Le clonage animal et son apport à la recherche médicale

ARTICLE

Auteur(s) : Alice Jouneau, Jean-Paul Renard

Unité de Biologie du Développement et Reproduction, Inra, 78 352, Jouy en Josas, France

L’apport du clonage reproductif animal

Reprogrammation et développement préimplantatoire

A titre d’exemple, nous avons pu récemment produire au laboratoire 15 clones bovins à partir des cellules prélevées à l’oreille d’une femelle adulte donneuse après transplantation de 60 blastocystes soit un rendement de 25 % alors que dans le même protocole deux veaux seulement sont nés après transplantation de 85 blastocystes issus d’une autre donneuse soit un rendement de seulement 2,6 % ; dans les deux cas, le taux de blastocystes était supérieur à 35 % et voisin de celui obtenu dans les mêmes conditions de culture après fécondation in vitro, et la fréquence des caryotypes anormaux des cellules donneuses de noyaux (un critère que nous prenons systématiquement en compte avant d’utiliser les cellules comme source de noyaux) était faible [1]. Ce résultat suggère fortement que le génotype du donneur et/ou les effets épigénétiques créés par la culture des cellules ont une part importante dans l’aptitude du noyau à être reprogrammé [2].

De façon inattendue, le profil d’expression des gènes des blastocystes clonés peut être plus proche de celui de blastocystes issus de fécondation in vivo que celui des blastocystes issus de fécondation in vitro [3]. Ce résultat, établi chez le bovin à partir de 5 000 gènes (dont moins de 1 % avait une expression significativement différente entre les blastocystes clonés et les blastocystes fécondés in vitro), montre que les noyaux somatiques donneurs peuvent effectivement être largement reprogrammés au stade blastocyste. Chez la souris, il a été montré que même si des patrons d’expression géniques ou de méthylation de type somatique persistent après transfert de noyaux, les embryons produits peuvent se développer jusqu’au stade blastocyste [4]. Ces données tendent à accréditer l’idée que la reprogrammation est un processus progressif qui implique le franchissement d’étapes critiques du développement, d’abord les tout premiers clivages, puis in vivo des étapes plus tardives au-delà du stade blastocyste le plus souvent facilement atteint [5](tableau 1)( Tableau 1 ).
Tableau 1 Comparaison des taux de développement d’embryons clonés à partir de cellules embryonnaires ou somatiques

Reprogrammation et fonctions placentaires

En analysant pendant le dernier trimestre de la gestation la croissance de fœtus bovins issus de clonage et celle de leurs placentas, nous venons de montrer que ce syndrome trouve son origine dans des défauts primaires de la croissance des tissus placentaires. En effet, alors qu’à sept mois de gestation les fœtus clonés ont encore un poids moyen et une morphologie très voisine de celles de fœtus obtenus après fécondation in vivo (insémination artificielle) ou in vitro, la taille de leurs placentomes est déjà significativement plus importante [8] : la structure placentaire est globalement conservée, mais envahie par la composante trophoblastique aux dépens de l’épithélium maternel. Il en résulte une réduction significative du poids relatif du fœtus par rapport à celui de son placenta dont le poids est en moyenne 60 % plus important que celui d’un placenta normal. Le syndrome LOS est donc plus la traduction de dérégulations des échanges fœtomaternels aux dépens des tissus fœtaux que la manifestation d’une croissance exagérée du seul fœtus. Ce résultat confirme des données établies chez la souris où les placentas à terme sont plus développés que la normale [9] (et nos données ci-dessous).

