Progéniteurs hématopoïétiques des lymphocytes T

ARTICLE

Les signaux, facteurs et gènes requis pour la différenciation et le développement des cellules souches hématopoïétiques en lymphocytes T ne sont pas complètement élucidés. Cela contraste avec l'abondance des données sur le développement, la différenciation et l'activation des cellules T dans le thymus ou en périphérie [1]. Pouvoir contrôler la production de cellules T à partir de progéniteurs hématopoïétiques serait un progrès d'importance pour les stratégies de thérapie génique ciblant le système immunitaire ou pour traiter plusieurs types de déficits immunitaires, par exemple ceux qu'entraîne une chimiothérapie à haute dose.

Chez l'homme, les lymphocytes, comme toutes les autres cellules hématopoïétiques, sont produits par la différenciation constante de cellules souches hématopoïétiques et de progéniteurs exprimant la molécule de surface CD34. Cela est attesté in vivo chez l'homme par le succès des transplantations autologues et allogéniques de cellules CD34⁺ [2]. Nous avons montré chez la souris que la transplantation, chez des receveurs létalement irradiés, de progéniteurs hématopoïétiques de moelle osseuse (MO) exprimant la molécule CD34 protège à court terme contre les conséquences de l'irradiation et reconstitue le système lympho-hématopoïétique à long terme. En particulier, les cellules CD34⁺ murines contiennent des progéniteurs préthymiques [3]. De ce fait, il est possible d'utiliser, chez la souris comme chez l'homme, un marqueur unique CD34 pour isoler la majorité des progéniteurs hématopoïétiques. À noter que, chez la souris, il existe une rare population de cellules souches hématopoïétiques CD34^- (fréquence de 0,005 % dans la moelle osseuse) qui est relativement dépourvue de progéniteurs clonogéniques in vitro et qui contribue à peu près à 50 % de l'activité de reconstitution hématopoïétique à long terme (Morel et al., manuscrit soumis et [4]). Chez l'homme, comme chez la souris, les cellules hématopoïétiques CD34⁺ sont hétérogènes, contenant des cellules ayant des phénotypes membranaires et des fonctions très divers. Parmi les cellules CD34⁺, se trouvent de véritables cellules souches hématopoïétiques ayant la possibilité de reconstituer le système hématopoïétique à long terme et douées d'une capacité de prolifération considérable (selon les estimations les plus optimistes, la proportion de cellules souches hématopoïétiques n'excède pas 0,05 % des cellules de moelle osseuse chez l'homme et la souris). La majorité des cellules CD34⁺ est constituée de progéniteurs moins primitifs. Ces sous-populations CD34⁺ peuvent être isolées par cytométrie en flux et leur activité caractérisée dans des tests de différenciation et de prolifération cellulaire.

Systèmes expérimentaux d'identification des progéniteurs des lymphocytes T

La mise au point de tests performants et reproductibles est essentielle pour identifier les progéniteurs des lymphocytes T dans les différents tissus hématopoïétiques.

