Clinical applications of the detection of activated platelets using flow cytometry

ARTICLE

Les plaquettes sanguines sont fortement impliquées dans les syndromes ischémiques artériels. Elles sont responsables de la formation de thrombus dans la circulation, en particulier au niveau de fissuration de plaques d'athérosclérose, et, de ce fait, impliquées dans les pathologies coronaires et les accidents vasculaires cérébraux [1-3]. Dans les pathologies veineuses, on recherche des stigmates d'état thrombotique ou préthrombotique en analysant l'activation des facteurs de coagulation ; une démarche semblable concerne la recherche d'une activation plaquettaire permettant d'évaluer un état préthrombotique artériel ou une thrombose constituée.

Différents tests ont été utilisés successivement au cours de ces dernières années pour identifier une activation plaquettaire in vivo : une étape importante a été le dosage de la b-thromboglobuline et du facteur 4 plaquettaire dans le plasma [4, 5]. Ces protéines étant contenues uniquement dans les granules a plaquettaires, leur présence dans le plasma devait en théorie refléter une sécrétion plaquettaire et donc constituer un signe d'activation. Cette théorie s'est heurtée aux difficultés pratiques d'obtenir des plasmas témoins à la fois dépourvus en plaquettes et ne contenant ni b-thromboglobuline, ni facteur plaquettaire 4. Cette méthode n'a pas eu une très grande divulgation mais continue à être utilisée. Une autre technique a également permis de confirmer la participation plaquettaire dans les phénomènes ischémiques coronaires : il s'agit du dosage des métabolites du thromboxane A2 dans les urines, dont la présence signe une activation plaquettaire in vivo [6, 7].

L'avènement de la cytométrie en flux et la possibilité d'utiliser un grand nombre d'anticorps monoclonaux ont permis de nouvelles approches pour identifier un état d'activation plaquettaire. De plus, il s'agit d'une méthode qui permet d'obtenir des résultats rapidement et qui nécessite des quantités de sang minimes. Avec cette nouvelle technique s'ouvrent de larges perpectives d'exploration clinique des pathologies thrombotiques, d'autant plus que l'on assiste à l'équipement progressif des laboratoires d'hémostase en cytomètre en flux.

Anticorps monoclonaux servant à la détection des plaquettes activées

Les plaquettes sanguines présentent à leur surface un grand nombre de glycoprotéines qui sont responsables des principales fonctions plaquettaires. L'activation plaquettaire entraîne la modification du profil membranaire en glycoprotéines qui change de nature et de niveau d'expression par le biais de translocations entre compartiment intracytoplasmique et surface membranaire, ou encore à cause de modifications conformationnelles [8-11] (figure 1).

Les plaquettes qui ont subi le phénomène d'activation avec sécrétion expriment à leur surface plusieurs nouvelles glycoprotéines. La P-sélectine en est l'exemple le plus étudié. Absente de la surface des plaquettes non activées, elle n'apparaît dans cette localisation qu'après activation accompagnée de sécrétion. Il s'agit d'une glycoprotéine (GP) présente sur la membrane des granules a et celle des granules denses de plaquettes non activées [12-14]. Lorsque l'activation plaquettaire est accompagnée de sécrétion, il y a formation de vésicules de sécrétion qui fusionnent avec le système canaliculaire connecté à la surface (SCCS), ce qui permet la diffusion de la P-sélectine à la surface plaquettaire. Cette propriété a été utilisée depuis longtemps pour identifier une activation plaquettaire. Les anticorps dirigés contre la P-sélectine (ex : S12, VH10) ont été parmi les premiers utilisés dans l'investigation clinique pour la détection d'un phénomène d'activation [10]. Les propriétés de la P-sélectine sont maintenant bien connues : il s'agit d'un récepteur membranaire ayant pour ligand le sialyl Lewis X, substance présente à la surface des granulocytes et en faible quantité sur celle des lymphocytes [13, 14], responsable d'une interaction entre plaquettes et globules blancs. D'autres marqueurs granulaires sont décrits comme les LAMP-1 et 2, qui sont des protéines communes aux membranes des lysosomes et aux granules denses et dont l'expression à la surface plaquettaire constitue un stigmate d'activation plaquettaire [15, 16]. La granulophysine d'abord décrite sur la membrane des granules denses a aussi été trouvée sur la membrane des granules a : ceci montre des homologies importantes dans la composition membranaire entre organites intracellulaires ayant des contenus très différents [14]. Ces glycoprotéines apparaissent à la surface plaquettaire après la P-sélectine dans la cinétique de la sécrétion. Des protéines adhésives contenues dans les granules a se fixent à la surface plaquettaire au cours de la sécrétion : ce sont par exemple la thrombospondine (TSP) [17] ou encore le fibrinogène [18], molécules impliquées dans l'agrégation plaquettaire. L'absence de thrombospondine dans le milieu plasmatique a conduit à utiliser des anticorps anti-TSP comme détecteur d'un phénomène d'activation plaquettaire ayant eu lieu in vivo.

