Endocrine disruption and human reproduction risk assessment: Today's scientific challenges and the stakes for tomorrow

ARTICLE

ers.2011.0498

Auteur(s) : Nadia Quignot¹ nadia.quignot@ineris.fr, Robert Barouki² robert.barouki@parisdescartes.fr, Emmanuel Lemazurier¹ emmanuel.lemazurier@ineris.fr

¹ Ineris Toxicologie expérimentale Parc technologique ALATA BP 2 60550 Verneuil-en-Halatte France

² Inserm Unité mixte de recherche (UMR) S-747 45, rue des Saints-Pères 75006 Paris France

Tirés à part : E. Lemazurier

Les perturbateurs du système endocrinien

Au sein de l’organisme, le système endocrinien a pour but de maintenir les fonctions normales et le développement, en dépit d’un environnement en perpétuel mouvement. Sa plasticité est relayée dans un premier temps par le système nerveux central, permettant des réponses rapides, puis les nombreuses glandes qui composent le système endocrinien agissent de façon prolongée. Ces glandes ont à la fois une action directe et indirecte, via des boucles de rétrocontrôle complexes, pour réguler des processus physiologiques comme le cycle menstruel, la prolifération cellulaire… Comme tous les processus homéostatiques, le système endocrinien a une capacité limitée à maintenir les paramètres physiologiques à l’équilibre. Quand cette capacité est dépassée, par exemple après surexposition à des produits chimiques, des effets indésirables peuvent s’ensuivre.

Depuis de nombreuses années, l’intérêt de la communauté scientifique et du grand public pour le potentiel de certains polluants environnementaux à perturber le système endocrinien n’a cessé de croître. Ces inquiétudes sont nées de plusieurs observations faites sur la faune en contact avec les milieux pollués [1-6]. En ce qui concerne la santé humaine, l’impact de l’exposition à des perturbateurs du système endocrinien est sujet à des controverses. Bien que les observations soient moins flagrantes, les inquiétudes grandissent à mesure que les études épidémiologiques mettent en évidence des troubles croissants (baisse du nombre de spermatozoïdes, augmentation d’incidence des cancers hormonodépendants…) [7-10]. Par ailleurs, certains effets comme les troubles de la reproduction et les cas de cancer observés chez des enfants nés de femmes traitées au diéthylstilbestrol (DES) pendant leur grossesse [11], de même que les effets des polychlorobiphényles (PCB) sur les fonctions neurologiques et immunitaires [12], sont reconnus.

Ces circonstances ont entraîné des efforts de recherche sur les mécanismes de toxicité, ainsi que de nouvelles questions sur l’aptitude à évaluer les risques de ces substances. Une action fondamentale a été de définir de façon adéquate un perturbateur du système endocrinien, plus communément dénommé « perturbateur endocrinien (PE) ». De nombreuses définitions ont été proposées ; bien que des désaccords persistent, un des critères essentiels est que le PE se caractérise avant tout par sa capacité à induire des désordres de la fonction endocrinienne, le danger pour l’organisme n’étant pas la modulation hormonale en soi, mais la rupture de l’équilibre homéostatique. Le Weybridge workshop, en 1996, a d’ailleurs restreint le terme « PE » aux produits chimiques qui causent des effets indésirables sur la santé [13]. Pour l’Organisation mondiale de la santé (OMS), un PE est « une substance exogène ou un mélange qui altère une ou des fonctions du système endocrinien et qui, par conséquent, cause des effets délétères sur la santé d’un organisme, de sa descendance ou d’une population » [14]. Étant donné la diversité des fonctions physiologiques impliquant le système endocrinien, les PE agissent à différents niveaux et de différentes façons :

• –. directement au niveau des récepteurs cellulaires :
  • •. en imitant l’action d’hormones naturelles par fixation sur le récepteur cellulaire de la molécule endogène ;
  • •. en bloquant les récepteurs cellulaires, empêchant ainsi l’action des hormones ;
  • •. en détournant les récepteurs hormonaux de leurs fonctions naturelles ;
• –. indirectement en modifiant la production, le stockage, le transport, la diffusion et l’élimination des hormones naturelles.

