ARTICLE
Auteur(s) : Andràs
Pàldi
Ecole Pratique des Hautes Etudes, Généthon, 1 bis rue de
l’Internationale, 91002 Evry
Le fait que l’introduction du noyau d’une cellule différenciée dans
un ovocyte dont les chromosomes sont enlevés, permette un
développement normal, soulève plusieurs questions. D’une part, les
cellules différenciées spontanément ne se dédifférencient pas ou
seulement très rarement. Le processus de la différenciation au
cours duquel le potentiel de la cellule se restreint de plus en
plus est le plus souvent considéré comme irréversible. Bien qu’il
existe des observations qui démontrent que certaines cellules
différenciées sont capables de changer leur phénotype, ces exemples
sont largement débattus [1]. L’état différencié d’une cellule est
caractérisé par l’expression restreinte d’une fraction des gènes et
une répression d’expression d’autres gènes. Si les cellules
différenciées ont des difficultés à se dédifférencier, c’est parce
que la répression des gènes non exprimés est difficile à surmonter.
Mais le succès du clonage démontre sans ambigüité que le noyau
d’une cellule somatique est capable de reexprimer les gènes qu’il
exprimait aux stades précoces de son développement. Le processus
qui restreint la capacité d’exprimer n’importe quel gène est donc
réversible. Comment l’ovocyte est-il capable de lever la
restriction ? Comment le noyau de la cellule donneuse
« se dédifférencie-t-il » ? Ces questions sont
étroitement liées à la compréhension de la régulation génique mais
aussi au développement et à la différenciation, et l’étude des
fœtus clonés peut apporter des explications.D’autre part, il est
clair que le processus qui permet de lever la restriction qui
contraint une cellule somatique à un répertoire restreint de
phénotypes est très peu efficace. Seul un petit nombre d’ovocytes
dans lesquels un noyau de cellule somatique a été greffé se
développent normalement. Le développement préimplantatoire se
déroule plus au moins normalement, bien que le nombre de cellules
dans les blastocystes soit généralement plus faible [2]. Les
blastocystes s’implantent dans l’utérus, mais seulement très peu
d’entre eux survivent jusqu’au terme. La mortalité périnatale est
aussi très importante. De plus, les clones qui survivent sont
souvent anormaux et ont des malformations plus au moins
importantes. Les causes de ces anomalies ne sont pas tout à fait
claires. Néanmoins, il est établi que l’expression d’un grand
nombre de gènes est dérégulée. Même chez les animaux clonés qui ne
souffrent apparemment pas de malformations, on observe une telle
dérégulation [3, 4]. Il est à noter que le génotype et l’état de
différenciation de la cellule donneuse sont importants pour le
succès du développement. Plus la cellule donneuse est éloignée des
stades précoces du développement, plus elle s’est engagée vers une
différenciation terminale, moins l’ovocyte greffé de son noyau est
capable de parcourir un développement normal. Le greffe d’un noyau
d’une cellule souche embryonnaire (cellule ES) permet un taux de
succès de 20 à 40 % [5]. Ce chiffre tombe à 1 à 3 % si la
cellule donneuse est une cellule de cumulus [6]. Les taux sont
encore plus bas si un lymphocyte T ou B est utilisé comme donneur
[7]. Néanmoins, il est difficile de tirer des conclusions sans
ambiguïté dans ce domaine, car les différents laboratoires
n’utilisent pas toujours les mêmes techniques et même des détails
apparemment sans importance peuvent influencer l’efficacité. Par
exemple, les ovocytes greffés d’un noyau somatique gardent
certaines caractéristiques de la cellule donneuse au cours de leur
développement préimplantatoire. Quand ils sont cultivés dans un
milieu de culture conçu pour les cellules somatiques, les ovocytes
clonés se développent mieux et produisent des blastocystes avec une
fréquence plus élevée que dans le milieu de culture optimisé pour
les embryons préimplantatoires [8].Il est généralement admis que le
développement et la différenciation cellulaire dépendent de
l’expression différentielle et ordonnée des gènes au cours du
développement. Toutes les observations faites sur l’expression des
gènes sur les embryons, fœtus ou animaux adultes clonés convergent
vers la conclusion que l’expression des gènes chez ces animaux ne
suit pas le cours normal. En fonction du degré de la dérégulation,
l’embryon cloné se développe plus au moins normalement. La grande
variabilité de l’expression génique chez les animaux clonés qui ne
montrent aucune malformation apparente suggère que le processus du
développement est plus plastique qu’on pourrait le penser, très
robuste, et peut tolérer des écarts importants d’expression génique
tout en maintenant le phénotype proche de la normale [5]. Cette
observation est assez surprenante, car on pense généralement que
l’expression des gènes au cours du développement est très
strictement régulée et qu’aucun grand écart n’est possible.