Les progéniteurs T sont capables de se développer au sein du micro-environnement thymique qui est propice à leur différenciation et à leur croissance. Expérimentalement, ces conditions favorables sont recréées en induisant la colonisation de fragments de thymus (humain ou murin) par les progéniteurs T. Les fragments thymiques sont rendus permissifs à la colonisation par de nouveaux progéniteurs après déplétion des thymocytes endogènes, obtenue après traitement par la 2-déoxyguanosine ou après culture à basse température et irradiation, les progéniteurs étant introduits par micro-injection ou par contact direct. Alternativement, les thymus de souris SCID immunodéficientes peuvent être utilisés sans prétraitement car ils sont naturellement réceptifs à la colonisation par de nouveaux progéniteurs [5]. Les progéniteurs T humains peuvent se différencier dans des fragments de thymus foetal humain [6] ou dans des fragments de thymus de souris adultes ou foetaux [7, 8]. Les fragments thymiques ensemencés sont cultivés in vitro en culture organotypique [9], ou bien sont implantés sous la capsule rénale de souris immunodéficientes SCID, ce qui permet dans les deux cas de conserver la structure tridimensionnelle de l'organe [3, 10]. L'implantation dans les souris SCID, mise au point par Péault et al. [6], favorise un bon développement du thymus ectopique et une croissance généralement prolongée pendant 6semaines, voire 15 semaines ou plus. Utilisant cette approche (figure 1), nous avons détecté un potentiel de repopulation thymique dans les cellules CD34⁺ humaines adultes de moelle osseuse et de sang périphérique après que la mobilisation des progéniteurs ait été induite par un traitement par des cytokines et/ou chimiothérapique, ainsi que dans des suspensions de foie foetal, moelle osseuse foetale ou de sang de cordon [11-13]. De même chez la souris, l'implantation de fragments thymiques in vivo donne des résultats supérieurs à ceux obtenus après culture organotypique in vitro pour la détection des progéniteurs T. Les différences allogéniques permettent de distinguer les cellules T endogènes de celles nouvellement produites. L'utilisation de multiples fluorochromes permet une analyse simultanée en cytométrie de flux des thymocytes du donneur et/ou receveur avec divers marqueurs de différenciation T. Les thymus humains implantés dans les souris SCID contiennent une majorité (plus de 60-70 %) de thymocytes corticaux dérivés du donneur (CD1⁺ CD4⁺ CD8⁺) ainsi que des thymocytes plus différenciés (CD4⁺ CD8^- CD3⁺ ou CD4^- CD8⁺ CD3⁺). L'expression de CD3 et du récepteur T est variable sur les thymocytes, ces antigènes pouvant être soit très fortement exprimés soit indétectables. Ce profil est compatible avec les événements de sélection intrathymique que l'on observe dans un thymus normal. La culture ex vivo des thymocytes après reconstitution permet de mettre en évidence des sous-populations de cellules thymiques rares telles que les cellules T gd qui dérivent aussi des progéniteurs CD34⁺ [13].

Une méthode décrite pour étudier la différenciation in vitro de cellules CD34 en lymphocytes T consiste à cultiver les progéniteurs sur monocouche de cellules stromales thymiques foetales en présence de cytokines telles que le ligand de Flt3 (FL) et l'interleukine (IL)-12 [14, 15]. Dans ces cultures, les précurseurs CD34⁺ acquièrent les antigènes CD2, CD4, CD8 et réarrangent les gènes du récepteur T mais peu de cellules coexpriment CD4 et CD8 contrairement aux systèmes utilisant les fragments thymiques tridimensionnels. Parmi les attraits potentiels de ce système in vitro, il y a la possibilité de manipuler le processus de différenciation avec des réactifs biologiques divers, d'analyser les progéniteurs au niveau clonal, et de mesurer la fréquence des précurseurs T dans une population donnée.

Un processus de différenciation extrathymique peut être à l'origine de la production de lymphocytes T et il est possible que les précurseurs de la lignée extrathymique soient distincts de ceux de la lignée intrathymique. Chez la souris, des cellulesT intestinales sont d'origine extrathymique et expriment un phénotype membranaire particulier avec présence de l'homodimère CD8aa [16]. L'importance de la voie extrathymique pour la production de cellules T n'est pas encore clairement établie chez l'homme, ni dans les conditions physiologiques ni dans des conditions extrêmes telles qu'après chimiothérapie ou chez les sujets âgés. Chez la souris, l'expression d'un transgène codant pour l'oncostatine M exprimée sous le contrôle du promoteur de p56^lck permet d'augmenter la production extrathymique de cellules T chez les souris athymiques ainsi que l'accroissement de leur nombre dans les ganglions lymphatiques [17]. Ce système de différenciation extrathymique est un outil intéressant pour étudier la contribution des différents progéniteurs hématopoïétiques à cette voie alternative de production de cellulesT.

Activité fonctionnelle de sous-populations de cellules CD34⁺ humaines et murines

Les cellules CD34, malgré leur faible nombre, peuvent être subdivisées en sous-populations d'activité hématopoïétique variable. Des efforts considérables accomplis par de nombreux groupes ont abouti à la caractérisation des cellules souches hématopoïétiques chez l'homme et la souris, permettant de les isoler grâce à leur phénotype membranaire et d'étudier leurs propriétés biologiques [18-24].

