Détection des bandes oligoclonales d’immunoglobulines G dans le liquide céphalorachidien par immunofixation après migration électrophorétique sur l’automate Hydrasys® Sebia

ARTICLE

Matériel et méthodes

Échantillons

Sur une période de 3 mois, nous avons étudié tous les couples LCR-sérum reçus au laboratoire pour bilan biologique, soit 144 couples LCR-sérum qui ont été classés en cinq groupes cliniques en fonction du degré de certitude des atteintes neurologiques :

1) le groupe de 27 SEP définies (19 %),

2) le groupe de 29 SEP possibles ou probables (20 %),

3) le groupe de 35 maladies neurologiques non inflammatoires (24 %),

4) le groupe de 4 autres maladies neurologiques inflammatoires (3 %),

5) le groupe de 49 pathologies neurologiques au diagnostic imprécis (34 %).

Bilan biologique

Nous avons effectué, en pratique quotidienne, un examen cytochimique et cytologique, un bilan immunologique comprenant un dosage des IgG et de l'albumine dans le LCR et le sérum correspondant du même patient. Le quotient albumine, témoin des échanges au niveau de la barrière hémato-méningée et l'index d'IgG selon Delpech et Lichtblau, témoin de l'état immunitaire du SNC ont été calculés.

L'électrophorèse haute résolution sur agarose des protéines du LCR concentré à 8 g/l et du sérum dilué au 1:10 a été réalisée sur l'automate multiparamétrique Hydrasys^® (Sebia) à l'aide du coffret réactif Hydragel HR^® (Sebia). Le colorant des gels est le violet acide. Une dizaine de fractions sont révélées. L'analyse est qualitative, l'identification des bandes dans la zone des gammaglobulines est faite par rapport à celle des bandes du sérum correspondant. Cinq profils ont été définis, profil normal, transsudatif, oligoclonal, transsudatif et oligoclonal, profil d'interprétation difficile. Ce dernier profil est fréquemment rencontré (zone des gammaglobulines hétérogène ou présence systématique de bandes dans la zone des gammaglobulines qui ne sont pas des immunoglobulines). L'interprétation de l'électrophorèse est souvent difficile et nécessite une étape supplémentaire d'immunorévélation des bandes présentes dans la zone des gammaglobulines.

Recherche des bandes oligoclonales de nature IgG

Elle a été réalisée par deux techniques permettant la visualisation immunospécifique du profil IgG.

1) La première technique est une immunofixation sur gel d'agarose (Hydragel 6 CSF^®, Sebia) après électrophorèse haute résolution. Nous avons suivi le protocole opératoire préconisé par le fabricant en travaillant sur le semi-automate Hydrasys^® qui assure les étapes d'application des échantillons, de migration électrophorétique (programme CSF), d'incubation des réactifs, de révélation et de séchage final des gels. Les étapes manuelles sont la préparation des échantillons, le dépôt des réactifs antisérums et révélateurs. Le coffret réactif Hydragel 6 CSF^® contient 10 gels d'agarose avec 12 pistes par gel. Chaque gel permet l'analyse comparée de 6 profils IgG de 6 couples LCR-sérum. Les échantillons de LCR et de sérum sont ajustés à 10 mg/l d'IgG, correspondant à un dépôt d'IgG d'environ 0,15 µg. La migration est programmée à 20 °C pendant environ 17 min à 20 W constants. L'immunofixation s'effectue dans l'automate à 20 °C pendant 10 min à l'aide d'un masque, en recouvrant chacune des pistes par 50 µl de l'immunsérum anti-IgG humaines conjugué à la peroxydase (Sebia) dilué au 1:11 dans le diluant antisérum (anti-IgG-PER, anti-gamma spécifique, non fourni dans le coffret réactif). La révélation enzymatique se fait à 30 °C pendant 15 min par le réactif TTF3 en présence d'eau oxygénée à 110 volumes. Le principe d'interprétation consiste à comparer le profil IgG du LCR et du sérum. Le profil oligoclonal d'IgG est défini par la présence d'au moins une bande d'IgG surnuméraire dans le LCR ou par la présence d'une condensation de la zone des gammaglobulines non retrouvée dans le sérum. En raison de la difficulté d'interprétation de certains profils IgG présentant une bande peu intense et diffuse, nous avons essayé d'amplifier les restrictions d'hétérogénéité des profils IgG en utilisant les immunsérums antichaînes légères kappa et lambda.

2) La deuxième technique est la technique de référence de focalisation isoélectrique des IgG (IEF) sur gel d'agarose en gradient de pH large. Elle a été mise au point au laboratoire, optimisée sur Isogel agarose IEF plates^® pH 3-10 de FMC Bioproducts (Tebu) avec immunorévélation des IgG sur membrane de PVDF. L'immunsérum utilisé est un immunsérum de chèvre anti-IgG totales humaines (H + L) conjugué à la biotine et les réactifs révélateurs sont la streptavidine PAL (phosphatase alcaline) et le réactif NBT/BCIP (Interchim, Pierce). La technique comprenait 6 étapes, la préparation des échantillons, de façon à déposer sous un même volume, 0,10 µg d'IgG de LCR et du sérum correspondant, le dépôt des échantillons à 3 cm de l'anode sous forme d'une goutte à la surface du gel, la focalisation isoélectrique à 2 000 V et 15 W maximum pendant 35 min, le transfert des protéines par capillarité en 15 min sur membrane (Immobilon-P de Millipore 0,45 µm), la saturation de la membrane pendant 30 min par une solution de lait à 10 %, l'immunorévélation des IgG par l'immunsérum anti-IgG humaines totales biotinylées (antichaînes lourdes et antichaînes légères) dilué au 1:2 000 en tampon TBS pH 7,4, la révélation par le réactif streptavidine-PAL (complexe streptavidine-phosphatase alcaline) et le réactif prêt à l'emploi NBT/BCIP. Le profil oligoclonal des IgG est défini par la présence d'au moins 2 bandes d'IgG surnuméraires dans le profil IgG du LCR par rapport au profil IgG du sérum.