La croissance exagérée du trophoblaste observée après clonage évoque la situation qui prévaut lors du développement d’embryons de souris à partir du seul génome paternel [10]. Pourtant les perturbations observées dans les profils d’expressions géniques ne concernent pas seulement les gènes à expression paternelle (classe des gènes soumis à empreinte parentale) mais aussi les autres classes de gènes [11]. En outre, le syndrome décrit ci-dessus n’est pas spécifique du clonage. Il peut aussi apparaître quand les gestations sont issues d’embryons fécondés in vitro puis cultivés avant leur transplantation dans une femelle porteuse. Par exemple, il a pu être montré chez la brebis qu’un seul facteur, par exemple le lot de sérum utilisé dans le milieu de fécondation ou de culture pouvait contribuer à augmenter la fréquence d’apparition de ce syndrome [12]. Même si dans ce cas-là, la prévalence de la pathologie est beaucoup plus faible qu’après clonage, ces données confirment qu’une perturbation très précoce de l’environnement embryonnaire peut avoir des effets à long terme non seulement sur son développement au cours de la gestation mais aussi après la naissance. De ces données il ressort que la reprogrammation des activités du noyau affecte surtout le dialogue entre l’embryon et son environnement et que le clonage reproductif animal peut être utilisé pour mieux comprendre la physiologie du développement placentaire et fœtal ( (figure 1) ).

Clonage reproductif animal et recherche biomédicale

Avec les clones animaux, il devient possible d’analyser au niveau moléculaire, mais sous un autre angle, les interactions entre le génome et son environnement maternel et leurs conséquences à long terme sur la physiologie de l’adulte. En effet, les mortalités consécutives au clonage révèlent l’importance du statut épigénétique des animaux et/ou celui de leurs tissus placentaire. Pour un génotype donné, on peut alors suivre le développement de chaque embryon ou fœtus cloné, caractériser son état physiologique au cours de la gestation ou après la naissance, prendre en compte l’évolution de son statut physiologique avec l’âge avant d’analyser l’état épigénétique de son génome. Ce faisant, il devient possible, pour un même régime nutritionnel et sous l’hypothèse que le génome soit bien resté identique entre clones (les mutations de l’ADN à effet sur le développement sont éliminées ou minoritaires), de définir la part de modifications épigénétiques dans l’ontogenèse de physiopathologies complexes comme celles évoquées plus haut (diabètes de type 2, obésité…) et aussi prévalentes chez l’homme. Les ruminants, dont la taille et la longue durée de gestation autorisent à la fois un suivi du développement fœtal et placentaire par imagerie et un prélèvement de tissus dès la deuxième moitié de la gestation deviennent alors des modèles de choix en complément des modèles de rongeurs utilisés classiquement. Ces espèces devraient permettre à l’avenir d’approfondir sur le plan moléculaire les observations maintenant nombreuses qui montrent l’importance chez les mammifères de l’induction fœtale [16] dans l’adaptation d’un organisme en développement à son environnement nutritionnel. Les clones, parce qu’ils permettent de créer des conditions expérimentales simplifiées (le génome est le même) pour des études de physiologie pourraient permettre de savoir si certains effets sur le développement sont à bénéfice immédiat (poursuivre la croissance fœtale) où à bénéfice potentiel différé (réponse adaptative prévisionnelle) comme proposé récemment [17].

Avec l’essor du clonage reproductif animal dont la faisabilité a d’abord été démontrée chez le mouton puis la vache avant d’être étendue aux rongeurs, de nouvelles possibilités d’utilisation des mammifères d’élevage comme modèles pour la recherche médicale se font jour. Cette biotechnologie, associée à la modification génétique des cellules donneuses de noyaux, a permis récemment de réaliser avec succès l’invalidation du gène prion chez le bovin [18] et la chèvre [19] offrant par là même de nouvelles possibilités d’études en recherche fondamentale. L’intégration du clonage dans des stratégies de reproduction artificielle validées de longue date en élevage bovin (insémination artificielle, congélation et transfert d’embryons), ou porcin (production d’embryons in vitro) ouvre maintenant la voie à des études pilotes de thérapie tissulaire visant à suivre in vivo le devenir d’auto- et d’allogreffes à partir de gènes rapporteurs ( (figure 1) ).

