Figures
Figure 1
Les précurseurs du système CRISPR-Cas9 : les nucléases à doigts de zinc (ZFN, pour zing finger nucleases ) et les TALE nucléases (TALEN). A) Les ZFN sont composées de plusieurs doigts de zinc reconnaissants chacun 3 bases de l’ADN fusionnés au domaine nucléase de l’enzyme FokI. Ce dernier fonctionnant en dimère, il y a nécessité d’avoir une paire de ZFN pour obtenir une cassure double brin de l’ADN. B) Les TALEN sont composées de plusieurs répétitions TALE reconnaissant chacune une base de l’ADN fusionné au domaine nucléase de l’enzyme FokI. Ce dernier fonctionnant en dimère, il y a nécessité d’avoir une paire de TALEN pour obtenir une cassure double brin de l’ADN.
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Figure 2
Le système CRISPR-Cas9 est composé d’une nucléase, la protéine Cas9, recrutée à la séquence cible par un ARN guide reconnaissant une séquence de vingt bases d’ADN. Pour que la nucléase Cas9 coupe l’ADN il faut la présence des vingt bases complémentaires de l’ARN guide et celle de la séquence PAM directement en 3’. La cassure double brin formée aura lieu précisément trois bases en amont de la séquence PAM NGG pour la protéine Cas9 de S. pyogenes la plus communément utilisée.
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Figure 3
Mécanismes principaux de réparation des cassures double brin de l’ADN génomique. À la suite d’une cassure double brin, la cellule a plusieurs systèmes à sa disposition pour retrouver l’intégrité de son génome. Le système le plus utilisé est le NHEJ (pour non homologous end joining ), celui-ci permet une simple ligation des extrémités de la coupure. Ce système est très fiable mais peut être forcé avec l’utilisation de nucléases artificielles pour induire de petites mutations, indels, qui peuvent notamment changer le cadre de lecture d’un gène. Un autre système alternatif au NHEJ est utilisé, le a-EJ (pour alternative-end joining ),. Ce système permet une ligation des extrémités après leur dégradation pour révéler des microhomologies (2 à 6 pb) identiques sur chaque extrémités qui vont stabiliser le complexe. Il y a enfin la recombinaison homologue, qui n’est, elle, utilisée qu’en phase S et G2 du cycle cellulaire puisqu’elle nécessite la présence de la chromatide sœur pour en recopier les informations perdues après coupure. Ce système peut être forcé avec l’utilisation de nucléases artificielles et d’un ADN donneur permettant l’intégration d’une séquence exogène choisie.
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Authors
Laboratoire structure et instabilité des génomes,
Inserm U1154, CNRS UMR7196,
Museum national d’histoire naturelle,
43 rue Cuvier, Paris, France
The CRISPR-Cas9 system is bringing about a revolution in life sciences. This new type of nuclease allows to modify any genomic sequence of interest in a highly controlled fashion, similar to previous generations of artificial nucleases such as zinc finger and TALE nucleases but with unprecedented facility and efficiency. Following DNA cleavage, it is possible to trigger gene inactivation, insert point mutations or whole transgenes at any chosen position in the genome. From cultured cells to whole animals, for generating disease models to applications in agronomy, the impact of the CRISPR-Cas9 system keeps spectacularly extending. We review its origins and different applications as well as discuss the perspectives, limitations and questions raised by the novel possibilities for CRISPR-Cas9 mediated genome editing.