Transcriptome

ARTICLE

Auteur(s) : Benoît Arveiler

EA4137, Laboratoire de génétique humaine, Université Victor-Segalen, Bordeaux 2

On appelle transcriptome l’ensemble des ARN produits par une cellule ou un tissu. À la notion de transcriptome on associe des éléments qualitatifs (quels gènes sont exprimés) et quantitatifs (quel est le niveau d’expression de chacun des gènes). Le transcriptome reflète l’activité des différents gènes dans une cellule ou un tissu à un instant donné. Ainsi, les transcriptomes des différentes structures du cerveau seront différents car les gènes exprimés dans le cervelet, la substance noire et l’hypothalamus, par exemple, sont différents. De même, les gènes exprimés au sein d’un même organe diffèrent selon les stades du développement de l’individu. Enfin, les niveaux d’expression de certains gènes peuvent être différents entre un état normal et un état pathologique.

Le génome humain contient environ 25 000 gènes. Les gènes de classe I expriment les ARN ribosomaux, les gènes de classe II expriment les ARN messagers, et les gènes de classe III expriment les ARN de transfert et les petits ARN nucléaires.

Les gènes de classe II (qui codent pour des protéines) sont transcrits dans le noyau en ARN primaire (ou prémessager), puis maturés en ARN messager qui est exporté vers le cytoplasme où il est traduit en protéine au niveau des ribosomes (figure 1). La transcription met en jeu l’ARN polymérase II qui reconnaît la région promotrice du gène, ouvre la molécule d’ADN double brin, et commence la transcription du gène, c’est-à-dire la synthèse d’une molécule d’ARN en utilisant comme patron le brin antisens de la molécule d’ADN. La molécule synthétisée est la copie du brin sens du gène, encore appelé brin codant.

L’ARN primaire subit une maturation selon trois processus :

• ajout d’une méthylguanosine à l’extrémité 5’ de la molécule (coiffe) ;
• ajout d’une queue de 30 à 200 adénosines (queue poly-A) à l’extrémité 3’ ;
• épissage qui résulte en l’élimination des introns, qui sont non codants ; ce mécanisme aboutit à la production d’une molécule d’ARN messager qui ne comporte plus que les exons, soit les informations nécessaires à la synthèse de la protéine.

Il est important de noter qu’un même gène peut produire plusieurs ARN messagers différents, et ce essentiellement par deux processus. Le premier est l’utilisation de promoteurs différents (ou alternatifs) selon les tissus, donnant lieu à des isoformes qui diffèrent par la présence ou l’absence du ou des premiers exons du gène. Le second est l’épissage alternatif de tel ou tel exon, qui produit parfois de multiples isoformes d’ARN messager dans lesquelles différents exons peuvent être présents ou absents. Ces deux processus constituent une forme de régulation de l’expression génique en ce sens que les isoformes protéiques ainsi produites peuvent avoir des fonctions partielles ou différentes, par rapport à la protéine résultant de la traduction de tous les exons.

L’analyse de l’expression des gènes peut être abordée de plusieurs façons. L’analyse du ou des ARN messagers d’un gène particulier est classiquement réalisée par transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Pour cela, l’ARN du tissu dans lequel s’exprime le gène que l’on désire étudier est purifié, soumis à l’action d’une transcriptase inverse qui, en présence d’amorces et de nucléotides, va synthétiser un premier brin d’ADN complémentaire de chacune des molécules d’ARN messager présentes dans le tissu, puis synthétisera le second brin. Ainsi est fabriqué ce que l’on appelle l’ADN complémentaire (ADNc) de l’ARN (figure 2). L’ADNc du gène que l’on désire analyser peut ensuite être amplifié par PCR afin d’analyser sa structure (présence de tel ou tel exon) et sa séquence. L’ensemble de ce processus est appelé reverse transcription PCR (RT-PCR). Une technique de PCR quantitative peut être utilisée pour mesurer le niveau d’expression du gène.

L’ensemble des ADNc synthétisés à partir d’un tissu donné peut être cloné dans des plasmides bactériens afin de réaliser une banque d’ADNc qui représente l’ensemble des transcrits de ce tissu. Le séquençage des extrémités des clones ADNc a fourni des étiquettes des séquences exprimées que l’on a appelées des EST (expressed sequence tags) (figure 3) [1]. Chaque EST représente entre 100 et 200 pb. L’analyse des EST produits à partir de différents tissus et de différents stades du développement a joué un rôle crucial dans la seconde moitié des années 1990 pour commencer à déterminer le profil d’expression spatio-temporel de l’ensemble des gènes humains. Ceci a constitué la première approche pour l’analyse du transcriptome. Il s’agissait d’une approche essentiellement qualitative.

Une approche quantitative du transcriptome a été rendue possible par l’avènement de la technologie dite des puces à ADN (ou micro-array). Il s’agit de surfaces solides (généralement des lames de verre) sur lesquelles un grand nombre de sondes sont fixées [2-4].

Pour l’analyse du transcriptome, les sondes peuvent être soit des fragments d’ADNc, soit des oligonucléotides issus d’exons. Une analyse globale du transcriptome sera réalisée avec une puce portant des sondes représentant les 25 000 gènes humains. Le principe de l’analyse repose sur l’hybridation entre molécules complémentaires, c’est-à-dire, dans le cas de l’analyse du transcriptome, entre, d’une part, les sondes déposées sur le support et, d’autre part, les molécules d’ADNc synthétisées à partir du matériel biologique à étudier qui ont été marquées avec un fluorochrome (figure 4). L’ADNc testé (marqué ici avec la Cyanine 5) est cohybridé avec un ADNc de référence (marqué ici avec la Cyanine 3). Le niveau d’intensité de fluorescence est mesuré au niveau de chaque sonde, permettant ainsi de quantifier le niveau d’expression de chaque ARNm. Ceci permet de déterminer les gènes qui sont éventuellement sous-exprimés ou surexprimés dans certaines cellules. Classiquement, ces études sont réalisées pour comparer le niveau d’expression des gènes entre un tissu pathologique et le même tissu sain. Une autre application concerne la pharmacogénomique, qui consiste à analyser les modulations d’expression des gènes avant et après traitement par une drogue, que ce soit dans des cellules en culture ou in vivo chez l’animal. Les données obtenues sont ensuite analysées par traitement mathématique et biostatistique visant par exemple à classer les gènes par leur degré de ressemblance (gènes ayant la même fonction, ou entrant dans la même voie métabolique, etc.).

L’analyse du transcriptome à l’aide de puces à ADN trouve des applications en recherche fondamentale, mais pourra aussi, dans le futur, constituer un outil pour le diagnostic ou le pronostic (révélation de marqueurs particuliers) des maladies et pour l’identification de cibles thérapeutiques. La mise en évidence d’un gène dont la régulation de l’expression est au premier plan dans le mécanisme physiopathologique peut conduire à l’élaboration de stratégies moléculaires visant à moduler l’expression de ce gène ou l’activité de la protéine pour laquelle il code.

Références

2 Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown P. 0. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science 1995 ; 270 : 467-70.

3 Schena M, Shalon D, Heller R, Chai A, Brown PO, Davis RW. Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Proc Natl Acad Sci USA 1996 ; 93 : 10614-9.

4 Duggan DJ, Bittner M, Chen Y, Meltzer P, Trent JM. Expression profiling using cDNA microarrays. Nature Genetics 1999 ; 21 : 10-4.