La particularité des PE est que leurs effets se produisent via les mécanismes de signalisation physiologiques plutôt que via les mécanismes classiques de toxicité. Par conséquent, les cibles sont difficiles à identifier et la perturbation du système endocrinien peut, dans certains cas, apparaître à des concentrations bien plus faibles que celles qui inquiètent habituellement les toxicologues [15]. De même, dans certains systèmes expérimentaux, les PE peuvent ne pas montrer de relation dose-effet classique, sans doute en raison de la complexité des régulations endocriniennes [16]. La notion de fenêtres d’exposition, pendant lesquelles l’être humain est particulièrement vulnérable (développement fœtal et enfance), est aussi à prendre en compte. Parfois, un même PE peut avoir plusieurs mécanismes d’action, ce qui complique la compréhension de ses effets. En outre, la toxicité rapportée peut être due à des mélanges de composés [17]. Enfin, en plus de la diversité des propriétés physico-chimiques des PE, on ne retrouve pas toujours de corrélation entre effet et structure chimique, ce qui est probablement dÛ à une compréhension insuffisante des mécanismes d’action. Bien évidemment, il est à noter que ces caractéristiques décrites pour les PE s’appliquent aussi à de nombreux autres mécanismes de toxicité impliquant une dérégulation de l’homéostasie physiologique, par exemple neurologique, immunitaire, proliférative…

Stratégie d’évaluation des effets reprotoxiques des perturbateurs endocriniens

La réglementation des produits chimiques est rédigée selon différents cadres en fonction de leur utilisation : produits pharmaceutiques, cosmétiques, phytosanitaires ou autres. Étant donné le peu de règles existantes quant à leur évaluation, les substances ayant des propriétés endocriniennes ont été longtemps englobées par les dispositions concernant les substances toxiques pour la reproduction ou les cancérogènes. Puis, au fur et à mesure que le risque des PE pour l’homme et l’environnement était reconnu internationalement, des efforts ont été faits pour leur prise en compte spécifique dans la directive pesticide [18] et la réglementation européenne REACH (Registration, Evaluation and Authorization of CHemicals). Cependant, la difficulté à apprécier le caractère PE d’une substance persiste. Ainsi, en plus des programmes nationaux et internationaux, de nombreux travaux pour développer et valider des méthodes de screening et d’évaluation sont conduits par le groupe de travail de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) ; des lignes directrices ont notamment été mises en place. La figure 1 retrace les grandes étapes de l’intérêt porté aux PE.

Contexte réglementaire

Le règlement REACH, entré en vigueur le 1^er juin 2007 en Europe, se propose de répertorier et de constituer un rapport de sécurité concernant les dangers des substances chimiques, afin de mieux en maîtriser les risques pour la santé et l’environnement. Cette réglementation prévoit explicitement des limitations spéciales pour les PE : les substances avec des propriétés endocriniennes qui ont, d’après les résultats scientifiques, des effets potentiellement graves sur la santé ou l’environnement, seront ajoutées dans l’annexe XIV concernant les substances soumises à autorisation. Ainsi, de telles substances ne pourront être mises en circulation qu’après une évaluation des risques et des avantages socio-économiques. Un autre aspect important de REACH est la règle des 3R (réduire, raffiner, remplacer) pour l’expérimentation animale [19]. De cette façon, REACH et la directive 86/609/CEE encouragent l’utilisation de méthodes alternatives comme les méthodes in vitro et in silico, autant de nouveaux outils de toxicologie prédictive.

En ce qui concerne les produits phytopharmaceutiques, l’Union européenne a récemment révisé les directives 79/117/CEE et 91/414/CEE concernant la gestion de leur mise sur le marché [18]. Ainsi, la réglementation des produits phytopharmaceutiques ayant des propriétés PE se fera en fonction de leur danger intrinsèque et non plus sur la base d’une évaluation de risques prenant en compte les niveaux d’exposition chez l’homme. Les critères scientifiques pour déterminer les propriétés PE restant à définir, les substances classées comme carcinogènes de type 2 ou toxiques pour la reproduction de type 2 sont considérées comme ayant des propriétés PE.

L’OCDE s’est engagée dans un programme de validation au niveau international de méthodes de tests des PE. Les objectifs sont multiples. Il s’agit d’élaborer de nouvelles lignes directrices pour les essais, de réviser les lignes directrices existantes dans le but de détecter les PE, et d’harmoniser les méthodes de caractérisation des dangers et des risques. L’approche proposée inclut des tests de screening validés, classés en cinq niveaux selon la complexité (tableau 1).

Tableau 1 Cadre réglementaire de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) pour les essais et l’évaluation des perturbateurs endocriniens.

OECD regulatory framework for assays and assessment of endocrine disruptors.

* QSAR : quantitative structure-activity relationship.

Le cadre réglementaire de l’OCDE est organisé en cinq paliers, chacun correspondant à un niveau différent de complexité biologique, à la fois pour les champs de la toxicologie et de l’écotoxicologie. Les tests in vitro et in vivo à court terme (niveaux 1, 2 et 3) sont utilisés pour hiérarchiser les substances avant de passer à des études à plus long terme (niveaux 4 et 5) pouvant être employées dans le cadre de l’évaluation du risque. Cependant, il s’agit davantage d’une « boîte à outils », dans laquelle sont placés les différents tests susceptibles d’être utiles à la détection des dangers des perturbateurs endocriniens (PE) qu’un schéma de tests à respecter.