GP IIb-IIIa et GP Ib-IX-V sont des complexes majeurs respectivement impliqués dans l'agrégation et l'adhésivité plaquettaires pour lesquels on observe des modifications quantitatives d'expression lors de l'activation [10, 18]. GP IIb-IIIa fait partie de la famille des intégrines de la sous-classe des cytoadhésines. Le nombre de copies par plaquette est très important, de l'ordre de 50 000 ; les anticorps qui sont utilisés pour le détecter sont dirigés contre chacune des sous-unités (GP IIb, Tab, SZ22 ; GP IIIa, AP-3) ou sont spécifiques d'épitopes du complexe (AP-2, P2, 7E3). Le nombre de copies du complexe augmente quand les plaquettes sont activées, par exemple par la thrombine ou le collagène qui entraînent une sécrétion avec une extériorisation du pool interne qui vient renforcer le pool membranaire [18]. En revanche, une activation par l'adénosine diphosphate s'accompagne pas d'une augmentation du nombre de GP IIb-IIIa. GP Ib-IX-V constitue le récepteur du facteur von Willebrand ; il est responsable de l'adhésivité des plaquettes dans la microcirculation [11]. Le nombre de copies par plaquette est d'environ 25 000 ; des anticorps existent dirigés contre chacun des composants (GP Ib AP-1, Bx-1, 6D1; GP IX, FMC 25 ; GP V, SW 16) et l'activation plaquettaire par la thrombine ou l'adénosine diphosphate entraîne une diminution de l'expression de GP Ib-IX-V à la surface plaquettaire.

En parallèle avec ces modifications quantitatives, on observe des modifications qualitatives de l'expression de GP IIb-IIIa [19-21]. En effet, ce complexe subit des modifications conformationnelles lors de l'activation avec expression de nouveaux épitopes qui sont reconnus par des anticorps spécifiques. Ces modifications sont liées à ses fonctions de récepteur responsable de l'agrégation plaquettaire par la fixation de protéines adhésives comme le fibrinogène ou le facteur von Willebrand. Certains de ces anticorps, comme PAC-1, reconnaissent les mêmes épitopes exprimés lors de l'activation que le fibrinogène [19]. PAC-1 reconnaît donc des épitopes « activation-dépendants non occupés ». Un autre groupe d'anticorps va reconnaître des modifications conformationnelles liées à la fixation des protéines adhésives à la surface plaquettaire, ce sont les anti-LIBS (ligand-induced binding site) et les anti-RIBS (receptor-induced binding site) [10, 21]. Dans cette première catégorie d'anticorps, il y a LIBS-1 et AP-6. Pour AP-6, il s'agit d'un anticorps anti-LIBS qui diffère des autres car les modifications conformationnelles qu'il reconnaît nécessitent la fixation de la molécule entière de fibrinogène et non pas seulement des peptides RGD [22]. La fixation des protéines adhésives sur ces GP IIb-IIIa peut être reconnue par des anti-RIBS. Dans ce cas, les anticorps ne reconnaissent pas le complexe de glycoprotéines IIb-IIIa mais le fibrinogène, seulement quand celui-ci est lié au complexe. Ce sont par exemple les anticorps F26 et 9F9 [21].