Activité progéniteur T des cellules souches hématopoïétiques

Des populations enrichies en cellules souches hématopoïétiques humaines, comme les cellules de phénotype CD34⁺ Thy-1⁺ isolées à partir de suspensions de foie foetal ou de moelle osseuse foetale, de moelle osseuse adulte ou de sang périphérique après traitement par des cytokines [19, 21] sont capables de se différencier en cellules T après injection directe dans le thymus. Ceci est une preuve directe de la compétence du micro-environnement thymique pour la différenciation des cellules souches hématopoïétiques en cellules T et confirme le caractère multipotentiel des cellules souches hématopoïétiques.

Expression de CD45RA sur les progéniteurs T de la moelle osseuse humaine

L'analyse du potentiel hématopoïétique des cellules CD34⁺ de la moelle osseuse humaine indique que l'activité de repopulation thymique n'est pas toujours superposable à l'activité de reconstitution hématopoïétique à long terme et la capacité de différenciation en multiples lignées hématopoïétiques (tableau I). On trouve les progéniteurs T au sein de populations très appauvries en activité de cellules souches hématopoïétiques comme les cellules CD34⁺ Thy-1^-, CD34⁺ CD38⁺, CD34⁺ c-kit^hi ou CD34⁺ CD45RA⁺[19-24].

CD45RA représente l'isoforme de poids moléculaire élevé de CD45 et identifie très distinctement deux populations de cellules CD34⁺ dans la moelle osseuse humaine permettant leur séparation par cytométrie de flux [12]. Les cellules n'exprimant pas CD45RA contiennent les cellules CD34⁺ Thy-1⁺ ou CD34⁺ CD38^- qui sont enrichies en cellules souches hématopoïétiques. Au contraire, la sous-population de cellules CD34⁺CD45RA⁺ est très appauvrie en précurseurs érythroïdes clonogéniques, ne peut pas repeupler des fragments d'os humains implantés dans des souris SCID et ne donne pas naissance à des cultures in vitro à long terme [12, 24]. Malgré cela, les cellules CD34⁺ CD45RA⁺ sont capables de repopulation thymique et la fréquence des progéniteurs T y est plus grande que dans les populations CD34⁺ CD45RA^- [12]. Qualitativement, ces deux types de progéniteurs produisent des populations T comparables, avec une grande majorité de thymocytes corticaux, des cellules T exprimant le récepteur ab ou gd.

Expression de l'antigène CD45RA sur les précurseurs lymphoïdes dans la moelle osseuse de souris

Nous avons récemment montré que la molécule CD34 est exprimée sur les progéniteurs hématopoïétiques primitifs chez la souris [3]. Dans la moelle osseuse de souris, à peu près 25 % des cellules CD34⁺ co-expriment CD45RA (épitope14,8) avec une intensité variable. Le marqueur B220 (épitope RA3-6B2) reconnaît aussi une isoforme de poids moléculaire élevé de CD45 mais est distinct de CD45RA [25]. Les cellules CD34⁺ CD45RA⁺ dans la moelle osseuse de souris, de même que les cellules humaines de même phénotype, contiennent peu de progéniteurs clonogéniques érythroïdes et primitifs de type CFU-GEMM. Les cellules CD34⁺ CD45RA⁺ produisent très peu de colonies spléniques in vivo(tableau II), sont incapables de reconstituer la moelle à long terme et ne protègent pas les animaux contre une irradiation à des doses létales. Néanmoins, les cellules de moelle osseuse murine CD34⁺ CD45RA⁺ ont un potentiel lymphoïde. Lorsqu'elles sont cultivées en présence de cellules stromales murines Sys-1, elles produisent des cellules B exprimant B220 et l'IgM de surface in vitro et ce, plus rapidement que ne le font des cellules CD34⁺ CD45RA^- ([26] et Galy et Morel, manuscrit en préparation). Les cellules CD34⁺ CD45RA⁺ sont capables de se différencier en cellules T et reconstituent des lobes de thymus foetaux de souris SCID réimplantés ectopiquement in vivo [3]. Comme le montre la figure 2, les cellules CD34⁺ CD45RA⁺ et CD34⁺ CD45RA^- contiennent toutes deux des progéniteurs T.