The OECD regulatory framework is a tiered approach in which each of the five levels corresponds to a different level of biological complexity, both for the fields of toxicology and ecotoxicology. In vitro assays and short-term in vivo assays (levels 1, 2 and 3) are used to prioritize substances for definitive longer-term studies (levels 4 and 5), which can be used as a basis for risk assessment. However, it is more a toolbox of assays than an ordered list to follow.

Défis scientifiques des perturbateurs endocriniens

Le caractère particulier des PE rend leur évaluation toxicologique difficile. La démarche d’évaluation classique focalisée sur l’étude d’une cible précise apparaît inadaptée. De plus, étant donné que les effets induits par les PE sont susceptibles de mettre en jeu des mécanismes relevant de l’homéostasie hormonale, il est difficile de différencier les effets directs de ces substances de ceux résultant de régulations physiologiques inappropriées. Enfin, la multiplicité des niveaux d’action possibles ainsi que la variété des réponses engendrées ajoutent à la complexité de l’évaluation.

Les circonstances d’exposition aux PE sont telles qu’il est nécessaire de s’intéresser aux effets à faible dose, sur le long cours, et selon des fenêtres critiques d’exposition, ce qui est très difficile sur le plan expérimental. L’impact des PE à faibles doses ainsi que leur relation dose-réponse non monotone (courbes en « U » ou en « U » inversé, par exemple) ont été décrits par différents travaux [15, 16, 20], mais des désaccords persistent au sein de la communauté scientifique. Dans le but de statuer sur la preuve scientifique des effets à faibles doses des PE, le National Toxicology Program (NTP), avec l’appui de l’Environmental Protection Agency (EPA), a organisé un débat en octobre 2000 [21]. La Commission conclut que :

• –. il y a une preuve des effets à faibles doses chez les animaux de laboratoire, même si, dans certains cas, ces effets n’ont pas été répliqués ;
• –. la forme de la courbe dose-réponse dépend du critère évalué et du protocole d’étude ;
• –. le schéma des tests pour la toxicologie de la reproduction et du développement doit être revu et, si possible, révisé pour la sélection de la dose, des modèles animaux, des temps et des critères mesurés.

La Société d’endocrinologie a également publié un état des lieux scientifique sur les PE, incluant le soutien de l’hypothèse des faibles doses [22]. Une autre problématique des faibles doses est la difficulté des instances à établir des normes pour l’évaluation du risque. Par exemple, la définition classique d’un niveau d’exposition à risque minimal se fait par l’application d’un facteur d’incertitude à la no observed adverse effect level (NOAEL), elle-même dérivée d’études partant du principe que la dose-réponse est monotone, ce qui n’est pas nécessairement le cas avec certains PE.

Par ailleurs, les contaminations par les PE étant pratiquement toujours multiples, il est nécessaire de pouvoir évaluer les effets des mélanges. Malgré la difficulté, l’intérêt des expositions cumulées à de nombreux PE s’est accru [23, 24]. Les mélanges ont été rapportés comme ayant des effets synergiques ou potentialisateurs [25-27], voire même des effets antagonistes [28]. Là aussi, par rapport aux scenarii de l’exposition des populations, la recherche sur les mélanges doit se focaliser sur les combinaisons de substances à doses environnementales.

Enfin, il existe une notion importante concernant le danger de l’exposition aux PE durant les périodes de vulnérabilité pendant lesquelles les fonctions endocriniennes se mettent en place (développement pré- et postnatal, puberté). Cette exposition est rarement prise en compte dans les lignes directrices de tests classiques, mise à part l’étude de reprotoxicité sur deux générations. Cependant, même si cette étude évalue en partie les effets à long terme apparaissant après le sevrage grâce à l’étude des jeunes adultes, d’autres effets-retards potentiellement importants, comme ceux survenant durant le vieillissement, ne sont pas évalués.

Modèles d’étude d’aujourd’hui et de demain

Le mécanisme d’action complexe des PE, ainsi que la difficulté à tirer des conclusions des études épidémiologiques de par la multiplicité des facteurs pouvant être impliqués dans les affections hormonodépendantes, ont encouragé le développement de tests dans l’objectif de toujours mieux évaluer les risques. Alors que les tests sur l’animal permettent d’avoir une vue d’ensemble sur la toxicité d’une substance, les tests in vitro sont fondamentaux pour comprendre les mécanismes d’action mis en jeu. Ces derniers s’insèrent également dans la volonté des 3R définie par REACH. Cependant, le problème des corrélations (in vitro/in vivo et animal/homme) persiste et des efforts de plus en plus nombreux sont axés sur le développement de nouveaux tests, comme les techniques in silico ou de nouveaux modèles biologiques.

