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Médecine thérapeutique

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Conduite à tenir devant une recherche d’anticorps antinucléaires positive Volume 4, issue 10, Décembre 1998

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La recherche d'anticorps antinucléaires est fréquemment prescrite en pratique quotidienne. Pour conduire une démarche diagnostique « efficace » quand cette recherche est positive, le clinicien est confronté à plusieurs difficultés au premier rang desquelles se trouve la faible valeur prédictive positive de cet examen biologique.

Noyau

Les anticorps antinucléaires sont dirigés contre des antigènes nucléaires. Une connaissance schématique de la structure nucléaire est indispensable pour bien comprendre la démarche diagnostique devant une recherche d'anticorps antinucléaires positive. La cible des auto-anticorps antinucléaires ayant déjà fait l'objet d'une revue dans ces colonnes [1], nous demanderons au lecteur de s'y reporter et rappellerons seulement certaines données essentielles. Le noyau est composé de deux structures biochimiques principales, les acides nucléiques ­ acide désoxyribonucléique (ADN) et acide ribonucléique (ARN) ­ et les protéines. Ces deux constituants sont schématiquement répartis au sein de cinq compartiments différents :
­ la membrane nucléaire, qui est composée de deux feuillets lipidiques. Le feuillet externe est en continuité avec le réticulum endoplasmique rugueux, le feuillet interne est tapissé de protéines fibrillaires, les lamines. Ils s'unissent de place en place pour former des pores nucléaires qui assurent la continuité entre le cytoplasme et le nucléoplasme. La paroi des pores est recouverte de glycoprotéines, comme la gp210 qui est un des antigènes cibles de la cirrhose biliaire primitive ;
­ le nucléoplasme est la fraction soluble où baigne la chromatine. Il contient des ARN de faible poids moléculaire (snRNA pour small nuclear RNA). Riches en uridine, ces ARN sont de plusieurs types (de U1 à U10). Ils se trouvent tous dans le nucléoplasme, à l'exception des ARN U3 situés dans le nucléole. À ces U-ARN sont souvent associées des protéines, solubles dans les tampons physiologiques, ces complexes formant les ribonucléoprotéines de faible poids moléculaire (small nuclear ribonucleoproteins, snRNP) comme l'antigène Sm, spécifique du lupus systémique, formé par les protéines B/B'et D liées aux U-ARN, ou l'antigène U1-RNP, antigène des connectivites mixtes, formé par l'association des protéines de 70 kDa A et C et des U1-ARN ;
­ la chromatine est constituée par la répétition d'une structure fondamentale, le nucléosome, et de protéines non histones comme les protéines HMG (high mobility group). Le nucléosome est composé par l'enroulement de 146 paires
de bases d'ADN autour d'un octamère protéique formé par les histones H2A, H2B, H3 et H4, chacune en deux exemplaires. Chaque structure nucléosomique est fermée par l'histone H1. De l'ADN double brin non lié aux histones (ADN de liaison) relie les nucléosomes entre eux ;
­ le nucléole est un organelle très riche en ARN. Il comporte une zone fibrillaire et une zone granulaire, et contient des protéines qui peuvent se lier aux ARN et former les small nucleolar ribonucleoproteins (snoRNP) ;
­ la matrice protéique qui forme la structure fibrillaire nucléaire.
D'autres structures nucléaires n'apparaissent que dans les cellules en mitose comme les centromères ou les fibres du fuseau mitotique.

Enfin, certaines structures cytoplasmiques sont issues du noyau comme les ARN de transfert (ARNt) ou des enzymes, les synthétases, qui, associées à ces ARNt, forment les ARNt synthéthases tel l'histidyl ARNt synthétase (antigène JO1 des myosites), ou encore des ribonucléoprotéines cytoplasmiques (appelées hYRNP pour human cYtoplasmic RNP) de faible masse moléculaire dont les plus connues sont les protéines Ro (SS-A) et La (SS-B), vis-à-vis desquelles des auto-anticorps sont retrouvés au cours du lupus systémique ou du syndrome de Gougerot-Sjögren.