Ainsi, les cellules de moelle osseuse humaine et murine qui co-expriment les antigènes CD34 et CD45RA représentent des progéniteurs hématopoïétiques lymphomyéloïdes distincts des cellules souches hématopoïétiques et plus matures. Ces résultats confirment que chez la souris et chez l'homme, l'activité de repopulation thymique ne se superpose pas toujours à l'activité de reconstitution hématopoïétique à long terme. D'autre part, il est possible de distinguer par leur phénotype les progéniteurs érythroïdes (CD45RA^-) et ceux des lignées lymphoïdes et myéloïdes, permettant une définition phénotypique précise du processus de différenciation hématopoïétique.

Identification de progéniteurs de moelle osseuse humaine dont le potentiel de différenciation est restreint aux lignées lymphoïdes et dendritiques

Dans la moelle osseuse humaine, existe une sous-population de cellules CD34⁺ CD45RA⁺ qui exprime CD10 mais est Lin^-, c'est-à-dire est dépourvue des antigènes spécifiques de lignée (« Lin ») incluant CD19, CD2, CD14, CD15, CD56 et glycophorine A. Ces cellules CD34⁺ Lin^- CD10⁺ représentent à peu près 5 % des cellules CD34⁺ Lin^- dans la moelle osseuse adulte. Cette petite population est fonctionnellement et phénotypiquement distincte des cellules souches hématopoïétiques car elle n'exprime ni Thy-1 ni c-kit, elle exprime CD38 et CD45RA, ne peut pas repeupler des fragments d'os humain implantés chez les souris SCID et ne contient pas d'activité clonogénique myéloïde ou érythroïde in vitro [27]. En revanche, les cellules CD34⁺ Lin^- CD10⁺ contiennent des progéniteurs T. Des nombres de cellules très faibles (moins de 500 cellules) CD34⁺ Lin^- CD10⁺ peuvent repeupler un fragment thymique pendant 8 semaines avec production d'un grand nombre de thymocytes corticaux exprimant CD1a, CD4 et CD8. Par contre, au-delà de 11semaines, ces thymocytes se sont différenciés, comme en témoigne la perte de CD1 et la forte densité de l'antigène CD3. Cette cinétique suggère que la reconstitution à partir de progéniteurs T CD34⁺ Lin^- CD10⁺ est limitée et que le potentiel prolifératif de ces progéniteurs est inférieur à celui d'autres populations CD34⁺.

La culture en présence d'IL-2 révèle que la population CD34⁺ Lin^- CD10⁺ contient des progéniteurs pour les cellules natural killer (NK). La fréquence de précurseurs NK est plus élevée dans la population CD34⁺ Lin^- CD10⁺ que dans le reste des CD34⁺ [27]. La culture sur la lignée stromale murine Sys-1 en présence des cytokines IL-3, IL-6 et LIF montre que la population CD34⁺ Lin^- CD10⁺ contient des progéniteurs B. La différenciation en cellules B exprimant CD10 ou CD19 s'accompagne de la perte d'expression de CD34 en culture. La production de cellules B est obtenue plus rapidement à partir de cellules CD34⁺ CD10⁺ qu'à partir des cellules CD34⁺ CD10^-(figure 3). Quelles sont les relations entre les différents progéniteurs ? Nous avons montré que les cellules CD34⁺ CD45RA^- peuvent se différencier in vitro et acquièrent le phénotype CD34⁺ CD45RA⁺ et en conséquence une activité de repopulation thymique [12]. La figure 3 illustre la production in vitro de cellules CD34⁺ CD10⁺ à partir de cellules CD34⁺ CD45RA⁺ CD10^- (voir encadré). Nous en déduisons que dans la hiérarchie hématopoïétique, le degré d'immaturité du progéniteur est inversement corrélé au temps nécessaire à la production des cellules lymphoïdes suivant la séquence: CD34⁺ CD45RA^- > CD34⁺ CD45RA⁺ CD10^- > CD34⁺ CD45RA⁺ CD10⁺. Il est important de remarquer que la population CD34⁺ CD45RA^- qui contient les cellules souches hématopoïétiques [12, 24] ne produit pas de cellules B in vitro à court terme, mais est capable de produire des cellules B in vitro à long terme, après 5 semaines de culture ou in vivo après injection dans des fragments d'os implantés chez la souris SCID [12]. Cette réponse tardive est compatible avec la présence de cellules très primitives dans cette population.