Tests in vivo

Les tests sur les animaux proposés pour identifier et caractériser les PE sont de deux types. Tout d’abord, des tests in vivo ont été développés spécifiquement pour l’identification des PE. Le test d’utérotrophie [29] repose sur le principe que des composés se liant au récepteur des estrogènes (ER) peuvent induire une hypertrophie de l’utérus chez des femelles rongeurs immatures ou ovariectomisées. Le test de cornification vaginale [30] repose sur la capacité des substances estrogéniques à induire la kératinisation des cellules épithéliales vaginales chez les femelles ovariectomisées. Le test d’Hershberger [31] mesure la capacité d’un composé à avoir des effets agonistes ou antagonistes sur le récepteur des androgènes (AR), grâce aux variations de poids de la prostate ventrale et des vésicules séminales chez des mâles castrés. Les tests d’utérotrophie et d’Hershberger (figure 2) sont validés et recommandés par l’OCDE (respectivement, lignes directrices 440 et 441). Les tests de puberté rongeurs mâle/femelle (20 jours) évaluent quant à eux les activités androgénique ou estrogénique et thyroïdienne chez les rongeurs immatures exposés aux produits chimiques pendant la puberté (examen des anomalies associées au développement des organes sexuels, caractères sexuels secondaires).

En parallèle de ces tests, des informations intéressantes sur le caractère PE de composés peuvent être obtenues avec les tests existants de reprotoxicité et de toxicologie du développement. À cette fin, un certain nombre de lignes directrices OCDE peuvent être utilisées, comme la ligne directrice 415 (Étude de la toxicité de la reproduction sur une génération), la ligne directrice 421 (Essai de dépistage de la toxicité pour la reproduction et le développement) et la ligne directrice 422 (Étude combinée de toxicité à doses répétées et de dépistage de la toxicité pour la reproduction et le développement). Certaines lignes directrices ont été révisées pour inclure des critères de détection des effets sur le système endocrinien. C’est le cas de la ligne directrice 407 (Toxicité orale à dose répétée : 28 jours), à laquelle ont été ajoutées les concentrations sériques hormonales, les paramètres spermatiques, la cyclicité estrale et le poids des organes hormonosensibles [32]. La ligne directrice 416 (Étude de la toxicité de la reproduction sur deux générations) a été complétée par de meilleures évaluations histopathologiques, endocriniennes et phénotypiques [33] ; les taux de testostérone et la distance anogénitale chez les fœtus mâles permettent d’améliorer la valeur prédictive de la ligne directrice 414 (Étude de la toxicité pour le développement prénatal) [34].

Malgré les avantages des tests in vivo, un certain nombre d’inconvénients persistent (tableau 2). Hormis les problèmes éthiques liés à l’utilisation d’un grand nombre d’animaux, les différences interespèces constituent une limite à ce type de tests. Par exemple, il existe des variations de sensibilité selon l’espèce et la souche, avec des modèles rongeurs souvent trop sensibles aux composés à tester. De plus, des critères physiologiques comme l’absence de sex hormone-binding globulin (SHBG) après la parturition chez les rongeurs, ou encore une capacité de glucuronidation plus importante chez le rat que chez l’homme [35], peuvent modifier la clairance métabolique des hormones.

Tableau 2 Principes, avantages et limites des tests in vivo et in vitro utilisés spécifiquement pour l’évaluation des perturbateurs endocriniens (PE).

Principles, advantages and limitations of in vivo and in vitro assays used specifically to assess endocrine disruptors.

(+) : avantages ; (-) limites ; ER : récepteur des estrogènes ; AR : récepteur des androgènes ; TR : récepteur thyroïdien ; PR : récepteur à la progestérone.

Tests in vitro

Les tests in vitro sont d’une grande utilité pour la caractérisation des mécanismes d’action. Ils offrent également, surtout s’ils sont utilisés en combinaison, la possibilité de fournir un screening précoce pour un large panel de produits chimiques. Les premiers tests ont été développés en prenant en compte le mimétisme direct de l’hormone [36], puis la stéroïdogenèse et autres processus métaboliques sont devenus des cibles d’intérêt.