Selon que les plaquettes sont activées par des inducteurs comme l'ADP qui n'induit que peu de sécrétion plaquettaire ou la thrombine qui active les plaquettes en faisant sécréter le contenu en granules, les modifications d'expression des glycoprotéines seront différentes comme l'illustre la figure 1, le processus de sécrétion étant caractérisé par l'expression à la surface plaquettaire des glycoprotéines liées aux membranes ou du contenu granulaire.

Les plaquettes libèrent des micro-particules au cours de leur activation [23]. Le type d'agoniste intervenant pour cette fragmentation est particulier : l'ionophore A23187 est le plus puissant inducteur, la thrombine isolée n'est que faiblement inductrice de microparticules, pour le devenir, la stimulation doit être associée à celle du collagène. La fraction C5b-9 du complément est particulièrement active dans la production de microparticules. Les microparticules correspondent à des fragmentations de membrane plaquettaire sur lesquelles on trouve de nombreux constituants plaquettaires, GP Ib-IX, GP IIb-IIIa, la P-sélectine. Ce phénomène, pour se produire, nécessite la perte de l'asymétrie de la distribution des phospholipides avec apparition à la surface de la phosphatidylsérine, mais aussi une activation de la calpaïne qui va permettre une dissociation des structures membranaires du cytosquelette [24]. Les plaquettes produisant les microparticules expriment à leur surface des propriétés catalytiques pour des réactions procoagulantes (tenase et prothrombinase), mais aussi anticoagulantes (réactions avec la protéine C). La détection de taux élevés de microparticules dans la circulation de patients développant des syndromes thrombotiques a incité à évaluer l'implication clinique de ces éléments.

Pathologiesoù sont recherchées les plaquettes activées

Pathologies cardiovasculaires

Les accidents ischémiques coronaires (angor instable, infarctus du myocarde) correspondent à la fissuration d'une plaque d'athérosclérose intracoronaire. Ils compliquent parfois des procédures interventionnelles comme l'angioplastie coronaire avec ou sans la mise en place de stent. Les tests standards effectués dans les laboratoires d'hémostase permettent d'évaluer le niveau d'hypocoagulation mais ne suffisent pas à apprécier le risque thrombotique. La recherche d'une activation plaquettaire peut s'avérer très utile pour conduire les nouvelles thérapeutiques antithrombotiques. Le nombre de publications axées sur ces perspectives témoigne de la nécessité de disposer de tests permettant d'évaluer les états préthrombotiques (tableau I).

Plusieurs études ont tenté de corréler la fréquence d'accidents ischémiques coronaires avec la présence de plaquettes activées dans la circulation avant angioplastie. Les résultats indiquent qu'un pourcentage élevé de plaquettes activées juste avant l'angioplastie est associé à une fréquence accrue d'accidents occlusifs (P-sélectine, CD63, TSP) [25, 26].

Un autre paramètre recherché était l'influence de la procédure d'angioplastie sur l'apparition ou l'augmentation des plaquettes activées. Dans l'ensemble des travaux publiés, il est trouvé que le taux des plaquettes activées augmente, mais de manière irrégulière après angioplastie. Les premières études comportaient essentiellement des marqueurs de sécrétion plaquettaire comme des anticorps anti-P-sélectine ; le plus souvent, les résultats montraient des résultats modestes quant au nombre de plaquettes activées. Plus récemment, l'utilisation d'anticorps reconnaissant une activation de GP IIb-IIIa a été développée afin de chercher si des activations sans signe de sécrétion pouvaient être détectées [27-29].

