Nitric oxide and regul ation of platelet activity

ARTICLE

Durant ces quinze dernières années, un intérêt croissant a été accordé à la fonction plaquettaire dans la pathogénie des accidents ischémiques coronaires ou cérébraux. Ainsi, les plaquettes se sont révélées avoir un rôle prééminent dans l'angor instable, l'infarctus du myocarde et la mort subite [1, 2]. Ceci a suscité un important engouement pour l'étude de la fonction plaquettaire et des agents inhibant l'activité des plaquettes [3].

En 1981, Furchgott et Zawadzki ont démontré que la présence d'un endothélium intact était indispensable à l'activité vasodilatatrice de l'acétylcholine, et que cet effet était secondaire à la libération de ce qu'ils ont nommé endothelium-derived relaxing factor (EDRF) [4]. L'EDRF s'est rapidement révélé posséder une activité anti-agrégante plaquettaire sur des cultures de cellules endothéliales humaines [5]. Quoique l'identification de la ou des substances reste incertaine, l'activité de l'EDRF semble pouvoir être essentiellement attribuée au monoxyde d'azote [6, 7] ou à un composant dérivé, la S-nitrosocystéine [8]. En effet, l'EDRF et le monoxyde d'azote possèdent des propriétés biologiques et pharmacologiques similaires ; de plus, l'endothélium libère une quantité suffisante de monoxyde d'azote pour induire les effets biologiques attribués à l'EDRF [6, 9]. Parallèlement à ses propriétés vasodilatatrices, le monoxyde d'azote possède une activité anti-adhésive, anti-agrégante, voire même désagrégante plaquettaire in vivo et in vitro [10, 11].

Par ailleurs, le mécanisme d'action responsable des activités biologiques et pharmacologiques des dérivés nitrés, du nitroprussiate de sodium et des sydnonimines, longtemps inconnu, a été récemment attribué à la capacité qu'ont ces molécules de libérer du monoxyde d'azote spontanément ou après conversion enzymatique [9].

Nous étudierons successivement, dans un premier temps, la synthèse endogène du monoxyde d'azote et son rôle sur la fonction plaquettaire puis, dans un second temps, l'apport exogène du monoxyde d'azote, que ce soit par administration de molécules libérant du monoxyde d'azote ou par inhalation de monoxyde d'azote sous forme gazeuse.

Mécanismes d'action

Le monoxyde d'azote semble essentiellement agir par stimulation de la guanylate cyclase qui entraîne la formation, à partir de guanosine triphosphate (GTP), de guanosine monophosphate cyclique (GMPc) responsable des effets vasodilatateurs observés [11]. Mellion et al. [11, 12] ont, récemment, mis en évidence que le monoxyde d'azote et les donneurs de monoxyde d'azote induisent une augmentation de l'activité de la guanylate cyclase et des concentrations de GMPc intracellulaire proportionnelle à l'effet anti-agrégant plaquettaire. Cet effet est augmenté par l'adjonction de Zaprinast, un inhibiteur spécifique des phosphodiestérases (type V) responsables de la dégradation de la GMPc. De plus, l'adjonction du composé lipophilique 8 bromo-GMPc, analogue structurel de la GMPc, induit également une inhibition partielle de l'agrégation plaquettaire [12]. L'augmentation de la GMPc intracellulaire semble donc être l'élément central de cette inhibition par stimulation d'une protéine kinase qui provoque la phosphorylation des protéines-cibles (protéine 46/50 kDa) [13], inhibe la phospholipase C [14,15] et diminue la concentration de calcium intracellulaire. Cette dernière apparaît essentiellement liée à une inhibition de la pénétration de calcium extracellulaire [16]. Le S-nitroso-N-acétylcystéine, un monoxyde d'azote donneur, inhibe l'expression de certains récepteurs membranaires tels que la glycoprotéine (Gp) IIb/IIIa, protéine responsable de la fixation « en maille » du fibrinogène, et de la P-sélectine, une protéine des granules alpha exprimée par les plaquettes activées, agissant comme récepteur responsable de l'interaction plaquettes-leucocytes [17].

