais non sans effet sur son accumulation [15]. Dans le cas du MHV, plusieurs situations coexistent : le DI-a provenant de la souche A59 voit sa réplication chuter de manière drastique si l'ORF est trop délété [16], tandis que les ORF associés aux DI issus de la souche JHM peuvent être modifiées sans effet apparent [17, 18]. Ces observations suggèrent que des déterminants de nature bien distincte, la présence d'un grand cadre de lecture n'étant que l'un d'entre eux, sont susceptibles de contrôler la réplication des DI.

D'autre part, l'utilisation des DI a permis la mise en évidence de plusieurs facteurs cellulaires capables de se lier spécifiquement à diverses régions du génome des coronavirus. La plupart d'entre eux seraient impliqués dans les processus de transcription et/ou de réplication de l'ARN viral. Plusieurs régions hautement structurées, de type pseudo-nœud ou tige-boucle, identifiées sur l'ARN génomique interagiraient avec certains de ces facteurs cellulaires. Pour le MHV par exemple, trois types de facteurs cellulaires (p70, p48 et p35/38) seraient capables de reconnaître les séquences consensus intergéniques de l'ARN antigénomique, proposées comme site d'initiation de la transcription des ARNm [19]. Le facteur p35/38 serait aussi impliqué dans la liaison avec le leader. Ces protéines agiraient comme des facteurs de transcription capables de moduler l'expression des différents messagers. D'autres protéines cellulaires ont été décrites comme pouvant interagir sur des régions spécifiques de l'extrémité 3' non codante du MHV [20, 21]. La déstabilisation de ces structures en 3' affecte en effet à la fois les synthèses d'ARN négatif et positif pour ce DI muté. En outre, l'introduction d'une mutation en amont de cette structure 3' conduit à l'incapacité pour ce DI, par ailleurs efficacement répliqué, à se recombiner avec le virus parental. Il s'agirait donc là d'une interaction ARN-protéine intervenant à la fois dans la réplication virale et les phénomènes de recombinaison associés à l'extrémité 3'. Récemment, une nouvelle structure tige-boucle a été mise en évidence dans l'extrémité 3' du MHV [22]. Son originalité résiderait dans la capacité de contrôler, via une médiation physique entre les extrémités 5' et 3', la synthèse des ARN génomique et sous-génomique de polarité positive. La plupart de ces facteurs cellulaires ne correspondent pas à des entités connues, et leurs fonctions exactes, du point de vue tant cellulaire que du mode d'action sur la réplication virale, restent à élucider. La découverte de ces facteurs conduit à une vision plus juste de la part que peut prendre le contexte cellulaire dans la réplication et la transcription des coronavirus, et souligne la complexité potentielle de la régulation des événements réplicatifs, voire de recombinaison, par le jeu d'interactions multiples avec des facteurs protéiques.

* Interférence

Nombre de DI des coronavirus partagent avec ceux d'autres virus à ARN [23] l'aptitude à inhiber de manière compétitive la réplication du virus parental et la propension à s'accumuler en abondance numérique inverse à celle du génome. Cette dernière propriété serait fonction notamment de la taille des molécules interférentes : plus petit serait un DI par rapport au génome parental et plus grande serait sa tendance à s'accumuler. D'autre part, il est généralement admis que le mécanisme d'interférence le plus répandu consisterait en un détournement de la polymérase virale vers la réplication des petites molécules défectives, cette dernière finissant en quelque sorte par être « titrée » par les DI, devenus numériquement supérieurs. Toutefois, dans le cas des DI autoréplicatifs, c'est-à-dire codant pour leur propre polymérase virale, une interférence peut également s'observer, ce qui pose la question du mécanisme en cause.

La figure 4 illustre un tel phénomène, observé dans le cas du TGEV. Il s'agit d'un DI de haut poids moléculaire (22 kb), désigné DI-22, isolé dans notre laboratoire au cours de passages successifs à forte multiplicité d'infection sur des cellules porcines de la lignée ST. Sa taille et sa structure interne sont comparables à celles précédemment décrites pour le DI-A (figure 3). Le DI-22 possède lui aussi la région correspondant au locus polymérase et est délété de la majorité de la partie 3' avale. Il est donc potentiellement autonome pour sa réplication. Cependant, l'oscillation du titre infectieux au cours des passages, accompagnée d'une fluctuation en proportion inverse de l'ARN DI-22 et de l'ARN génomique, témoigne d'une forte activité interférente. Nous pensons que cette interférence repose en grande part sur une compétition pour l'encapsidation entre l'ARN du DI-22 et l'ARN génomique. À partir d'une quantité d'ARN génomique donnée pour un cycle viral sera produite une quantité finie des différents ARNm. L'émergence du DI-22 dans un tel contexte peut conduire à une concentration accrue de polymérase dans le cytoplasme, mais pas des protéines structurales pour lesquelles il est justement défectif. Or la production des particules virales infectieuses est tributaire du niveau d'expression des protéines de structure S, M et E [24]. Si les ARN du DI-22 et du virus parental sont encapsidés avec une efficacité comparable, la proportion de virions néosynthétisés ayant incorporé un ARN génomique complet va donc chuter. Le phénomène va s'amplifier au cours des passages, jusqu'au point où la quantité de protéines structurales, dépendante de l'ARN génomique, deviendra trop limitante pour assurer une encapsidation efficace du DI-22, pourtant majoritaire dans les cellules infectées (figure 4, P18). La balance stœchiométrique entre les deux espèces moléculaires va alors commencer à s'inverser, et l'ARN génomique pourra réapparaître tandis que celui du DI-22 chutera. Cette hypothèse n'exclut pas d'autres mécanismes, tels que le rôle de structures génomiques dotées d'un pouvoir interférent intrinsèque, mais non encore décrites chez les coronavirus.