Méthodes de détection des anticorps antinucléaires

Il est important de se référer aux techniques de détection des anticorps antinucléaires et d'intégrer leurs limites à la démarche clinique.

Dépistage

Le dépistage des anticorps antinucléaires se fait, généralement, par immunofluorescence indirecte (IFI) sur coupes de tissus congelés ou fixés, ou sur étalement de lignée cellulaires en culture (figure 1). Cette technique étudie la fixation des anticorps du sérum testé sur un noyau. Après incubation et lavage, les anticorps fixés sont révélés par des anticorps anti-immunoglobulines humaines marqués par la fluorescéine ou la rhodamine. Si un anticorps est dépisté il est ensuite titré. Le titre correspond à l'inverse de la dernière dilution du sérum du malade qui donne une fluorescence nucléaire positive. La recherche d'anticorps antinucléaires peut se faire également par ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ou par Western blot, techniques qui utilisent des antigènes purifiés mais qui sont rarement utilisées en première intention pour le dépistage des anticorps antinucléaires.

Limites de l'immunofluorescence

Les limites de l'immunofluorescence indirecte sont nombreuses.

Limites liées à la technique

Il existe une différence de sensibilité entre les différents types de substrats utilisés pour la détection des anticorps antinucléaires [2]. La détection est plus sensible sur cellules
HEp-2 que sur coupes de tissu (foie de rat). Les cellules HEp-2 sont des cellules larges, se disposant en culture en monocouche, avec de grands noyaux, de grands nucléoles et des cytoplasmes bien étalés. De plus, ces cellules étant en culture, leur utilisation permet de dépister des anticorps dirigés contre des antigènes qui ne s'expriment qu'au cours de la mitose comme les centromères, le proliferating cellular nuclear antigen (PCNA), l'antigène nuclear mitotic apparatus protein ou l'antigène mitotic spindle antigen. Pour cette raison, l'interprétation des résultats doit prendre en compte le type cellulaire utilisé pour la détection et il est souhaitable de préférer les techniques utilisant des cellules HEp-2.
Le milieu de culture cellulaire contient des protéines qui peuvent être reconnues par les anticorps du patient et peuvent donner des fixations aspécifiques. Il est souhaitable que le tampon de dilution des sérums contienne les mêmes protéines que celles du milieu de croissance cellulaire afin de diminuer ces réactions non spécifiques.

L'absence d'individualisation des différents auto-antigènes reconnus par la technique d'immunofluorescence indirecte constitue une de ses limites majeures. Ce test ne permet pas de déterminer l'antigène nucléaire reconnu par les auto-anticorps ; l'aspect de la fluorescence nucléaire n'a qu'une valeur d'orientation. En effet, le substrat présenté est le noyau dans sa globalité, il est donc impossible de savoir quel est l'antigène nucléaire reconnu par les auto-anticorps du patient et il sera nécessaire, en fonction de l'orientation clinique, de compléter le test de dépistage des anticorps antinucléaires par un ou des examens plus spécifiques utilisant un ou des antigènes nucléaires purifiés. De plus, certaines populations d'auto-anticorps peuvent donner des aspects de fluorescence différents selon les conditions techniques de leur détection. Par exemple, les anticorps antichromatine peuvent donner une fluorescence périnucléolaire (reconnaissance de la chromatine périnucléolaire) ou homogène (chromatine). Par ailleurs, il n'est pas rare que des anticorps antinucléaires de spécificité antigénique différente coexistent au sein d'un même sérum. L'aspect de la fluorescence nucléaire est alors la résultante de cette double (ou multiple...) population d'auto-anticorps. Par exemple, la surimpression de deux anticorps antinucléaires peut transformer un aspect homogène, aux fortes concentrations de sérum, en un aspect moucheté à des dilutions plus faibles. Enfin, certaines populations d'anticorps ou d'antigènes nucléaires n'ont été identifiées que récemment [3], l'aspect de fluorescence nucléaire lié à la présence de ces anticorps n'étant, de ce fait, connu que depuis peu. C'est par exemple le cas des anticorps dirigés contre des épitopes quaternaires du nucléosome, qui peuvent donner une fluorescence mouchetée ou homogène.