Bien que les cellules CD34⁺ Lin^- CD10⁺ soient incapables de donner naissance à des colonies myéloïdes in vitro en culture semi-solide, elles peuvent produire des cellules dendritiques exprimant les antigènes CD33, CD1a, CD86, CD40, CD80 et HLA-DR [27]. Les cultures effectuées à dilution limite et en présence de cellules stromales et de cytokines permettent d'identifier, parmi les cellules CD34⁺ Lin^- CD10⁺, des clones de progéniteurs communs aux cellules B, NK et dendritiques. Le potentiel T n'a pas été testé dans ces systèmes à l'échelon pauci-cellulaire.

Ces résultats indiquent que les cellules de moelle osseuse co-exprimant les antigènes CD34 et CD10 mais dépourvus des marqueurs « Lin » de cellules différenciées, représentent un progéniteur commun et restreint aux trois lignées de lymphocytes et aux cellules dendritiques. Ce progéniteur identifié dans la moelle osseuse adulte est également présent dans la moelle osseuse foetale mais est pratiquement absent du sang périphérique après «mobilisation » par cytokines et chimiothérapie. Ces observations suggèrent des relations étroites entre les lignées des cellules dendritiques et des lymphocytes, les cellules dendritiques étant plus proches des lymphocytes que des monocytes. En effet, il est possible d'observer des précurseurs dendritiques distincts de ceux des monocytes/macrophages [28]. La filiation étroite entre lymphocytes et cellules dendritiques est confirmée par la caractérisation de précurseurs communs pour les cellules T, B et dendritiques dans le thymus de souris [29]. Il reste à démontrer si les cellules dendritiques lymphoïdes ont des activités biologiques distinctes d'autres cellules dendritiques.

Nos résultats vont dans le sens de ceux de Gore et al. [30] suggérant que les cellules CD34⁺ Lin^- CD10⁺ sont des «cellules souches» lymphoïdes. En effet, nous montrons que ces cellules ont la capacité de se différencier en cellules T, B, NK et dendritiques. Par contre, ces cellules n'ont pas de potentiel de prolifération élevé, le terme de progéniteur lymphoïde/dendritique est donc peut-être plus approprié que celui de « cellule souche ».

Quelle est la nature des pro-thymocytes ?

Le débat sur la nature des progéniteurs qui colonisent le thymus de façon physiologique reste ouvert. Des progéniteurs de phénotype très primitif ont été identifiés dans le thymus foetal suggérant que des cellules souches hématopoïétiques peuvent peut-être s'introduire physiologiquement dans le thymus foetal humain pour produire des cellules T [31]. Néanmoins, il y a peu d'activité cellules souches hématopoïétiques dans le thymus. Nos résultats ainsi que ceux obtenus par Spangrude et al. chez la souris [32] ont montré que des progéniteurs distincts des cellules souches hématopoïétiques peuvent repeupler le thymus et notre hypothèse est que des progéniteurs partiellement différenciés, tels que les cellules CD34⁺ CD10⁺, peuvent émigrer hors de la moelle osseuse pour coloniser le thymus. En effet les thymocytes immatures chez l'homme et la souris peuvent aussi se différencier en cellules B, NK et dendritiques [29, 33-36]. Dans le thymus foetal humain, les thymocytes immatures expriment CD34, CD45RA, peu ou pas CD38; Thy-1 n'est pas exprimé de même que les marqueurs associés aux cellules T tels que CD2 ou CD5. Ce phénotype correspond à celui des cellules CD34⁺ Lin^- CD10⁺ de moelle osseuse [27]. En ce qui concerne la moelle osseuse, puisque l'on trouve des progéniteurs T à potentiel hématopoïétique restreint distincts des cellules souches hématopoïétiques, nous supposons que le processus de différenciation lymphoïde commence avant l'entrée dans le thymus. En faveur de cette hypothèse, des travaux récents montrent que l'on peut identifier dans le sang périphérique des progéniteurs ayant un récepteur pré-T [37, 38]. Les progéniteurs T poursuivant la voie de différenciation intrathymique ne se différencient de façon définitive probablement qu'après leur entrée dans le thymus et cet événement est peut-être marqué par l'acquisition du marqueur CD5 [33]. L'analyse complète du potentiel de différenciation de la population CD34⁺ Lin^- CD10⁺ nous conduit donc à spéculer que ces cellules pourraient représenter des pro-thymocytes qui dans des conditions physiologiques émigrent hors de la moelle osseuse et colonisent le thymus. Bien que ces cellules ne soient pas présentes dans le sang périphérique mobilisé par cytokines et chimiothérapie, il est possible de les identifier dans le sang périphérique normal, ce qui confirme qu'elles circulent hors de la moelle osseuse à l'état physiologique [39].