La pose de stent intracoronaire s'est récemment développée et la survenue de complications thrombotiques a actuellement tendance à diminuer mais elle constitue encore un problème difficile à contrôler. L'utilisation de thérapeutiques plus vigoureuses associant plusieurs anti-agrégants (aspirine/ticlopidine [30], RéoPro/aspirine [31]) a permis d'améliorer les résultats. L'activation plaquettaire détectée par cytométrie en flux au cours de pose de stent peut être supérieure à celle trouvée après angioplastie coronaire. Elle concerne les marqueurs à la fois d'activation de GP IIb-IIIa mais aussi la P-sélectine.

Une observation rapportée par plusieurs laboratoires, dont le nôtre, est l'apparition de plaquettes activées dans la circulation de manière différée, à 24 ou 48 heures par rapport à l'angioplastie [32], ou encore se développant chez les patients plusieurs jours après infarctus du myocarde traité par fibrinolyse [28]. La raison de l'apparition différée des plaquettes activées est intrigante. Parmi les hypothèses, on peut proposer la recirculation de plaquettes qui ont été impliquées dans la formation de thrombus ou une saturation du système réticulo-endothélial dans les heures suivant ces procédures. Une autre explication à cette apparition tardive de plaquettes activées est que au départ l'activation étant plus forte, les plaquettes seraient immédiatement éliminées ; ensuite, les plaquettes les moins activées circuleraient plus longtemps et seraient donc détectables.

Il est à noter que, d'une manière générale en ce qui concerne la P-sélectine, son niveau d'expression est toujours modéré par rapport à une activation induite in vitro par la thrombine sur des plaquettes normales. Cela pourrait correspondre à une faible activation ou encore à une élimination de la P-sélectine de la surface plaquettaire. Si, comme Michelson vient de le décrire [33], la P-sélectine est clivée par des enzymes plasmatiques lorqu'elle est à la surface plaquettaire, l'utilisation de ce marqueur d'activation aurait donc un intérêt plus réduit que ne le laissaient entrevoir les travaux précédents, ou tout au moins différent. De la même manière, on ignore quelle est la durée de vie des complexes GP IIb-IIIa activés dans la circulation. Des études in vitro ont montré une translocation des complexes GP IIb-IIIa occupés par le fibrinogène à l'intérieur des plaquettes [11].

Les circulations extracorporelles (CEC) ont été également l'objet de nombreuses études car une thrombopénie survient systématiquement au cours des CEC, indiquant une adhésion des plaquettes aux matériaux étrangers très importante. Pour ces patients, à qui des quantités importantes d'héparine sont administrées, il était important de connaître l'état des plaquettes résiduelles circulantes et leurs capacités hémostatiques. Les travaux de Metzelaar [34] et de l'équipe de Michelson [35] nous ont révélé que les plaquettes des patients sous CEC circulaient avec peu de stigmates d'activation : pour la première équipe le pourcentage de plaquettes activées exprimant la P-sélectine passait de 4,4 ± 2,3 % à 6,6 ± 3,3 % et la présence de CD63 n'était pas plus augmentée (tableau II). Pour la seconde équipe, les variations étaient non significatives, même en ce qui concerne la fixation des anticorps dépendants de l'activation anti GPIIb-IIIa. Dans cette étude, le principal défaut des plaquettes correspond à leur réactivité anormale à participer aux phénomènes hémostatiques dans un milieu aussi fortement hépariné.