Limites liées à l'opérateur

L'expérience de l'opérateur est une des limites majeures des techniques d'immunofluorescence. Théoriquement, l'immunofluorescence indirecte pourrait permettre d'orienter vers de très nombreux antigènes nucléaires mais il est rare que la répartition cellulaire fine de la fluorescence soit indiquée.

Le clinicien et la recherche d'anticorps antinucléaires positive

Il est impossible de résumer la multiplicité des situations auxquelles le clinicien doit faire face devant une recherche d'anticorps antinuclaires positive. Afin d'insister sur les éléments qui nous paraissent déterminants pour la démarche diagnostique, nous avons artificiellement séparé le raisonnement médical en plusieurs étapes.

Première étape

Seuil de positivité

La première question que le praticien peut se poser est celle de la signification réelle du résultat. En d'autres termes, celui-ci mérite-t-il une enquête étiologique approfondie ? Compte tenu des variations méthodologiques entre les différents laboratoires, il est difficile d'être formel. Une étude internationale récente [4] comparant les résultats de recherche d'anticorps antinucléaires sur HEp-2 entre un groupe de sujets sains et un groupe de patients atteints de maladies auto-immunes systémiques a montré que la recherche d'anticorps antinucléaires était positive chez 31,7 % des sujets normaux à la dilution 1/40, chez 5 % à la dilution 1/160 et 3,3 % à la dilution 1/320. Cette étude souligne l'importance d'avoir un titrage des anticorps antinucléaires ­ effectué par la quasi-totalité des laboratoires ­ une dilution au 1/160 paraissant être un seuil raisonnable distinguant les sérums de sujets sains de ceux des patients atteints de maladies auto-immunes. Le titrage des anticorps antinucléaires, notamment pour les titres faibles, doit toujours être modulé en fonction de l'examen clinique ; un titre faible (1/80) dans un contexte clinique évocateur conserve une valeur diagnostique forte mais cette situation est exceptionnelle. L'âge du sujet est également un élément déterminant dans l'interprétation du titre seuil entre sujets sains et malades, car la fréquence des anticorps antinucléaires augmente chez le sujet sain après la 6e décennie.

Aspect de la fluorescence

La détection des anticorps antinucléaires par immunofluorescence indirecte ne permet pas d'identifier formellement l'antigène reconnu par les auto-anticorps. L'aspect de la fluorescence revêt néanmoins une valeur d'orientation vis-à-vis de la spécificité antigénique détectée [5]. Elle donne une orientation diagnostique mais cette donnée est dépendante de l'opérateur. En pratique, l'aspect moucheté, homogène, périnucléaire ou nucléolaire n'est pas d'un apport diagnostique majeur, sauf pour la fluorescence nucléolaire évocatrice de sclérodermie. Sur l'aspect de la fluorescence, certains laboratoires font d'ailleurs systématiquement la recherche d'un ou de plusieurs auto-anticorps par des techniques utilisant comme substrats des autoantigènes purifiés. C'est par exemple le cas des anticorps nucléaires solubles (anti-Sm, anti-SCL70, anti-RNP, anti-SSB) qui sont souvent recherchés directement devant une fluorescence mouchetée.