CONCLUSION

Nous avons caractérisé chez l'homme et la souris des sous-populations de progéniteurs T, distincts des cellules souches hématopoïétiques, qu'il est possible d'isoler grâce à leur phénotype membranaire. Nous suggérons que, dans la moelle osseuse, une des étapes précoces de la différenciation des cellules souches hématopoïétiques en lymphocytes T soit marquée par l'expression des antigènes CD45RA et CD10, stade qui s'accompagne aussi de la perte graduelle du potentiel totipotent. Le schéma hypothétique proposé sur la figure 4 illustre, chez l'homme, les différentes étapes de la production de cellules T à partir de cellules souches hématopoïétiques. L'existence de progéniteurs intermédiaires entre cellules souches hématopoïétiques et cellules T suggère qu'une certaine prédifférenciation lymphoïde prend place avant la colonisation du thymus. Cette hypothèse ouvre la voie à l'étude des gènes et facteurs impliqués dans le processus de différenciation lymphoïde. Parmi les candidats, citons l'IL-7 qui est une cytokine d'importance pour la production, la survie et la croissance des cellules T et B [8] et Ikaros, un facteur transcriptionnel impliqué dans la régulation des promoteurs pour de nombreux gènes des cellules T. Ikaros est essentiel à la production de toutes les lignées lymphoïdes chez la souris [40] et est exprimé dans les cellules humaines CD34⁺ de moelle osseuse, particulièrement les cellules CD34⁺ Lin^- CD10⁺ (Galy, manuscrit en préparation). Grâce à ces informations, nous espérons comprendre les mécanismes mis en jeu dans la production de cellules T. Cela permettra de développer de nouvelles stratégies immunothérapiques, particulièrement dans le contexte des transplantations de cellules souches hématopoïétiques et d'une approche de thérapie génique capable de modifier durablement les lymphocytes T et autres cellules du système immunitaire. La cartographie des étapes de différenciation des cellules souches hématopoïétiques et la compréhension de la filiation des cellules lymphoïdes et dendritiques par rapport aux cellules myéloïdes ont des implications importantes pour comprendre la structuration du système immunitaire et les mécanismes responsables des pathologies leucémiques.

Remerciements

Les auteurs voudraient remercier Ben Chen et Steve Szilvassy pour avoir soutenu ce projet et Marilyn Travis et Dazhi Cen pour leur expertise technique. Nos remerciements à Laure Coulombel pour son aide éditoriale.

REFERENCES

1. Pfeffer K, Mak T. Lymphocyte ontogeny and activation in gene targeted mutant mice. Ann Rev Immunol 1994 ; 12 : 367-411.

2. Bensinger WI, Clift RA, Anasetti C, Appelbaum FA, Demirer T, Rowley S, Sandmaier BM, Torok-Storb B, Storb R, Buckner CD. Transplantation of allogeneic peripheral blood stem cells mobilized by recombinant human granulocyte colony stimulating factor. Stem Cells 1996; 14 : 90-105.

3. Morel F, Szilvassy SJ, Travis M, Chen B, Galy A. Primitive hematopoietic cells in murine bone marrow express the CD34 antigen. Blood 1996 ; 88 : 3774-84.

4. Osawa M, Hanad K, Hamada H, Nakauchi H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science 1996 ; 273 : 242-5.

5. Fisher A, Larsson L, Goff LK, Restall DE, Happerfield L, Merkenschlager M. Human thymocyte development in mouse organ cultures. Inter Immunol 1990 ; 2 : 571-8.