Autres applications

Une autre application de cette nouvelle technologie est représentée par l'évaluation de préparations plaquettaires destinées à être transfusées [36-38] (tableau III). En effet, les concentrés plaquettaires sont préparés par différentes techniques et conservés plusieurs jours. Toutes les études montrent que la conservation des plaquettes s'accompagne de transformations de la composition de leur membrane avec, en particulier, l'apparition des glycoprotéines des membranes des différents granules à la surface plaquettaire. Il a été montré que les plaquettes qui ont subi un phénomène d'activation présentent une durée de vie raccourcie [37]. Ces résultats sont très importants car ils indiquent que l'utilisation de plaquettes sans signes d'activation permet de garantir une meilleure efficacité transfusionnelle. Ils permettent de déterminer les temps maximum de conservation ainsi que les meilleures conditions de préparation et de conservation des plaquettes [36, 38]. Les plasmaphérèses sont également source d'activation plaquettaire [39] ; ces activations peuvent être différentes selon les machines qui sont utilisées.

Parmi les autres circonstances d'utilisation des tests de plaquettes activées, plusieurs études concernent les pré-éclampsies où sont détectées plus de plaquettes activées chez les femmes enceintes menacées de cette complication ; il est montré que l'apparition des plaquettes activées précède les signes cliniques de plusieurs semaines [40]. Les hémodialyses sont également source d'activation plaquettaire.

Pathologies où sont trouvées des microparticules

La présence de microparticules dans la circulation a été montrée par analyse en cytométrie en flux au cours des CEC. Dans une étude, il est montré que, 60 minutes après l'intervention, il y a présence dans la circulation de microparticules fixant PAC-1 [41]. De manière intéressante les microparticules ont été décrites dans les purpuras thrombopéniques idiopathiques [23]. Pour certains auteurs, la présence de microparticules dans ces pathologies était trouvée dans les cas où existaient des complications neurologiques d'origine thrombotique ; les auteurs ont suggéré que la diffusion de microparticules dans l'organisme pourrait entraîner des complications thrombotiques [42]. Pour d'autres auteurs, les microparticules protégeraient des syndromes hémorragiques. La présence de microparticules a été décrite au cours des thrombopénies induites par l'héparine où existe une forte fréquence de problèmes thrombotiques [23]. De manière générale, la présence de la phosphatidylsérine à la surface cellulaire, détectée par exemple par l'annexine V, est considérée comme un signe de l'apoptose.

Aspects technologiques

Pour une utilisation en clinique, les tests de détection d'activation plaquettaire se doivent d'être très sensibles tout en étant le moins possible caution aux artéfacts d'activation in vitro. Le prélèvement constitue une étape importante pour la fiabilité des résultats : en effet, l'apport de facteur tissulaire libéré au point de ponction peut engendrer une activation. Il est important de ne pas utiliser les premiers millilitres de sang prélevés. La généralisation des prélèvements dans des tubes sous vide de type Vacutainer doit soulever la question de l'utilisation de ces tubes pour la détection des plaquettes activées. La réponse de l'équipe de Michelson qui possède une grande notoriété dans ce domaine est affirmative quant à leur utilisation [34]. L'autre sujet soulevé, pas totalement résolu, concerne l'utilisation de sang total ou de PRP pour pratiquer les épreuves d'immunofluorescence. Les deux types d'échantillons sont utilisés dans la littérature sans que les résultats globaux aboutissent à des conclusions très différentes. L'analyse de sang total ne souffre pas de la suspicion d'induction de l'activation in vitro pendant les centrifugations. De plus, la préparation des échantillons pour l'analyse en cytométrie en flux en sang total est très rapide ; toutefois, le passage des échantillons se doit d'être lent pour que l'analyse en flux liquidien ne puisse correspondre à l'analyse simultanée de plusieurs cellules (les plaquettes ne représentent qu'environ 1/20 de l'ensemble des cellules). Les échantillons sont souvent fixés après les incubations avec les anticorps. L'utilisation d'échantillons fixés par le paraformaldhéhyde avant les incubations avec les anticorps nécessite une évaluation de l'effet du fixateur sur les épitopes concernés. Le paraformaldéhyde inhibe la fixation d'un grand nombre d'anticorps, en particulier de ceux reconnaissant des épitopes dépendants de la conformation des GP IIb-IIIa. Il est important d'évaluer ce paramètre pour chaque utilisation de nouveaux anticorps. La nature de l'anticoagulant sur lequel est prélevé le sang est importante : par exemple, l'EDTA est susceptible de dissocier les complexes GP IIb-IIIa qui sont Ca²⁺-dépendants. Un autre choix qui se pose est l'utilisation d'anticorps directement conjugués au FITC ou l'utilisation d'une méthode immunologique indirecte. Bien que, a priori, un anticorps directement conjugué à un fluorochrome paraisse d'une utilisation simplifiée, la plupart des auteurs utilisent des techniques différentes, soit indirecte (deux anticorps), soit en deux temps (Ac conjugué à la biotine incubation avec la streptavidine-FITC ou la phycoérythrine). La zone sur le cytomètre en flux correspondant à la population plaquettaire est facilement identifiable l'utilisation d'un double marquage se justifie surtout lorsque les plaquettes présentent des tailles anormales proches de celle des globules blancs.