Les perspectives du clonage à finalité thérapeutique à partir des données de l’animal

Définition du clonage thérapeutique, applications

Faisabilité du clonage thérapeutique

Chez les primates, on a pu dériver des cellules ES à partir d’embryons de singes et aussi à partir d’embryons humains [25, 26]. Contrairement à ce qui avait été affirmé il y a quelques années [13] il est possible, chez le singe Rhésus, d’obtenir des blastocystes clonés à partir de cellules somatiques ([27], et, dans certaines conditions à une fréquence apparemment élevée (Zhou Qi & Ji Weizhi, communication personnelle). Ces données constituent une première étape vers l’établissement de lignées de cellules ntES. Il reste toutefois à démontrer de façon irréfutable que de telles cellules peuvent être dérivées de ces embryons clonés. L’annonce largement médiatisée, mais frauduleuse, d’un tel résultat par une équipe de Corée du Sud a contribué récemment à discréditer cette perspective. Ces errements ne sont hélas pas nouveaux quand les retombées des recherches sont potentiellement la source d’avancées thérapeutiques majeures. S’ils conduisent à renforcer la rigueur des procédures d’évaluation des équipes concernées, mais aussi de la politique de recherche suivie par leurs institutions, et à recommander plus de raison dans l’annonce des résultats [28], ils ne remettent pas fondamentalement en cause dans le cas présent la pertinence de cet objectif, validé avec le modèle murin.

La faisabilité du clonage thérapeutique a en effet été démontrée avec le modèle de souris rag2-/- immuno-déficiente [29]. Des blastocystes issus de transfert de noyau de cellules rag2-/- ont été générés, à partir desquels des cellules ntES ont été dérivées. Après manipulation génétique de ces cellules afin de corriger le défaut génétique, les cellules ntES ont été différenciées in vitro en précurseurs hématopoïétiques qui ont ensuite été greffés dans des souris rag2-/-. Une étude similaire a été réalisée dans un modèle de souris parkinsonienne [30]. Plusieurs autres arguments expérimentaux viennent à l’appui d’une identité fonctionnelle entre les cellules ES et les cellules ntES. Dans les deux cas, elles manifestent le même potentiel de différenciation non seulement in vitro mais aussi in vivo quand on les mélange avec des cellules embryonnaires normales (issues d’embryons fécondés) pour obtenir des souris chimères. Cette approche classique en embryologie expérimentale, montre que les cellules ntES peuvent comme les cellules ES participer à la formation de tous les tissus de l’organisme y compris ceux qui formeront la lignée germinale [8, 31]. Elles manifestent aussi une grande similitude dans le profil d’expression de leurs gènes comme en atteste une comparaison récente du transcriptome de 5 lignées de cellules ntES avec autant de lignées ES [32]. Ces données soulignent l’importance, pour la recherche médicale, des travaux sur le clonage thérapeutique chez l’animal ( (figure 1) ).

Un paradoxe à lever

Ce constat nous a conduit à caractériser, in vivo, le stade de développement à partir duquel le potentiel de développement de l’embryon cloné se restreint pour ensuite pouvoir évaluer l’effet propre de l’environnement in vitro. Comme indiqué au chapitre précédent, le stade blastocyste lui-même ne semble pas une étape limitante dans le développement de l’embryon cloné. Quelle que soit la cellule donneuse, c’est surtout après l’implantation que la chute dans le taux de survie est la plus spectaculaire (tableau 1). Nous venons d’identifier deux stades de restriction majeurs, ayant deux origines embryonnaires différentes. Le premier se manifeste tout de suite après l’implantation par une rapide dégénérescence de l’embryon ; il provient de défauts dans les cellules même de la MCI mais ces défauts sont « non autonomes cellulaires », c’est-à-dire que l’inclusion dans le tissu atteint (ici la MCI) de cellules normales (issues d’embryons fécondés) peut corriger le défaut. Le second trouve son origine dans des anomalies des tissus extra-embryonnaires : il se manifeste dès le début de la formation des feuillets embryonnaires (gastrulation), par une croissance anormale des tissus extra-embryonnaires, puis du placenta [33]. Dans ces conditions, comment les cellules pourtant anormales de la MCI des blastocystes clonés peuvent-elles donner naissance à des cellules ES aux propriétés apparemment normales ?