6. Peault B, Weissman IL, Baum C, McCune JM, Tsukamoto AS. Lymphoid reconstitution of the human fetal thymus in SCID mice with CD34⁺ precursor cells. J Exp Med 1991 ; 174: 1283-6.

7. Yeoman H, Gress RE, Bare CV, Leary AG, Boyse EA, Bard J, Shultz LD, Harris DT, DeLucaD. Human bone marrow and umbilical cord blood cells generate CD4⁺ and CD8⁺ single positive T cells in murine fetal thymus organ culture. Proc Natl Acad Sci USA 1990 ; 90 : 10778-82.

8. Plum J, de Smedt M, Leclercq G, VerhasseltB, Vandekerckhove B. Interleukin7 is a critical growth factor in early human T cell development. Blood 1996 ; 88 : 4239-45.

9. Galy A, Verma S, Bárcena A, Spits H. Precursors of CD3⁺CD4⁺CD8⁺ cells in the human thymus are defined by expression of CD34. Delineation of early events in human thymic development. J Exp Med 1993 ; 178 : 391-401.

10. Galy AHM, Chen BP. Detection of human hematopoietic stem cells in SCID-hu mice. In : Roncarolo MG, Péault B, Namikawa R, eds. Human hematopoiesis in SCID mice, Landes Company, 1995 : 15-34.

11. DiGiusto D, Chen S, Combs J, Webb S, Namikawa R, Tsukamoto A, Chen BP, Galy AHM. Human fetal bone marrow early progenitors for T, B and myeloid cells are found exclusively in the population expressing high levels of CD34. Blood 1994; 84 : 421-32.

12. Galy AHM, Cen D, Travis M, Chen S, Chen BP. Delineation of T-progenitor cell activity within the CD34⁺ compartment of adult bone marrow. Blood 1995 ; 85 : 2770-8.

13. Galy AHM, Webb S, Cen D, Murray LJ, Condino J, Negrin RS, Chen BP. Generation of T cells from cytokine-mobilized peripheral blood and adult bone marrow CD34⁺ cells. Blood 1994 ; 84 : 104-10.

14. Freedman AR, Zhu H, Levine JD, Kalams SDTS. Generation of human T lymphocytes from bone marrow CD34⁺ cells in vitro. Nature Medicine 1996 ; 2 : 46-51.

15. RosenzweigM, MarksDF, ZhuHDH, Mansfield KG, Sehgal PK, Kalams SDTS, Johnson RP. In vitro T lymphopoiesis of human and rhesus CD34⁺ progenitor cells. Blood 1996 ; 87 : 4040-8.

16. Rocha B, Guy-Grand D, Vassali P. Extrathymic T cell differentiation. Currrent Opinion in Immunology 1995; 7 : 235-42.

17. Clegg CH, Rulffes JT, Wallace PM, Haugen HS. Regulation of an extrathymic T-cell development pathway by oncostatin M. Nature 1996 ; 384 : 261-3.

18. Spangrude GJ. Biological and clinical aspects of hematopoietic stem cells. Ann Rev Med 1994 ; 45 : 93-104.

19. Baum CM, Weissman IL, Tsukamoto AS, Buckle AM, Peault B. Isolation of a candidate human hematopoietic stem cell population. Proc Natl Acad Sci USA 1992 ; 89 : 2804-8.

20. Craig W, Kay R, Cutler RL, Lansdorp PM. Expression of Thy-1 on human hematopoietic progenitor cells. J Exp Med 1993 ; 177 : 1331-42.

21. Murray L, Chen B, Galy A, Chen S, Tushinski R, Uchida N, Negrin R, Tricot G, Jagannath S, Vesole D, Barlogie B, Hoffman R, Tsukamoto A. Enrichment of human hematopoietic stem cell activity in the CD34⁺ Thy-1⁺ Lin^- subpopulation from mobilized peripheral blood. Blood 1995; 85 : 368-78.

22. Huang S, Terstappen LW. Lymphoid and myeloid differentiation of single human CD34⁺, HLA-DR⁺, CD38^- hematopoietic stem cells. Blood 1994 ; 83 : 1515-26.

23. Gunji Y, Nakamura M, Osawa H, Nagayoshi K, Nakauchi H, Miura Y, Yanagisawa M, Suda T. Human primitive hematopoietic progenitor cells are more enriched in KITlow cells than in KIThigh cells. Blood 1993; 82 : 3283-9.