Deuxième étape

La recherche d'anticorps antinucléaires par immunofluorescence indirecte peut être positive dans un éventail de situations physiologiques ou pathologiques très large. Les plus fréquentes sont indiquées dans l'encadré. La démarche diagnostique débutera par un examen clinique complet, afin de réunir les arguments permettant d'orienter le diagnostic vers les maladies pouvant s'accompagner d'anticorps antinucléaires : maladies auto-immunes systémiques en premier, infections virales chroniques... Les éléments importants sont :

­ l'âge et le sexe. Nombre de maladies auto-immunes affectent la femme jeune. La découverte d'anticorps antinucléaires dans ce contexte a un intérêt diagnostique majeur et justifie une enquête étiologique approfondie. À l'inverse, leur découverte chez un sujet âgé est de peu d'intérêt en dehors d'un contexte clinique évocateur. Rappelons ici la présence d'anticorps antinucléaires à des titres parfois élevés chez des sujets sains âgés de plus de 60 ans ;
­ les antécédents familiaux, notamment de maladies auto-immunes. Ils sont fondamentaux car ils peuvent orienter la démarche diagnostique. Il ne faut cependant pas oublier que les apparentés sains de patients ayant une maladie auto-immune systémique ont des anticorps antinucléaires avec une fréquence plus élevée qu'une population contrôle ;
­ les médicaments. Certains, notamment les bêtabloquants, sont susceptibles d'induire des anticorps antinucléaires sans manifestations cliniques. Cette situation reste toutefois un diagnostic d'exclusion ;
­ l'exposition à certains virus, de l'immunodéficience humaine et de l'hépatite C, doit impérativement être connue car ces deux infections chroniques s'accompagnent souvent d'anticorps antinucléaires.
L'examen physique complet orientera vers les grandes séries de causes :
­ maladies auto-immunes systémiques (éruption cutanéo-muqueuse, polyarthrite, syndrome sec, syndrome de Raynaud, présence d'une protéinurie...) ;
­ maladies virales ;

­ cancers hématologiques et solides.

Troisième étape

Schématiquement, on peut considérer que, au terme des deux étapes précédentes, le clinicien est confronté à trois types de situations.

Diagnostic certain

Aucun examen supplémentaire à visée diagnostique n'est en théorie nécessaire. La recherche de certains anticorps antinucléaires de haute spécificité permet souvent de conforter le diagnostic et de déterminer la cible nucléaire reconnue par les anticorps antinucléaires. Ce sera, par exemple, le cas d'une recherche d'anticorps anti-Sm devant des anticorps antinucléaires donnant une fluorescence mouchetée, ou d'anticorps anti-ADN double brin devant une fluorescence homogène, dans un contexte clinique évocateur de lupus érythémateux systémique. Un diagnostic de syndrome CREST (calcifications sous-cutanées, syndrome de Raynaud, atteinte œsophagienne, sclérose cutanée, télangiectasies) pourra être envisagé devant l'association d'un syndrome de Raynaud à des anticorps anticentromères.

Diagnostic probable

Il faut essayer de confirmer le diagnostic en recherchant des anticorps antinucléaires spécifiques. La suite de ces examens sera guidée par l'examen clinique mais en gardant en mémoire que plusieurs maladies auto-immunes peuvent être associées. Il sera nécessaire de privilégier, pour les différents antigènes nucléaires, des tests de haute spécificité. En cas de suspicion de lupus érythémateux systémique, on recherchera des anticorps anti-ADN naturels par immunofluorescence indirecte sur Crithidia luciliae, ou par méthode radio-immunologique (test de Farr). La recherche des anticorps anti-Sm, hautement spécifiques du lupus érythémateux systémique, sera effectuée par immunodiffusion en gélose ou par ELISA. La recherche d'anticorps anti-SCL70 sera demandée en cas de suspicion de sclérodermie systémique. Si la recherche de ces anticorps nucléaires spécifiques est positive par une méthode spécifique, le diagnostic sera alors extrêmement probable. Si ces anticorps spécifiques sont absents, il faut garder en mémoire la possibilité d'être confronté à une maladie auto-immune systémique avec anticorps antinucléaires positifs sans qu'il soit possible de caractériser les antigènes nucléaires reconnus. C'est par exemple le cas du lupus érythémateux systémique où de 20 à 40 % des patients ont des anticorps antinucléaires sans anticorps anti-ADN naturels.