Cependant, le monoxyde d'azote semble pouvoir également exercer des effets biologiques indépendants de la génération de GMPc. En effet, le monoxyde d'azote paraît participer à la régulation des signaux de transduction médiés par l'adénosine diphosphate (ADP)-ribosylation plaquettaire [18]. Néanmoins, l'importance physiologique de ces mécanismes, dits GMPc indépendants, sur la fonction plaquettaire reste à évaluer.

Le monoxyde d'azote d'origine endogène

L'interaction endothélium-plaquettes joue un rôle fondamental dans le maintien de l'hémostase vasculaire. De nombreux médiateurs, produits tant par l'endothélium que par les plaquettes, jouent un rôle fondamental dans le maintien d'un bon équilibre hémostatique [19]. La thrombose apparaît comme un processus dynamique avec une activité procoagulante, par activation plaquettaire et formation de fibrine, contrebalancée par une activité anticoagulante physiologique, fibrinolytique et inhibitrice de l'activité plaquettaire. De nombreux médiateurs, tels que le thromboxane A2, la prostacycline, la sérotonine, le facteur activateur plaquettaire (PAF), la thrombine, l'adénosine diphosphate et enfin le monoxyde d'azote, ont été impliqués dans le maintien de cet équilibre [19]. Deux types de sécrétion de monoxyde d'azote endogène modulant l'activité plaquettaire ont été décrits, l'un paracrine (monoxyde d'azote produit à l'extérieur des plaquettes, en particulier dans les cellules endothéliales) et l'autre autocrine (monoxyde d'azote produit par les plaquettes) (figure).

Le système enzymatiqueresponsable de la synthèse de monoxyde d'azote

C'est par la transformation d'une molécule de L-arginine en L-citrulline avec incorporation d'une molécule d'oxygène qu'est produite une molécule de monoxyde d'azote. La L-citrulline est alors recyclée en L-arginine après incorporation d'une molécule d'azote. Cette biosynthèse de monoxyde d'azote est catalysée par une enzyme, la NO synthase, dont on connaît trois isoformes : les plus importantes, rencontrées dans le système vasculaire, sont l'isoforme constitutive et l'isoforme inductible [9].

Les isoenzymes constitutives sont des homodimères trouvés sous forme soluble et particulaire dans la cellule endothéliale et dans le cytosol plaquettaire ; leur activité enzymatique est dépendante du calcium et de la calmoduline. La stimulation des récepteurs de la cellule endothéliale par un médiateur (plaquettaire par exemple, tel que la thrombine, l'adénosine diphosphate, la sérotonine) induit une augmentation du calcium intracytosolique qui active l'isoforme constitutive de la NO synthase pour aboutir à la production de monoxyde d'azote [11]. Ce dernier va diffuser pour activer la guanylate cyclase des plaquettes avoisinantes (figure) qui exerce un rétrocontrôle sur l'activité plaquettaire.

L'isoforme inductible de la NO synthase est fonctionnellement indépendante du calcium et peut être exprimée par différents types de cellules tels que macrophages, polynucléaires neutrophiles, cellules endothéliales et cellules musculaires lisses, après stimulation par des endotoxines et des cytokines. L'expression de l'isoforme inductible de la NO synthase implique une synthèse protéinique de novo qui peut être inhibée, au moins en partie, par l'administration de corticoïdes [20]. Curieusement, les plaquettes, éléments anucléaires, sont également capables d'exprimer cette isoenzyme après stimulation par des cytokines [21].

Régulation de l'activation plaquettaire

La sécrétion paracrine de monoxyde d'azote par l'endothélium vasculaire permet de réguler l'état d'activation des plaquettes ; celui-ci est assuré de façon concomitante par d'autres inhibiteurs de la fonction plaquettaire tels que la prostacycline et l'activateur du plasminogène tissulaire [22, 23]. De plus, les leucocytes pourraient également être à l'origine d'une synthèse paracrine de monoxyde d'azote [24].