Les tests prenant en compte l’interaction des substances avec les récepteurs sont de trois types (tableau 2) : tests de liaison, tests de prolifération cellulaire et tests de transactivation de récepteur (figure 3). Des travaux plus récents s’intéressent aux interactions des substances avec la stéroïdogenèse. De nombreux modèles ont été proposés : systèmes acellulaires, lignées cellulaires, cultures primaires et cultures de fragments de tissus. Les tests enzymatiques acellulaires sont surtout focalisés sur l’enzyme aromatase, qui catalyse la conversion irréversible des androgènes en estrogènes, étape-clé de la stéroïdogenèse [37]. L’essai in vitro de synthèse de stéroïdes dans les cellules H295R de carcinome adrénocortical, validé par l’OCDE [38], permet le screening des interférences des produits chimiques avec de nombreuses enzymes de la stéroïdogenèse, dont l’aromatase. D’autres types cellulaires sont aussi utilisés, comme la lignée cellulaire humaine de choriocarcinome placentaire JEG-3, dans laquelle l’aromatase est exprimée à un niveau constitutif important [39]. Hormis les lignées cellulaires, l’analyse de la régulation de gènes et de la production de stéroïdes peut aussi se faire dans des cultures primaires de cellules de mammifères, par exemple les cellules de Leydig ou de la granulosa. En ce qui concerne les fragments de tissus, l’évaluation de l’effet toxique sur la stéroïdogenèse est limitée aux testicules et aux ovaires. Les fragments de testicules de rat sont parmi les plus utilisés pour étudier la capacité des PE à interférer avec une des signalisations intracellulaires impliquées dans la biosynthèse testiculaire de testostérone [40]. Il existe également des modèles in vitro de follicules de rongeurs, conçus pour étudier l’effet de PE sur la biosynthèse des stéroïdes, en relation avec la croissance folliculaire et le développement de l’oocyte [41].

Les tests in vitro, simples, sensibles, spécifiques et peu coÛteux, permettent un screening à grande échelle. Cependant, malgré leur valeur réglementaire, ils présentent certaines limites (tableau 2), que les tests in silico et de nouvelles technologies pourraient pallier, du moins en partie.

Tests in silico

En parallèle des modèles in vivo et in vitro, un troisième axe regroupe les développements « in silico », ou modélisations mathématiques. Il peut s’agir des quantitative structure-activity relationship (QSAR), de modélisations plus systémiques de toxicodynamie et toxicocinétique, ou encore de couplages entre ces différentes échelles de modélisation.

Les modèles QSAR sont des modèles informatiques fondés sur l’utilisation de plusieurs bases de données et des modèles théoriques pour prédire des activités particulières en fonction des structures chimiques. Dans le cas précis des PE, le groupe QSAR de la National Food Institute (NFI) danoise a développé trois modèles pour les effets in vitro : liaison au ERα, transactivation du ER et antagonisme du AR [42]. Un autre exemple est celui de l’équipe de Martin et al. [43], qui a développé un modèle grâce à la base de données de l’EPA ToxRef (pour toxicity reference), intégrant 30 ans de données de toxicité des pesticides dans le cadre d’études chroniques rongeurs. Le modèle a permis de générer des signatures toxicologiques prédictives, reliant structures chimiques et profil toxicologique déterminé in vivo. L’essor de ce type de modèles ne doit cependant pas faire oublier les limites inhérentes aux PE, à savoir l’absence de structures précises conférant une activité déterminée (par exemple, estro- ou androgénique).

Les modèles physiologiques PBPK (pour physiologically-based pharmacokinetic) sont générés en fonction de l’anatomie et de la physiologie de l’individu, ainsi que sur une description mécanistique des processus toxicocinétiques : absorption, distribution, métabolisme, excrétion (ADME). L’intégration de la toxicocinétique de la substance au sein de l’organisme doit permettre de définir des relations dose-réponse adéquates pour les extrapolations inhérentes à l’évaluation du risque (interdoses, interespèces…). La dose-réponse non linéaire des PE, ainsi que leur action potentielle à faibles doses, complique la tâche des chercheurs.

Étant donné que les effets des PE peuvent être multiples, il serait intéressant de développer des modèles intégrant diverses échelles de complexité (cellule, organe, organisme, individu, population) et reposant sur les résultats obtenus dans des tests in vitro, des modèles QSAR et des modèles PBPK. Dans cette optique, des modèles se développent aussi bien au niveau cellulaire pour estimer les concentrations de stéroïdes produites in vitro [44], qu’au niveau de l’organisme entier pour caractériser les mécanismes d’action impliqués in vivo [45].

Nouvelles technologies

Les tests in vivo, in vitro et in silico ne permettant pas de répondre à toutes les questions que pose la caractérisation des dangers des PE, il est apparu nécessaire de développer de nouvelles technologies. Tout d’abord, les « omics » (génomique, protéomique, métabonomique) interviennent à tous les niveaux. La technologie des puces à ADN, désormais bien maîtrisée, permet de mesurer et de visualiser très rapidement et de façon simultanée les différences d’expression entre les gènes, et cela à l’échelle d’un génome complet. Des puces à anticorps et à protéines, permettant de détecter des variations de quantités de protéines ou des interactions protéines-protéines, sont également développées. Bien que les technologies de génomique et de protéomique soient déjà appliquées à la toxicologie du médicament, leur utilisation dans le domaine de la toxicologie environnementale, et plus spécifiquement des PE, reste restreinte. Le coÛt de ces méthodes apparaît ici comme une limite majeure. Des initiatives voient tout de même progressivement le jour au niveau international, notamment aux États-Unis (création du National Center for Toxicogenomics), en Europe (multiplication des plates-formes de génomique et de protéomique) et au Japon. Des stratégies plus ciblées sont aussi développées, comme le projet Comparative research on endocrine disrupters (COMPRENDO) en Europe, qui inclut un screening moléculaire des effets des PE sur l’expression de gènes cibles clés pour la fonction sexuelle [46].