Confrontation des données cliniques et de l'immunofluorescence indirecte ne débouchant pas sur un diagnostic

Il s'agit du cas de figure le plus difficile. La poursuite des investigations dépend essentiellement du terrain. Chez un sujet jeune, a fortiori de sexe féminin, il est recommandé de rechercher des anticorps antinucléaires de plus grande spécificité dans un cadre pathologique donné. S'il existe des anticorps antinucléaires de forte spécificité, par exemple anticorps anti-ADN naturels ou anti-Sm, on cherchera des éléments diagnostiques essentiellement biologiques comme le dosage du complément, la recherche d'une anémie hémolytique avec test de Coombs positif, d'une lymphopénie ou d'une protéinurie dans le cas d'un lupus érythémateux systémique. Des examens simples non spécifiques permettront également d'orienter la démarche diagnostique. Par exemple l'élévation des créatine phosphokinases avec anticorps antinucléaires positifs orientera le clinicien vers une myopathie auto-immune ou une cholestase biologique vers une cirrhose biliaire primitive. Dans ces deux cas, la recherche d'anticorps spécifiques ­ anti-ARNt synthétase pour les myosites ou anti-gp210 pour la cirrhose biliaire primitive dont sont, par ailleurs, caractéristiques les anticorps antimitochondries (antipyruvate déshydrogénase) ­ permettra alors d'étayer le diagnostic (figure 2).
Plus rarement, on recherchera des maladies non auto-immunes avec anticorps antinucléaires. Il faudra éliminer celles qui ont une expression clinique limitée comme l'hépatite C. S'il s'agit d'un sujet âgé, on recherchera en premier lieu une prise de médicaments inducteurs.

En l'absence de cause identifiée, il faudra demander au patient de reconsulter en cas de nouveau symptôme.

ENCADRÉ

Principales causes d'élévation des anticorps antinucléaires
 
Maladies auto-immunes non spécifiques d'organes :
­ lupus érythémateux systémique ;
­ sclérodermie ;
­ connectivite mixte ;
­ syndrome de Gougerot-Sjögren ;
­ myopathies inflammatoires ;
­ polyarthrite rhumatoïde.

Maladies auto-immunes spécifiques d'organes :
­ cirrhose biliaire primitive ;
­ hépatites auto-immunes ;
­ thyroïdites ;
­ myasthénie ;
­ sclérose en plaques.

Infections virales :
­ VIH ;
­ hépatite C ;
­ parvovirus B19 ;
­ mononucléose infectieuse.

Cancers :
­ lymphomes ;
­ leucémies lymphoïdes chroniques, Waldenström ;
­ leucémies aiguës ;
­ syndromes myéloprolifératifs ;
­ cancer de l'ovaire, du poumon, du sein, du rein, mélanomes.

Autres maladies :
­ vascularites systémiques ;
­ colites inflammatoires ;
­ cirrhose éthylique ;
­ sarcoïdose ;
­ fibrose pulmonaire idiopathique ;
­ asbestose ;
­ insuffisance rénale terminale ;
­ après transplantation d'organes.

Principaux médicaments :
­ bêtabloquants ;
­ isoniazide ;
­ sulfasalazine ;
­ quinidiniques ;
­ D-pénicillamine ;
­ procaïnamide ;
­ chlorpromazine ;
­ minocycline ;
­ interféron.

Sujets sains :
­ âge supérieur à 60 ans ;
­ apparentés des sujets avec maladies auto-immunes.

CONCLUSION

Le test de détection des anticorps antinucléaires a une faible spécificité. Le clinicien doit s'efforcer de trouver des éléments discriminants tirés de l'examen clinique et de l'analyse de la détection des anticorps antinucléaires par immunofluorescence indirecte afin de déterminer au mieux la stratégie diagnostique.