L'importance physiopathologique de la synthèse autocrine reste difficile à établir. Comme nous l'avons déjà souligné plus haut, les plaquettes ont la capacité de produire du monoxyde d'azote, ce qui avait été montré lors de l'agrégation plaquettaire induite par du collagène, de l'adénosine diphosphate ou de l'acide arachidonique [25, 26]. Ainsi, l'adjonction d'inhibiteurs de l'isoforme constitutive de la NO synthase potentialise les effets proagrégants de l'adénosine diphosphate et de l'acide arachidonique. Il apparaît donc probable que la synthèse de monoxyde d'azote intraplaquettaire puisse jouer un rôle sur son propre niveau d'activation.

Rôle de la synthèse de monoxyde d'azote in vivo

L'importance de la fonction endothéliale sur le niveau d'activité plaquettaire in vivo a été montrée sur des modèles expérimentaux ; ainsi, l'administration de N^G-monométhyl-L-arginine (L-NMMA), un analogue structural de la L-arginine inhibiteur compétitif de la synthèse endogène de monoxyde d'azote, induit des variations cycliques du débit coronaire dont l'endothélium vasculaire a été au préalable endommagé [27], ce qui témoigne d'une augmentation de l'activation plaquettaire [28]. De plus, l'administration concomitante de L-arginine au L-NMMA inhibe cet effet [27].

De même, Golino et al. [29] ont montré, sur un modèle de variations cycliques de flux carotidien chez le lapin, que ces variations, une fois induites, pouvaient être abolies par l'administration d'acétylcholine (agissant par la libération endothéliale d'EDRF) ou l'administration d'une solution contenant du monoxyde d'azote. Inversement, les effets bénéfiques de l'acétylcholine étaient supprimés par l'administration concomitante de L-NMMA, ce qui confirme que la formation endothéliale de monoxyde d'azote était bien responsable de l'activation plaquettaire observée. De plus, l'administration chronique de L-arginine permet de réduire l'épaississement intimal et augmente la vasorelaxation induite par l'administration d'acétylcholine dans un modèle de resténose après traumatisme endothélial [30].

Administration exogène par des NO donneurs

Dès 1967, Hampton et al. ont montré que les dérivés nitrés exerçaient des effets antiplaquettaires in vitro après activation à l'adénosine diphosphate [31]. Ce n'est que plus récemment que le mécanisme d'action des dérivés nitrés, sydnonimines et nitroprusside a été lié à leur capacité de libérer du monoxyde d'azote [6, 32, 33].

Les dérivés nitrés

Ces molécules libèrent peu de monoxyde d'azote spontanément in vitro et nécessitent la présence de molécules porteuses d'un radical thiol (par exemple, la N-acétylcystéine) pour accroître cette libération. L'incubation de nitroglycérine en présence de cellules musculaires lisses potentialise l'inhibition plaquettaire [33], probablement par l'existence d'un système enzymatique qui reste à identifier, localisé à la surface membranaire du tissu vasculaire et absent de la surface plaquettaire [34]. Ainsi, in vivo, la libération de monoxyde d'azote par les dérivés nitrés est donc grandement facilitée par la présence de ce système enzymatique et par l'adjonction de molécules porteuses d'un groupement thiol. Néanmoins, l'apparition d'une tolérance peut diminuer l'activité des dérivés nitrés et les causes de cette tolérance ne sont pas univoques [35]. Ainsi, l'adjonction de N-acétylcystéine était supposée prévenir l'apparition du phénomène de tolérance, mais cela a récemment été remis en question [36]. Cette tolérance aux dérivés nitrés, dûment prouvée sur leurs effets hémodynamiques, reste difficile à établir sur la fonction plaquettaire ; néanmoins, la diminution des capacités de synthèse de GMPc intraplaquettaire, après un traitement prolongé par des dérivés nitrés, peut constituer un élément indirect, supportant l'hypothèse de l'existence d'un tel phénomène de tolérance sur les effets anti-agrégants plaquettaires des dérivés nitrés [37].