Une des principales limites des tests in vivo étant la difficulté à comprendre le mécanisme d’action propre des PE, des modèles in vivo spécifiques émergent, comme les souris transgéniques pour lesquelles un gène a été invalidé (souris KO [pour knock-out]). Initialement développés pour comprendre la physiologie, ces modèles permettent de dépasser les contraintes de l’utilisation d’animaux castrés au sein desquels plusieurs hormones sexuelles sont absentes. Dans le cadre des PE, les gènes délétés sont le plus souvent ceux codant pour des protéines importantes dans la fonction de reproduction, comme le ERα, le ERβ, le AR, le récepteur à l’hormone lutéinisante, le récepteur à l’hormone folliculo-stimulante, l’aromatase. Ce type de modèle permet de discriminer les effets passant par la cible délétée ou non, et ainsi de mieux définir quels sont les gènes impliqués dans la physiopathologie des désordres engendrés. La technologie est désormais disponible pour appliquer la méthode d’invalidation de gènes aux rats et autres espèces, ainsi que pour humaniser ces modèles transgéniques (récepteurs nucléaires, protéines accessoires).

Un autre outil pour la caractérisation des dangers est l’imagerie. Cette technique permet à la fois une meilleure définition des cibles cellulaires des toxiques et la fabrication de modèles révélateurs de toxicité. Un des exemples d’utilisation de cette technologie in vivo est le modèle commercial LPTA^®CD-1-Tg (Cyp19-luc)-Xen (line 125) [47]. Ce modèle bioluminescent de souris contient dans son génome un gène luciférase modifié (Promega pGL-3) sous le contrôle de la région promotrice pII de l’aromatase, gonade-spécifique. Grâce à l’évaluation de la bioluminescence ex vivo dans les organes, cette souris transgénique peut servir d’outil de screening pour les substances capables d’altérer l’expression du gène aromatase relayée par le promoteur pII. Un autre exemple est celui de la technologie WatchFrog^®, qui repose sur l’insertion de constructions génétiques exprimant une protéine fluorescente dans des têtards et alevins [48]. L’éventuelle altération de la signalisation hormonale suite à l’exposition in vivo au produit à tester sera détectable grâce à l’émission d’un signal lumineux, lui-même entraîné par l’activation des éléments de réponse spécifiques au gène cible étudié (que ce soit via la liaison directe du polluant aux récepteurs ou via les hormones physiologiques dont la synthèse, le transport ou le métabolisme auront pu être altérés par le polluant). Les gènes testés sont des biomarqueurs permettant de révéler la présence et l’impact sur les systèmes hormonaux de produits chimiques, de PE, ou encore de résidus médicamenteux. La fluorescence est émise de façon localisée, est visible directement par transparence et peut être quantifiée (figure 4). Un modèle permettant de visualiser l’expression de l’aromatase B dans le cerveau de poisson-zèbre (Danio rerio) a aussi été développé [49].

Pour s’affranchir des limites posées par les tests in vitro (absence de prise en compte de l’environnement extérieur in vivo, étude d’un type cellulaire isolé à la fois), une stratégie pourrait être d’utiliser des « modèles bioartificiels » (cocultures de cellules, « organes artificiels », modèles de barrières). Ces modèles biologiques devraient permettre d’aborder in vitro des questions systémiques et fonctionnelles, en prenant en compte les interactions entre différents niveaux de complexité du vivant.

En plus des tests visant à mieux comprendre les mécanismes d’action des PE et à établir des corrélations à l’homme, des méthodes analytiques de plus en plus performantes permettent de doser le polluant au niveau des organes-cibles, même à faibles doses [50]. Ces données de dosimétrie sont d’une grande utilité pour évaluer de façon intégrée la toxicité des PE. Des outils bioanalytiques, basés sur la mesure sensible et quantitative de réponses biologiques précoces et spécifiques [51], sont également développés. Ces méthodes, qui fournissent à la fois des informations analytiques et toxicologiques, peuvent notamment intégrer les effets interactifs des polluants, ce qui en fait de puissants outils pour la caractérisation des dangers des mélanges. Parmi les différentes stratégies bio-analytiques, l’approche EDA (effect directed analyses, pour analyses dirigées par les bioessais) consiste en un couplage entre des outils bio-analytiques, des méthodes de fractionnement et des outils de chimie analytique. L’objectif principal est d’identifier les composés responsables des réponses biologiques observées [52]. Cette approche est divisée en trois phases. La première phase consiste en un fractionnement du mélange pour isoler les fractions actives dans les bioessais ; ce fractionnement est en général réalisé selon les propriétés physicochimiques des molécules (colonnes SPE [solid phase extraction], hyperfractionnement HPLC [high performance liquid chromatography] sur phase normale ou inversée…), mais plus récemment, une séparation des molécules sur colonnes d’affinité en fonction de leur activité biologique (liaison au récepteur cible) a été décrite [53]. La deuxième phase est l’identification des composés suspectés dans les fractions actives, par des méthodes d’analyse physicochimiques (chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire, spectrométrie UV-visible…). Enfin, l’étape de confirmation a pour objectif de caractériser l’effet biologique de la molécule identifiée in vitro et, idéalement, in vivo.