Signification biologique et propagation des DI

Il est couramment admis que l'accumulation d'un DI, une fois apparu, est la résultante de deux facteurs antagonistes, exerçant simultanément une pression de sélection positive et négative : la compétitivité du DI à l'égard du virus parental et l'échappement de ce dernier à l'interférence créée. Ces phénomènes de compétitivité et d'échappement décident du maintien ou non d'une molécule défective dans un environnement donné. Une phase ouverte de lecture peut dans certains cas représenter un avantage sélectif (cf. supra), de même que l'aptitude à l'encapsidation et à la réplication. L'ensemble de ces mécanismes contribue à créer une dynamique évolutive de ces molécules au sein des cellules infectées, dont il convient d'évoquer les effets potentiels en termes de relation hôte-virus.

Les maxi-DI (type DIssA et DI-A), virtuellement indépendants du virus parental, pourraient jouer un rôle dans le phénomène d'infection persistante, que plusieurs coronavirus ont une propension à établir [27, 28]. La persistance du coronavirus murin dans le cerveau des souris, associée à la présence d'ARN viral mais sans production de virions infectieux [25], pourrait en être une illustration, de même que la synthèse persistante de protéines et d'ARN du MHV, déjà observée en culture cellulaire sans infectiosité décelable [26]. Par ailleurs, il est tentant de penser que les DI, de par l'acquisition de nouvelles propriétés, pourraient favoriser certaines pathologies. Un exemple particulièrement démonstratif d'une telle situation est offert par un pestivirus, le CSFV (classical swine fever virus), un virus généralement non cytopathogène en culture de cellule, et pour lequel il a été clairement établi que l'effet cytopathique parfois observé tenait à la présence de certains DI naturels [29].

On peut également s'interroger sur l'incidence que pourrait avoir la propagation de DI sur les interactions établies entre les coronavirus et leurs hôtes dans le contexte général de la notion de quasi-espèces, même si cette notion n'est pas formellement validée dans leur cas. Ce terme traduit l'existence d'une population virale hétérogène constituée par des séquences génomiques faiblement divergentes, reliées phylogénétiquement à un ascendant commun. À un environnement donné correspond une quasi-espèce constituée d'une espèce virale dominante stable associée à un ensemble hétérogène complexe d'espèces minoritaires [30, 31]. Il arrive qu'une sous-population virale minoritaire devienne à son tour dominante en fonction de changements subits par l'hôte, et réoriente la pathogénie [32]. Il serait intéressant d'examiner dans quelle mesure une telle dynamique moléculaire s'applique aux génomes défectifs, d'autant qu'il a été proposé, sur la base d'une modélisation mathématique appliquée à des données expérimentales relatives à des DI de différents virus, que leur comportement évolutif, non prévisible, répondait à la théorie du chaos [33]. Il n'est pas interdit de spéculer que de tels phénomènes pourraient participer à l'émergence de nouveaux pathogènes chez les coronavirus [34, 35].

Un mécanisme général de recombinaison ?

Les coronavirus se singularisent par un taux de recombinaisons intergénomiques particulièrement élevé au sein des virus à ARN. Dans le cas du MHV, on peut observer jusqu'à 25 % de génomes recombinants par cycle réplicatif lors d'une co-infection par deux variants. Il a d'ailleurs été proposé que ce mécanisme contribue au maintien de l'intégrité du génome, au sein duquel le taux de mutations ne semble pas différent de celui qui s'observe chez des virus ayant un génome d'une taille nettement plus faible. Les premières études réalisées sur des mutants thermosensibles ont permis de mettre en évidence l'existence de multiples crossing-overs, répartis de façon apparemment aléatoire sur l'ensemble du génome. D'autre part, il existerait un gradient de recombinaison de 5'-3', ce qui, compte tenu de la structure 3'-coterminale des ARNm, suggère l'intervention de ces derniers comme accepteurs de recombinaison [36].

Recombinaison entre l'ARN génomique et les DI

Le génome des coronavirus semble donc être le siège d'événements de recombinaison homologue à la fois légitimes et illégitimes. Il n'a pas été décrit à ce jour d'événement de recombinaison intergénomique illégitime. Cependant, les DI, issus d'une recombinaison illégitime, pourraient ultérieurement subir les deux types d'événements. Nous avons déjà mentionné qu'un DI pouvait se modifier au fil des passages, sa taille et sa structure évoluant vers des formes plus adaptées à un environnement donné, notamment à la faveur d'événements de recombinaison additionnels. Enfin, il existe des observations montrant que de l'ARN d'origine génomique pouvait être incorporé dans les ARN DI, et vice versa. Un « brassage » génétique entre molécules génomiques sous-génomiques, et DI eux-mêmes est donc possible.