Les dérivés nitrés ont été montrés capables d'exercer des effets antiplaquettaires in vivo ou ex vivo. Ainsi, la trinitrine inhibe les variations cycliques du débit coronaire imputables à la formation d'agrégats plaquettaires sur des modèles canins d'angor instable [38] ou de thrombolyse [39]. De plus, chez le volontaire sain, l'administration de dérivés nitrés inhibe l'agrégation plaquettaire ex vivo [40, 41]. Dans toutes ces études, une hypotension artérielle systémique était associée à l'effet antiplaquettaire.

Sodium nitroprusside, sydnonimines et autres donneurs de monoxyde d'azote

Ces molécules peuvent libérer du monoxyde d'azote sans transformation enzymatique préalable. Leur activité antiplaquettaire in vitro est connue de longue date [9] et a été récemment mise en évidence in vivo. Ainsi, le sodium nitroprusside et la molsidomine sont capables d'inhiber la formation de thrombus, d'augmenter l'efficacité d'un thrombolytique ou d'éviter les variations cycliques du débit coronaire observées dans des modèles d'angor instable [42, 43]. Chez l'homme, l'administration de S-nitroso-N-acétylcystéine (SNAP) intracoronaire inhibe l'augmentation de l'expression des récepteurs membranaires Gp IIb/IIIa et de la P-sélectine normalement observée lors d'une angioplastie coronaire percutanée [44].

Inhalation de NO

L'inhalation de monoxyde d'azote sous sa forme gazeuse a été utilisée en premier lieu dans l'hypertension artérielle pulmonaire comme vasodilatateur sélectif de la circulation pulmonaire sans provoquer d'hypotension artérielle systémique concomitante [45-47]. En effet, le monoxyde d'azote a une demi-vie très courte (environ 2 secondes) ; il est très rapidement dégradé au contact de l'hémoglobine, expliquant ainsi une action locale sélective du gaz monoxyde d'azote inhalé. Ceci a été mis à profit dans le syndrome de détresse respiratoire aigu de l'adulte : de par sa sélectivité, le monoxyde d'azote inhalé permet d'améliorer le rapport ventilation-perfusion sans hypotension artérielle systémique associée [47]. Des études cliniques sont actuellement en cours pour déterminer les risques/bénéfices liés à l'administration de cette drogue.

Plus récemment, il a été suggéré que l'inhalation de monoxyde d'azote pourrait être responsable d'une augmentation très modérée du temps de saignement chez le lapin et chez le volontaire sain [48, 49]. De plus, l'inhalation de monoxyde d'azote chez des patients présentant un syndrome de détresse respiratoire aigu provoque, ex vivo, une diminution de l'agrégation plaquettaire sans toutefois affecter le temps de saignement [50].

Cet effet antiplaquettaire peut se révéler utile en pathologie cardiovasculaire. En effet, l'administration de monoxyde d'azote par inhalation permet d'inhiber la prolifération intimale induite par un traumatisme de l'endothélium carotidien chez le rat [51] et augmente la perméabilité après thrombolyse dans un modèle canin d'infarctus du myocarde [52] sans allongement du temps de saignement. Surtout, il n'a pas été observé d'hypotension artérielle systémique concomitante, ce qui appraît inéluctable lors de l'administration de dérivés nitrés aux doses utilisées pour obtenir un effet antithrombotique [53].

Le gaz monoxyde d'azote inhalé paraît donc, sans induire d'hypotension artérielle systémique, exercer un effet antithrombotique dont la durée semble pouvoir persister jusqu'à une demi-heure après l'arrêt de l'administration [52]. L'intérêt d'une utilisation de gaz monoxyde d'azote comme agent antithrombotique en pathologie cardiovasculaire humaine reste à déterminer.

En conclusion, les effets antithrombotiques du monoxyde d'azote, qu'il soit d'origine endogène ou exogène, paraissent bien établis, que ce soit in vitro mais surtout également in vivo. Il reste à déterminer le rôle et l'importance respective des effets antiplaquettaires et de l'effet vasodilatateur, potentiellement bénéfique localement, mais surtout potentiellement délétère par l'hypotension artérielle qu'induit l'administration intraveineuse de donneur de monoxyde d'azote. L'inhalation de monoxyde d'azote par l'inhibition plaquettaire qu'il induit, sans hypotension artérielle associée, pourrait être une solution thérapeutique intéressante.

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