Visiblement, ce n’est pas le cas et l’expression désordonnée d’un
grand nombre de gènes peut être compensée par le réseau complexe
d’interactions qu’ils forment. Néanmoins, malgré cette grande
capacité à canaliser la variabilité, l’écrasante majorité des
clones meurent très tôt. Seuls les embryons survivants peuvent être
étudiés, ce qui suggère que l’expression génique dans la majorité
des embryons clonés doit être plutôt chaotique que simplement
« dérégulée » ce qui rend leur développement normal
impossible. La corrélation qui émerge est simple : plus
l’expression génique est désorganisée, moins les embryons clonés
sont capables de survivre. La question est de savoir pourquoi cette
dérégulation ?Pour aborder cette question, il est nécessaire
de comprendre comment les gènes sont régulés. L’opinion la plus
répandue est que la régulation génique est une affaire de facteurs
spécifiques de régulation [9]. C’est l’interaction des séquences
régulatrices d’un gène avec des facteurs de transcriptions
spécifiques qui permet la régulation de l’expression. Mais l’ADN ne
se trouve pas à l’état libre dans le noyau cellulaire, il est
organisé en chromatine. C’est une structure composée de protéines
et d’ADN. L’unité structurelle de base de la chromatine est le
nucléosome formé par un octamère d’histones et un segment de l’ADN
enroulé autour de ce noyau. La chromatine est composée d’une
succession de nucléosomes sur le fil de l’ADN, comme un collier de
perles. Ce complexe nucléoprotéique est très stable, il peut même
se former spontanément in vitro quand on mélange une solution d’ADN
et des histones dans un tube d’essai. Aucune transcription n’est
possible sans que les nucléosomes ne soient déplacés, car l’ADN
dans la chromatine n’est pas accessible aux autres protéines. Nous
savons que la chromatine n’a pas exactement la même structure
partout. Les histones, ainsi que l’ADN sont sujets à des
modifications covalentes, qui modifient leur conformation, leur
charge électrique et leur capacité à interagir entre eux et avec
d’autres protéines nucléaires. Ces modifications, qui portent le
nom de « modifications épigénétiques », sont des
modifications covalentes, qu’on retrouve couramment sur de
nombreuses protéines : la phosphorylation, l’acétylation, la
méthylation, la polyADP-ribosylation etc. L’ensemble de ces
modifications sur une région chromosomique a une influence majeure
sur la structure générale de la chromatine. La présence ou
l’absence de certaines modifications peut être corrélée à
l’activité transcriptionnelle des gènes de la région. Ainsi, on
peut parler d’une « signature épigénétique » qui
caractérise la chromatine lorsqu’elle est potentiellement
compétente pour la transcription. Ce type de chromatine porte le
nom d’euchromatine et est caractérisé par une abondance
d’acétylations ou de polyADP-ribosylations des histones et par une
absence de méthylation de l’ADN et des histones. En revanche, la
chromatine inactive du point de vue de la transcription, qui porte
le nom d’hétérochromatine, a une signature épigénétique
opposée : pas ou peu d’acétylation ou de polyADP-ribosylation
et une abondance de méthylation de l’ADN sur les CpG-s des
séquences régulatrices. La probabilité pour un gène d’être exprimé
ou réprimé dépend grandement des différences de modifications
épigénétiques affectant la chromatine dans ces deux types de
régions. Un gène a toutes les chances de rester inactif
transcriptionnellement, même en présence des facteurs de
transcriptions nécessaires pour sa transcription, s’il se trouve
dans une région hétérochromatique qui rend ses séquences
régulatrices inaccessibles. En revanche, l’activation d’un gène est
possible s’il se trouve dans une région euchromatinique [1]. Les
modifications épigénétiques contribuent également à l’organisation
de la structure globale de la chromatine. Les chromosomes occupent
des territoires distincts dans le noyau d’une cellule
interphasique. L’organisation des sous-régions actives et inactives
à l’interieur de ces territoires corrèle également avec la nature
des modifications épigénétiques [10].Les réactions qui conduisent à
ces modifications ainsi que les réactions opposées de
démodifications sont catalysées par des enzymes. Le même type de
modifications peut être catalysé par plusieurs enzymes différents.