Une hypothèse est que la mise en culture a permis de sélectionner les quelques cellules correctement reprogrammées : dans ce cas, la conséquence pratique serait que les cellules ntES seraient effectivement indistinctes des autres. Au cours de la croissance rapide de la MCI en culture, la plupart de ses cellules cessent rapidement d’exprimer Oct4, un facteur de transcription essentiel au maintien de la pluripotence. On peut supposer que seules les quelques cellules Oct4 positives seront à l’origine des cellules ES, mais aucune preuve formelle n’a été apportée. Une autre hypothèse est que le micro-environnement des cellules en culture serait capable d’achever la reprogrammation des activités de leur noyau. Les contraintes nécessaires à l’apparition in vitro des cellules ES à partir de la MCI ne sont pas les mêmes que celles nécessaires in vivo, à la poursuite du patron de différenciation des cellules du blastocyste. En effet, in vitro, la croissance de la MCI se fait indépendamment du trophoblaste qui l’entoure (et qu’on a le plus souvent retiré), alors qu’in vivo elle implique une étroite collaboration avec les cellules du trophoblaste [20]. De surcroît, si les cellules de l’épiblaste sont encore pluripotentes, elles différent de celles de la MCI. La cinétique d’apparition et de disparition d’un certain nombre de marqueurs accompagne et souligne cette transformation [34]. Les cellules ES ont elles-mêmes une signature moléculaire spécifique qui, bien que proche globalement de celle de l’épiblaste, est distincte et se rapprocherait plutôt de celle des cellules germinales [35]. Par exemple, le gène ERas, responsable de la forte prolifération des cellules ES et de leur capacité à former des tératomes in vivo, est spécifiquement exprimé dans ces cellules, et pas dans la MCI [36]. Le blastocyste tardif, prêt à l’implantation, donc en voie de transition vers l’épiblaste, est le siège d’un important remodelage épigénétique, qui d’un état globalement peu méthylé, va le conduire vers un état différentiellement méthylé entre les 2 lignages principaux, extra-embryonnaire et embryonnaire [37, 38]. Ce processus est encore très mal connu, sauf pour le cas particulier de l’inactivation du chromosome X. Le chromosome paternel, d’abord inactif dans tout l’embryon, va se réactiver transitoirement dans l’épiblaste avant que l’un ou l’autre des chromosomes X soit inactivé dans chaque cellule de l’épiblaste [39]. Dans le cas de l’embryon cloné, le moment où apparaissent les anomalies de développement que nous avons identifiées coïncide avec celui de cette reprogrammation épigénétique. Il est important de savoir comment elle se déroule dans l’embryon cloné in vivo, et également dans les cellules ES qui en dérivent.

Afin de mieux comprendre la nature des cellules ntES et permettre une comparaison plus fine avec les cellules ES, il est nécessaire de s’intéresser à leur genèse. La mise en lumière de différences éventuelles dans la croissance initiale in vitro des cellules, dans la cinétique d’apparition de marqueurs spécifiques des ES, dans la structure épigénétique de la chromatine, permettra d’étayer l’une ou l’autre des hypothèses mentionnées plus haut. Les premières futures cellules ES ont-elles des caractéristiques qui les distinguent initialement des autres cellules de la MCI, quelles sont les contraintes qui, s’exerçant sur elles, leur permettent de maintenir l’expression d’Oct4 : autant de questions à considérer, dont les réponses permettront de mieux comprendre comment émergent les cellules ES, leur origine, et de résoudre le paradoxe apparent de l’existence des cellules ntES.

Des stratégies de recherche en débat

Une première vise à utiliser directement les embryons humains conçus in vitro dans le cadre d’une assistance médicale à la procréation et qui ne font plus l’objet d’un projet parental. Cette possibilité est prévue en France par article L. 2151-5 de la loi de Bioéthique de juillet 2004 sous réserve de la pertinence scientifique du projet de recherche. L’objectif peut alors être de constituer une banque de cellules ES humaines suffisamment représentative de la diversité des groupes d’histocompatibilité humains pour permettre de proposer à chaque patient candidat une thérapie tissulaire des cellules histocompatibles. Il a été montré qu’une banque rassemblant 150 lignées de cellules ES humaines pour des objectifs de thérapies tissulaires, pourrait représenter la diversité des trois principaux gènes d’histocompatibilité présents majoritairement dans l’espèce humaine permettant ainsi de limiter la fréquence des rejets de greffe [40] ; un typage préalable des embryons ne retenant que ceux où ces gènes seraient présents à l’état homozygote permettrait même de réduire ce nombre à seulement 10 lignées. Cette stratégie exclurait toutefois une partie de la population humaine et serait difficile à mettre en œuvre à l’échelle mondiale. Sa faisabilité chez l’animal devrait être considérée comme un prérequis.