Le mécanisme de formation des ARNm peut-il être aussi celui des DI ?

Un phénomène de recombinaison particulier, mis en évidence dans le cas du MHV, est l'échange de la séquence leader lors de la coréplication d'un ARN génomique et d'un ARN défectif [37]. Selon M. Lai, ce type de recombinaison serait très similaire à celui qui pourrait être mis en œuvre pour l'acquisition du leader lors de la synthèse des ARNm. Dans ce cas de figure, il s'agirait d'une recombinaison à très haute fréquence, d'un ordre de grandeur supérieur à celui de la recombinaison intergénomique, tous les ARN génomiques et messagers étant pourvus d'un leader. Elle reposerait sur le fait que la séquence consensus pourrait constituer un site spécifique de recombinaison (hot-spot). Ce point relatif à la recombinaison pendant les étapes de la transcription reste cependant controversé [38]. En effet, dans le cas du BCV, il n'a jamais pu être mis en évidence de leader libre intracytoplasmique ; de plus, si la séquence consensus du leader de l'extrémité 5' d'un DI est délétée, ce dernier reste néanmoins apte à recombiner de façon efficace au niveau du leader muté [9, 13]. Il semblerait donc que la seule complémentarité du leader ne puisse pas ici être incriminée de façon décisive.

Si les mécanismes de formation des DI étaient ceux mis à contribution lors d'un amorçage interne par du leader libre, on devrait s'attendre à une fréquence accrue de crossing-overs à proximité des régions consensus. Or, en examinant les structures des différents DI de la figure 3, on constate que sur 38 crossing-overs, seulement 4 se trouvent au voisinage des régions consensus intergéniques. Toutefois ces données ne tiennent pas compte d'éventuels remaniements subits au cours des passages, susceptibles de faire apparaître d'autres sites préférentiels de recombinaison que ceux mis en cause lors de leur formation. Il est donc possible qu'un tel processus participe à la genèse de génomes défectifs de type DI. Cela étant, un mécanisme général de recombinaison chez les coronavirus, à supposer qu'il existe, reste à établir. Comment la séquence accepteur de recombinaison peut-elle être sélectionnée par la polymérase ? S'il existe de tels sites préférentiels de recombinaison, au-delà du cas particulier du leader, quels sont leurs caractéristiques ? À cet égard, les nombreuses structures tige-boucle, récemment mises en évidence chez les coronavirus, seraient-elles capables de diriger la recombinaison, comme décrit chez les turnip crinkle [39] et tomato bush stunt virus [40] ? L'intervention de séquences riches en AU, incriminées dans le cas du bromovirus [41], est également envisageable.

Les DI comme outils de recombinaison ciblée

La première démonstration éclatante de l'intérêt de la recombinaison en vue d'une manipulation génétique des coronavirus fut apportée par le groupe de P. Masters, dont les expériences ont établi du même coup qu'un ARN non réplicatif pouvait être donneur de recombinaison. Le gène N (nucléocapside) du mutant Alb4 du MHV, dont le phénotype thermolabile est lié à une délétion de 87 nucléotides, a pu ainsi être « réparé » après transfection d'un transcrit synthétique correspondant à l'ARNm 7 du MHV sauvage dans des cellules infectées par ce mutant [42]. L'efficacité de ce transfert ciblé de gène peut être notablement améliorée si, à la place d'une molécule non réplicative, on utilise un DI réplicatif comme vecteur de gènes [43]. D'autres expériences ont permis l'obtention de recombinants chimériques entre les gènes N des BCV et MHV [44], preuve qu'une recombinaison interspécifique est possible. Il s'est alors posé la question de savoir si une telle stratégie serait applicable à des gènes éloignés de l'extrémité 3'. Or l'équipe de P. Masters est parvenue, via l'utilisation d'un DI comportant le tiers 3'-proximal d'un virus sauvage et du fameux mutant Alb4, sur lequel repose la sélection ­ indispensable ­ des virus recombinants, à substituer toute l'extrémité 3' du virus thermosensible jusqu'au niveau du gène S [45]. Cette approche, reprise par une autre équipe mais à l'aide cette fois d'un transcrit non réplicatif codant pour les 8 derniers kilobases du virus, a permis de montrer de façon élégante qu'un déterminant de l'hépatotropisme du MHV était bien associé au gène S (spicule) [46]. La validité de cette stratégie, dont le principe général est illustré dans la figure 5, est donc désormais fermement établie. En théorie, n'importe quelle séquence génétique exogène pourrait être insérée en des sites spécifiques, à condition de posséder les régions flanquantes appropriées. L'ensemble de ces travaux rend donc accessible une démarche de génétique inverse, alors même que l'obtention d'un ADNc infectieux chez les coronavirus se heurte à des obstacles insurmontés à ce jour. L'avenir dira si une telle stratégie est ou non transposable à d'autres coronavirus que le virus murin MHV.