Mais ce sont des enzymes différents qui catalysent les
modifications opposées. Le degré de modification de la chromatine
dépendra donc à chaque instant de l’équilibre entre les deux types
de réactions opposées. Tout changement de l’état physiologique de
la cellule qui modifie l’équilibre des réactions épigénétiques peut
influencer l’état épigénétique de la chromatine et, par suite,
induire des changements d’expression génique [11]. Les différentes
modifications épigénétiques génèrent des interactions synergiques
ou antagonistes entre les différents composants de la chromatine,
renforçant ainsi la formation de l’euchromatine ou de
l’hétérochromatine. La structure globale de la chromatine est très
dynamique et change au cours de la différenciation cellulaire en
parallèle avec l’activation et l’inactivation des groupes de
gènes.Mais les mécanismes épigénétiques remplissent également un
autre rôle essentiel. En plus de déterminer la structure de la
chromatine, les modifications « épigénétiques » jouent le
rôle de « mémoire ». En effet, c’est grâce aux mécanismes
épigénétiques que la structure de la chromatine est conservée et
que l’état d’activité des gènes est transmis au cours des divisions
cellulaires. Un gène qui n’a pas été exprimé depuis des générations
porte des modifications typiques de l’hétérochromatine (acétylation
réduite et méthylation élevée) et ne peut être réactivé facilement.
Grâce à la transmission de l’état de la chromatine, la cellule
« garde en mémoire » les gènes dont l’activité n’est pas
indispensable à son fonctionnement. En revanche, les gènes actifs
avant la division conservent les modifications typiques de
l’euchromatine (acétylation augmentée et méthylation de l’ADN
réduite), ce qui permet au gène de rester actif ou facilement
activable après la division cellulaire. D’une certaine façon en
permettant à la cellule de « garder en mémoire » son
parcours, les mécanismes épigénétiques sont à la base de
l’unidirectionnalité du processus de différenciation car la
différenciation se produit plus facilement que la
dédifférenciation. Cette « mémoire » ne prédestine pas la
cellule à un phénotype différencié donné, elle ne fait que rétrécir
les possibilités de la cellule en fonction de son parcours
antérieur en rendant le retour en arrière moins probable.