Perspectives

Bien que les défis scientifiques posés par les PE soient encore loin d’être résolus, la compréhension croissante de leurs mécanismes d’action permet d’envisager des stratégies de tests. Ces stratégies pourraient être à la fois motivées par leur pertinence scientifique et par leur logique méthodologique.

Stratégie scientifique

Tout d’abord, une évaluation critique du panel de cibles des PE doit être faite. Le fait que certains mécanismes d’action des PE ne soient pas encore élucidés doit pousser à se tourner vers d’autres pistes que celles envisagées précédemment. Par exemple, les PE peuvent influer sur le métabolisme terminal des hormones en altérant la fonctionnalité des enzymes hépatiques. Ce processus peut affecter les niveaux libres et conjugués d’androgènes, d’estrogènes et de ligands thyroïdiens. D’autres mécanismes d’action continuent également à être découverts : effets non génomiques via l’interaction aux récepteurs membranaires stéroïdiens, récepteurs orphelins, nouveaux inhibiteurs de la stéroïdogenèse, effets au niveau de la transduction du signal médiée par les facteurs de croissance.

La multiplicité des cibles des PE accentue le besoin d’une stratégie intégrative, avec une approche multicibles et un raisonnement en termes de recrutement de voies de signalisation moléculaires. La biologie systémique recouvre ainsi une approche globale pour tenter d’intégrer l’ensemble des informations disponibles à différents niveaux de complexité biologique (cellule, tissu, organisme). L’objectif est de mettre en relation les données sous forme de réseaux interactifs, afin de construire un modèle le plus quantitatif possible.

Les observations épidémiologiques ont conduit à l’hypothèse que le risque de développer des maladies chroniques non contagieuses chez l’adulte est influencé non seulement par les facteurs génétiques et le style de vie, mais également par des facteurs environnementaux agissant précocement dans la vie [54]. Ces facteurs pourraient entraîner des réponses plastiques d’adaptation qui constitueraient un terrain de sensibilité lors de l’exposition plus tardive ou même pour les générations suivantes. La plasticité génomique (épigénétisme) est une approche encore trop peu envisagée dans le cadre de la caractérisation des dangers des PE. Pourtant, cet outil pourrait être très utile, notamment lors des études sur plusieurs générations et des expositions in utero. De même, un éventuel rôle du polymorphisme génétique sur la vulnérabilité individuelle aux effets toxiques est à rechercher.

Enfin, la mesure de l’exposition (expologie) est un facteur indissociable d’une bonne évaluation du risque et pourrait permettre de mieux prédire et caractériser les effets des PE chez l’homme. Cependant, obtenir une estimation de l’exposition à l’échelle d’un groupe ou d’une population pose des problèmes méthodologiques. Cette difficulté pourrait être contournée grâce à la mesure de biomarqueurs dans les fluides biologiques. Ces bio-indicateurs peuvent être aussi bien les polluants ou leurs métabolites que des biomarqueurs d’exposition, signes d’une atteinte toxicologique (dosages hormonaux, activités enzymatiques…). Des marqueurs peuvent aussi être développés chez des animaux sentinelles, mais une grande prudence doit être adoptée pour l’établissement de corrélations. Par exemple, Ankley et al. [55], en parallèle de la détection de biomarqueurs signes d’une perturbation endocrinienne chez des espèces sentinelles, préconisent de réfléchir en termes de voies de signalisation d’effets indésirables.