Une remarque concernant l'évaluation des plaquettes activées est le mode d'expression des résultats. Pour la P-sélectine, la thrombospondine, le CD63, l'expression est régulièrement donnée en pourcentage de plaquettes activées, la valeur de l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) étant plus rarement indiquée. Dans notre expérience, l'intensité de fluorescence, correspondant à la présence de P-sélectine observée sur des plaquettes prélevées au cours des différentes pathologies mentionnées ci-dessus, est toujours très faible. Concernant la détection des microparticules, des techniques autres que la cytométrie en flux sont proposées, comme la technique ELISA qui permet de concentrer ces éléments pour les doser plus facilement.

Perspectives et conclusions

La possibilité d'évaluer le profil membranaire de plaquettes provenant de patients présentant des syndromes thrombotiques ou des états préthrombotiques constitue une nouvelle approche d'études plaquettaires très intéressante. Les investigations cliniques actuelles montrent qu'il est possible de détecter dans la circulation des plaquettes exprimant des signes d'activation. Il s'agit d'une méthode avec une très forte potentialité.

Les anticorps sélectionnés dans la majorité des études publiées sont ceux évaluant une diffusion des constituants membranaires glycoprotéiques du compartiment intracellulaire vers la surface plaquettaire et, plus récemment, ceux évaluant le niveau d'activation du complexe GP IIb-IIIa. Les techniques seront progressivement élargies à l'étude des récepteurs des agonistes comme, par exemple, les récepteurs de la thrombine (PAR-1 et -3) dont la dégradation peut être un signe d'activation spécifique à cette enzyme. L'évaluation des niveaux d'expression des facteurs de la coagulation activés liés aux plaquettes, comme les facteurs Va et VIIIa, devrait également permettre d'appréhender les capacités de coagulation plasmatique à la surface plaquettaire.

Une application importante d'investigation clinique des plaquettes activées par cytométrie en flux pourrait être représentée par la surveillance de l'efficacité des médications antithrombotiques. Déjà, il est clair que dans les études réalisées sur les angioplasties, avec ou sans implantation de stents, et sur l'infarctus du myocarde fibrinolysé, l'utilisation de l'aspirine associée à l'héparine ne suffit pas à maintenir les plaquettes dans un état non activé. Ces observations sont à rapprocher des tentatives que font les cardiologues d'utiliser, dans ces mêmes situations pathologiques, des anti-agrégants plus efficaces comme la ticlopidine, le RéoPro ou à associer plusieurs anti-agrégants [30, 31]. Des études comparatives de l'activation plaquettaire par rapport à plusieurs protocoles médicamenteux devraient permettre de mieux maîtriser l'efficacité des thérapeutiques [43]. La classe des agents anti-agrégants, pendant longtemps limitée à l'aspirine, s'est élargie ; il existe un fort besoin de disposer de tests permettant de mieux poser les indications et de contrôler leur efficacité. C'est certainement par la multiplicité des études d'investigations cliniques que se dégageront les meilleures approches de l'utilisation de ces nouvelles technologies.

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