Néanmoins, comme l’ont montré les expériences de clonage, le retour
reste possible, car l’inhibition via les mécanismes épigénétiques
est réversible.L’établissement d’un profil épigénétique dans un
noyau cellulaire se fait en étroite « collaboration »
avec le cytoplasme. Dans une cellule normale c’est par le
cytoplasme que l’influence de l’environnement se transmet, c’est
dans le cytoplasme que les enzymes qui catalysent les réactions
épigénétiques et leurs substrats sont synthétisés. Les processus
biochimiques dans le noyau, y compris les modifications
épigénétiques, sont donc conditionnés par le cytoplasme et vice
versa, car l’expression des gènes à son tour modifie la composition
du cytoplasme. Le cytoplasme façonne le noyau qu’il façonne. Cette
complémentarité dynamique est bien illustrée par la fusion de deux
cellules différentes. L’hétérocaryon qui en résulte, en plus
d’exprimer des gènes caractéristiques des cellules initiales,
commence à exprimer aussi des gènes nouveaux qui n’étaient exprimés
dans aucune des cellules parentales [12]. La greffe du noyau
somatique dans un ovocyte, et même la fécondation naturelle de
l’ovocyte, montrent certaines analogies avec la fusion
expérimentale des cellules. Dans les deux cas, la chromatine subit
un remodelage extensif.En règle générale, l’ovocyte fécondé peut
être considéré comme la seule cellule véritablement totipotente,
c’est-à-dire, capable de se différencier en n’importe quelle type
cellulaire, car le zygote est à l’origine de toutes les cellules de
l’organisme. Cela peut apparaître comme une évidence. Mais, si on
considère que ni l’ovocyte, ni le spermatozoïde dont la fusion crée
le zygote ne sont capables de se diviser et de se développer
séparément, la question apparaît moins évidente. En effet, on peut
considérer les gamètes mâles et femelles comme des cellules
différenciées, dont la seule fonction est de féconder ou d’être
fécondées.Le spermatozoïde, en plus d’apporter dans le zygote le
jeu de chromosomes paternels, induit des changements importants
dans l’ovocyte, qu’on désigne le plus souvent par le terme
« d’activation » [13]. En réalité, l’ovocyte n’est pas
inactif, il se maintient dans un état d’équilibre dynamique qui
nécessite de l’investissement en énergie produite par le
métabolisme de la cellule. S’il semble être inactif, c’est parce
qu’il est arrêté en métaphase de la deuxième division méiotique
avec ses chromosomes condensés et organisés en fuseau métaphasique.
L’activation par le spermatozoïde, lequel peut être remplacé par un
stimulus électrique ou chimique artificiel, déclenche une série de
changements cytoplasmiques rapides [13]. En réponse, l’ovocyte
termine sa division, ses chromosomes se décondensent et forment un
noyau interphasique : le pro-noyau maternel qui ne renferme
que les chromosomes maternels. Les chromosomes paternels apportés
par le spermatozoïde ont un autre parcours. L’ADN paternel a une
organisation très compacte qu’on ne retrouve que dans les
spermatozoïdes. Il est associé à des protamines, des protéines
basiques qui remplacent les histones sur les chromosomes au cours
de la maturation des gamètes mâles. Les protamines permettent
l’empaquetage de l’ADN dans un volume aussi petit que la tête du
spermatozoïde. Donc, au moment de la fécondation, la chromatine
paternelle n’a pas une structure nucléosomique. Les protamines sont
rapidement dégradées par l’ovocyte après son activation et
remplacées par des histones déjà présentes dans le cytoplasme. Un
deuxième noyau est formé, le pro-noyau paternel avec le génome
paternel qui a acquis une structure nucléosomale. Le génome
paternel subit donc un remodelage profond qui efface la majorité
des marques épigénétiques préexistantes [14]. On peut suivre ces
changements si on visualise les différentes protéines de la
chromatine ou la méthylation de l’ADN avec des techniques
d’immunohysochimie. On observe une diminution rapide de la
méthylation de l’ADN, probablement le résultat de l’action d’une
enzyme encore non identifiée [15]. Parallèlement, on voit
l’accumulation de l’histone H4 hyperacétylé ou encore de la
protéine de l’hétérochromatine HP1b [16, 17]. Ces protéines sont
normalement déjà présentes dans le pronoyau maternel. Le remodelage
du génome continue tout au long du développement préimplantatoire.