Résultats

Performances analytiques

Les performances analytiques des techniques permettant la mise en évidence des bandes oligoclonales d'IgG sur 144 couples LCR-sérum sont présentées dans le tableau 1. Les performances analytiques sont bonnes pour les deux techniques avec immunorévélation des IgG. En revanche, l'électrophorèse des protéines avec coloration par le violet cristal, technique couramment utilisée pour la recherche d'un profil oligoclonal, n'est pas une technique informative pour révéler un profil oligoclonal de nature IgG.

L'interprétation du profil oligoclonal des IgG par la technique d'immunofixation 6 CSF^® est parfois délicate. La double lecture des profils IgG des couples LCR-sérums est nécessaire par deux lecteurs expérimentés. L'interprétation des profils IgG oligoclonaux semble facilitée par l'utilisation des immunsérums antichaînes légères kappa et lambda. Ces immunsérums ont permis d'infirmer ou de confirmer la présence d'un profil oligoclonal IgG dans le LCR par rapport au sérum en visualisant la restriction d'hétérogénéité simultanément sur trois pistes, anti-gamma, anti-kappa et anti-lambda. La reproductibilité de la mise en évidence des bandes oligoclonales d'IgG est bonne sur des prélèvements frais et décongelés une seule fois. La perte d'une partie des bandes oligoclonales d'IgG est très nette après deux décongélations. Elle est totale après quatre décongélations.

Performances diagnostiques

Elles sont présentées dans le tableau 2. La mise en évidence de bandes oligoclonales d'IgG par la technique d'immunofixation 6 CSF^® Sebia se révèle un indicateur biologique performant dans le diagnostic des maladies inflammatoires chroniques du SNC, tout particulièrement dans le diagnostic précoce de la SEP, avec une sensibilité diagnostique à 90 %, une spécificité diagnostique à 94 %, ce qui correspond à une efficacité diagnostique de 92 %. Les bandes oligoclonales d'IgG par la technique de référence, appelée gold standard, sont présentes dans 95 % des cas avec une spécificité à 100 %. L'efficacité diagnostique est estimée à 97 %. Nous présentons dans les figures 1 à 3 les images obtenues par les trois techniques de mise en évidence de bandes oligoclonales (technique d'immunofixation Sebia, technique de référence par focalisation isoélectrique, électrophorèse des protéines sur agarose).

Discussion

La technique de mise en évidence des bandes oligoclonales d'IgG par immunofixation après électrophorèse sur gel d'agarose (IFE), sans concentration préalable des IgG, sur Hydrasys^®, présente une bonne praticabilité, des sensibilité et spécificité diagnostiques assez proches de celles de la technique de référence d'immunorévélation des IgG sur membrane après focalisation isoélectrique (IEF). L'interprétation des profils IgG est l'étape la plus délicate. Elle peut être améliorée si cela est nécessaire par l'utilisation des immunsérums anti-chaînes légères kappa et lambda [8]. Cet examen est encore réservé à des laboratoires spécialisés en neuro-immunologie. Cependant, en raison de son automatisation et de ses bonnes performances analytiques et diagnostiques, il doit faire partie de tout bilan de routine du LCR à la recherche d'une maladie inflammatoire et doit remplacer la traditionnelle technique d'électrophorèse des protéines totales qui se révèle non informative.

REFERENCES

1. Caudie C, Confavreux C, Quincy C. L'analyse cytologique du LCR dans la sclérose en plaques. Rev Franc Lab 1986 ; 149 : 29-33.

2. Confavreux C, Caudie C, Touraine F. Plasma cells in cerebrospinal fluid and multiple sclerosis : diagnostic yield and clinicobiological correlations. Acta Neurol Scand 1986 ; 74 : 432-8.

3. Caudie C, Boustany A, Kaya C, Vergne A, Quincy C. Apport de la technique d'immunofixation dans l'étude des bandes monoclonales et oligoclonales du LCR. Ann Biol Clin 1988 ; 7 : 585 (abstract).

4. Luxon RW, McLean BN, Thomson EJ. Isoelectric focusing versus quantitative measurements in the detection of intrathecal synthesis of IgG. Clin Chim Acta 1990 ; 187 : 297-308.

5. Kostulas V, Link H, Lefvert AK. Oligoclonal IgG bands in cerebrospinal fluid : principles for demonstrating and interpretation based on finding in 1 114 neurological patients. Arch Neurol 1987 ; 44 : 1041-4.

6. Sharief MK, Thomson EJ. The predictive value of intrathecal immunoglobulin synthesis and magnetic resonance imaging in acute isolated syndromes for subsequent development of multiple slerosis. Ann Neurol 1991 ; 29 : 147-51.

7. Anderson M, Alvarez-Cermeno J, Bernadi G, et al. Cerebrospinal fluid in the diagnosis of multiple sclerosis : a consensus report. Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 ; 57 : 897-902.

8. Caudie C, Kaya C, Vergne A, Confavreux C, Quincy C. Apport de l'électrophorèse et de l'immunofixation dans l'étude des protéines du LCR au cours des maladies inflammatoires du SNC. Partenaires Biologie, Ed Beckman, mai 1990.