Stratégie méthodologique

Les technologies récentes ont été décrites comme de puissants outils pour la caractérisation des risques des PE. Dans certains cas, elles sont un moyen de s’affranchir des limites inhérentes aux tests ; dans d’autres, elles permettent une approche à différents niveaux. Ainsi, le problème du manque de métabolisme pour les tests in vitro peut être limité par l’incubation des composés tests avec des systèmes métaboliques tels que des fractions microsomales de foie humain [35]. De même, les efforts faits dans l’humanisation des modèles in vivo et in vitro sont fondamentaux pour extrapoler les résultats des tests à l’homme. Les organes bioartificiels permettent de prendre en compte les interactions complexes du vivant et d’avoir ainsi une approche méthodologique plus pertinente. Les approches « omics », quant à elles, apparaissent comme un outil de choix pour comprendre les grands mécanismes d’action de la toxicité des PE, et notamment aborder les études des effets à faibles doses et de mélanges. Enfin, les stratégies prédictives in silico pourraient non seulement permettre l’extrapolation espèces expérimentales/homme, mais aussi de définir des profils toxicologiques, de modéliser l’échappement aux courbes de dose-réponse…

En dehors de considérations méthodologiques pures, le choix des modèles est primordial selon l’objectif et la cible étudiée. De nombreux paramètres conférant des réponses cellule- et tissu-spécifiques, il apparaît important d’intégrer les tests sur différents niveaux d’organisation hiérarchique. De plus, le protocole expérimental doit être grandement réfléchi, étant donné les particularités des PE (pas de dose-réponse monotone, périodes de vulnérabilité…). L’exemple de Li et al. [56] confirme l’importance du choix de la période d’exposition pour éviter les faux positifs ou faux négatifs. Au cours de cette étude, des souris ont été traitées par le DES pendant le développement ou à l’âge adulte. L’analyse des motifs de méthylation de l’ADN au niveau du gène de la lactotransferrine montre des différences de profil de méthylation entre souris traitées au DES et souris témoins chez les souris traitées durant le développement, mais non chez celles traitées à l’âge adulte.

Dans tous les cas, étant donné que le système endocrinien intègre les réponses à distance à travers des cellules, tissus et organes, une approche réductionniste qui se focaliserait seulement sur des composés isolés du circuit peut générer des réponses incomplètes et même erronées. La stratégie qui doit indéniablement être envisagée est une approche intégrative avec plusieurs tests complémentaires. L’EPA recommande d’ailleurs une batterie de tests à court et à long termes, in vitro et in vivo, qui évaluent à la fois les mécanismes d’action relayés par les récepteurs ou non, ainsi qu’un élément in vivo pour fournir une compétence métabolique. Bien sÛr, pour préciser le risque toxique, l’utilisation de batteries de tests doit être associée à une approche plus souple fondée sur l’étude et l’interprétation du mécanisme d’action de la substance, de son métabolisme et des circonstances d’exposition. Une autre action de l’EPA est le programme ToxCast™ [57], qui développe de nouvelles approches informatiques pour prédire la toxicité des produits chimiques grâce à des tests in vitro à haut débit. Le programme a généré des données sur 320 produits chimiques à partir de plus de 500 tests in vitro et de près de 75 observations in vivo. La puissante base de données ainsi générée devrait permettre de paramétrer le modèle informatique pour, in fine, prédire la toxicité sur l’organisme entier à partir de données simples in vitro (figure 5).

Conclusion générale

La problématique des PE continue à intéresser le grand public, les organismes réglementaires et les scientifiques. Cependant, dans la plupart des cas, un lien causal entre exposition environnementale à un produit chimique et effet indésirable chez l’homme via une perturbation endocrine n’est pas établi. C’est pourquoi des progrès doivent encore être faits dans la caractérisation des effets résultant d’une exposition à des PE. Les recherches doivent aussi se focaliser sur le développement de méthodes de tests pour plusieurs cibles potentielles. Enfin, il est nécessaire de caractériser les effets des mélanges, les effets à faibles doses et les effets après exposition à différentes périodes critiques de la vie.

Les récentes stratégies réglementaires de l’OCDE ont eu pour objectifs de définir une stratégie de tests par grades, de valider les tests de screening et les tests à court terme, et de modifier des lignes directrices existantes dans le but d’inclure la détection des PE. De nombreux tests ont également été développés, principalement à des fins mécanistiques. Dans certains cas, ils s’avèrent particulièrement utiles pour clarifier les mécanismes d’action et ainsi paramétrer des protocoles expérimentaux pour des investigations à un plus haut niveau. Cependant, leur champ d’applicabilité étant restreint, il est impossible de les utiliser seuls pour l’évaluation du risque.

Les avancées technologiques permettant de réaliser des tests de plus en plus sensibles et spécifiques, ainsi que les approches intégratives basées sur l’étude de plusieurs niveaux de complexité biologique, sont autant d’outils de prédiction pour évaluer la toxicité des PE. Dans tous les cas, il est fondamental de définir comment les informations fournies peuvent être utilisées pour l’identification du danger et, si possible, l’évaluation du risque. L’action fondamentale est donc d’organiser ces outils, en définissant une stratégie générale de screening et de tests qui permette une évaluation du risque optimale.

Remerciements et autres mentions

Financement : aucun ; conflits d’intérêts : aucun.

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