Par exemple, la forme méthylée MeK9H3 de l’histone H3 est présente
sur les chromosomes de l’ovocyte, mais s’accumule sur les
chromosomes paternels seulement au cours du deuxième et troisième
cycle cellulaire [18]. Le génome maternel ne subit pas un
remodelage épigénétique aussi intensif, néanmoins il est
détectable. Les changements épigénétiques se poursuivent pendant
toute la durée du développement préimplantatoire. Au cours des
cycles cellulaires successifs, la méthylation des CpGs dans le
génome est redistribuée entre les différentes régions génomiques et
son niveau global baisse [19].La cinétique du processus de
remodelage est variable selon les espèces [20], mais ses
conséquences sont similaires : il efface la plupart des traces
de mémoire épigénétique déposée sur les chromosomes dans les
gamètes rendant ainsi possible l’activation de la transcription de
nombreux gènes. En un premier temps, l’expression du génome
embryonnaire semble plutôt chaotique. On observe l’expression
désordonnée d’une multitude de gènes réprimés auparavant [21, 22].
Mais autour du stade de morula, un profil d’expression ordonnée
commence à émerger et l’embryon entre dans la première phase de
différenciation de sa vie. Le blastocyste qui en résulte est
composé de deux types cellulaires, les cellules de la masse interne
et le trophectoderme.Il est logique de penser qu’un noyau de
cellule somatique introduit artificiellement dans un ovocyte doit
subir des transformations similaires pour rendre le zygote
reconstitué capable de se développer. En effet, le noyau d’un
thymocyte fusionné avec un ovocyte subit des transformations et
acquiert une ultrastructure ressemblant à un pro-noyau [23].
Curieusement, ses transformations n’ont lieu que si la fusion est
effectuée avant l’activation de l’ovocyte. Après l’activation,
l’ovocyte perd rapidement sa capacité à remodeler un noyau, y
compris celui du spermatozoïde [24].Les analyses moléculaires
détaillées ont démontré que les changements épigénétiques que le
génome somatique greffé dans l’ovocyte subit, sont de nature
similaire au génome zygotique. Le processus de remodelage du génome
somatique est souvent qualifié de « reprogrammation »
[4]. L’utilisation de ce terme est certainement un abus de langage
car il est difficile d’imaginer que la réorganisation épigénétique
se produise selon une séquence d’actions prédéterminées que
l’ovocyte ferait subir au noyau. Quel que soit le terme utilisé, il
est clair que les interactions dynamiques entre le noyau somatique
greffé et le cytoplasme de l’ovocyte induisent une petite
« révolution » épigénétique qui rend possible
l’expression d’une multitude de gènes qui n’étaient pas exprimés
dans la cellule donneuse.Néanmoins, ces changements sont le plus
souvent incomplets et les traces de la « mémoire
épigénétique » du génome somatique persistent, la
« dédifférenciation » du noyau greffé reste incomplète.
L’étude de la méthylation de l’ADN dans les embryons bovins ou
murins clonés en a apporté la preuve [25-27]. La cinétique globale
de la déméthylation est altérée [25] et la méthylation de diverses
séquences répétées est différente de la normale [26], tandis que
d’autres séquences suivent un cours normal de changements. La
méthylation du génome des clones devient une véritable mosaïque du
profil somatique et zygotique [28]. La conséquence en est que
l’expression du génome de l’embryon cloné est très perturbée. La
grande variabilité de l’expression génique qu’on observe même chez
les animaux clonés qui ne montrent aucune malformation apparente
est probablement la conséquence des traces épigénétiques non
effacées au stade préimplantatoire du développement. Si la majorité
des embryons clonés ne sont pas capables de se développer
normalement, c’est parce que l’expression de leur génome est trop
désordonnée.L’une des plus importantes leçons que l’étude des
clones nous réserve est qu’elle attire l’attention sur l’importance
longtemps sous-estimée des mécanismes épigénétiques. Ces mécanismes
assurent à la fois la stabilité et la capacité de changer
l’expression du génome et gardent encore la majorité de leur
secret. Nous n’avons à présent que des outils rudimentaires pour
influencer ces mécanismes, ce qui limite l’utilisation du clonage
pour autre chose que l’expérimentation. Ce qui n’est pas
négligeable, car, comme modèle expérimental, les clones permettront
d’étudier bien des problèmes fondamentaux de la biologie.
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