24. Craig W, Poppema SMTL, Dragowska W, Lansdorp PM. CD45 isoform expression on human haemopoietic cells at different stages of development. Br J Haematol 1994 ; 88 : 24-30.

25. Johnson P, Greenbaum L, Bottomly K, Trowbridge IS. Identification of the alternatively spliced exons of murine CD45 (T200) required for reactivity with B220 and other T200-restricted antibodies. J Exp Med 1989 ; 169 : 1179-84.

26. Galy A, Morel F, Hill B, Chen BP. Hematopoietic progenitor cells of lymphocytes and dendritic cells. J Immunotherapy 1997 (in press).

27. Galy A, Travis M, Cen DPCB. Human T, B, natural killer and dendritic cells arise from a common bone marrow progenitor cell subset. Immunity 1995 ; 3 : 459-73.

28. Young JW, Szabolcs P, Moore MAS. Identification of dendritic cell colony-forming units among normal human CD34⁺ bone marrow progenitors that are expanded by c-kit-ligand and yield pure dendritic cell colonies in the presence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and tumor necrosis factor a. J Exp Med 1995; 182 : 1111-20.

29. Ardavin C, Wu L, Li CL, Shortman K. Thymic dendritic cells and T cells develop simultaneously in the thymus from a common precursor population. Nature 1993 ; 362 : 761-3.

30. Gore SD, Kastan MB, Civin CI. Normal human bone marrow precursors that express terminal deoxynucleotidyl transferase include T-cell precursors and possible lymphoid stem cells. Blood 1991 ; 77 : 1681-90.

31. Barcena A, Galy AHM, Punnonen J, Muench MO, Schols D, Roncarolo MG, de Vries J,Spits H. Lymphoid and myeloid differentiation of fetal liver CD34⁺ lineage-cells in human thymic organ culture. J Exp Med 1994 ; 180 : 123-32.

32. Spangrude GJ, Muller-Sieburg CE, Heinfeld S, Weissman IL, Two rare populations of mouse Thy-1lo bone marrow cells repopulate the thymus. J Exp Med 1988 ; 167 : 1671-83.

33. Sanchez MJ, Muench MO, RoncaroloMG, Lanier LL, Phillips JH. Identification of a common T/natural killer cell progenitor in human fetal thymus. J Exp Med 1994 ; 180 : 569-76.

34. Marquez C, Trigueros C, Fernandez E, Toribio ML. The development of T- and non-T-cell lineages from CD34⁺ human thymic precursors can be traced by differential expression of CD44. J Exp Med 1995 ; 181 : 475-83.

35. Res P, Martínez-Cáceres E, Jaleco AC, Staal F, Noteboom E, Weijer K, Spits H. CD34⁺ CD38^dim cells in the human thymus can differentiate into T, natural killer, and dendritic cells but are distinct from pluripotent stem cells. Blood 1996 ; 87 : 5196-206.

36. Leclercq G, Debacker V, de Smedt M, Plum J. Differential effects of interleukin15 and interleukin2 on differentiation of bipotential T/natural killer progenitor cells. J Exp Med 1996 ; 184 : 325-36.

37. Rodewald HR, Kreszschmar K, Takeda S, Hohl C, Dessing M. Identification of pro-thymocytes in murine fetal blood. EMBO 1994 ; 13: 4229-40.

38. Bruno L, Res P, Dessing M, Cella M, SpitsH. Identification of a committed T cell precursor population in adult human peripheral blood. J Exp Med 1997 ; 185 : 875-84.

39. To LB, Haylock DN, Dowse T, Simmons PJ, Trimboli S, Ashman LK, Juttner CA. A comparative study of the phenotype and proliferative capacity of peripheral blood (PB) CD34⁺ cells mobilized by four different protocols and those of steady-phase PB and bone marrow CD34⁺ cells. Blood 1994 ; 84 : 2930.

40. Georgopoulos K, Bigby M, Wang JH, Molnar A, Wu P, Winandy S, Sharpe A. The Ikaros gene is required for the development of all lymphoid lineages. Cell 1994 ; 79 : 143-56.