Une autre stratégie consiste à valider avec d’autres espèces animales que la souris, la démonstration, déjà faite avec cette espèce, de la faisabilité du clonage à visée thérapeutique [29, 30]. Cette extension à d’autres modèles animaux implique l’isolement de cellules ES et des études cliniques ciblées longues et coûteuses. Elle s’inscrit plus dans une démarche de recherche en biologie fondamentale et en physiologie comparée (physiologie cellulaire pour l’isolement de cellules ES, physiologie tissulaire pour l’étude du devenir des greffes) que dans une démarche de recherche finalisée en vue d’établir les prérequis pour le clonage thérapeutique chez l’homme. Elle est malheureusement peu soutenue en France car sa finalité est bien, à terme, celle de la constitution par clonage d’embryons humains, une perspective formellement interdite par la loi (art. L-2151-4 de la loi de Bioéthique de 2004).

Une troisième voie enfin consiste à exploiter la conservation des mécanismes moléculaires mis en œuvre au tout début de l’embryogenèse des mammifères en faisant appel au cytoplasme d’ovocytes animaux plutôt que d’ovocytes humains pour engager la reprogrammation de noyaux humains. La possibilité d’un tel clonage hétérospécifique a été démontrée chez l’animal en utilisant par exemple le noyau et les ovocytes d’espèces phylogénétiquement très proches, le bovin (Bos taurus) et le gaur ((Bos frontalis) mais avec un taux de réussite très faible [41]. Avec des espèces plus éloignées, les embryons se révèlent incapables de se développer à terme après transfert dans une femelle receveuse. Des perturbations des activités mitochondriales [42] et très vraisemblablement une incompatibilité placentaire constituent apparemment deux obstacles à la réalisation d’une implantation normale. Mais les embryons commencent à se diviser et peuvent occasionnellement atteindre le stade du blastocyste.

C’est cette faculté qui a été mise à profit récemment par une équipe chinoise pour montrer que les quelques blastocystes obtenus après transfert de noyaux de cellules humaines dans des ovocytes énucléés de lapin pouvaient être utilisés pour établir des lignées de cellules de type ES [43]. Ce résultat est provocateur sur le plan de l’éthique. Mais sur le strict plan scientifique, il élargit encore un peu plus le champ des recherches sur la plasticité fonctionnelle d’un noyau somatique. Mis en œuvre chez l’animal, le clonage hétérospécifique est l’une des voies qui pourrait contribuer à mieux comprendre les mécanismes fondamentaux de l’embryogenèse précoce, comme par exemple ceux associés à la gestion des informations moléculaires stockées dans l’ovocyte et à l’établissement d’un dialogue moléculaire entre le cytoplasme et le noyau au début de l’embryogenèse [44]. Il ne saurait être question, en l’état de nos connaissances de proposer une recherche à finalité médicale. Mais s’il était confirmé (avec le cytoplasme de lapin par exemple), qu’une reprogrammation partielle des fonctions du noyau d’autres espèces animales était compatible avec l’obtention, in vitro, de lignées de cellules embryonnaires de type ES, alors la question de l’utilisation de cellules somatiques d’un patient comme source de noyaux se poserait, par exemple pour la mise au point de traitements pharmacologiques des désordres fonctionnels induits par une mutation génétique rare. Le recours à ces cellules pour des greffes hétérotypiques (hétérogreffes) pourrait alors aussi être envisagé. Mais les questions éthiques que poserait cette recherche devraient alors être soigneusement analysées et débattues.

Conclusion

Les données présentées dans cet article apportent un crédit scientifique au clonage à visée thérapeutique chez l’homme. D’une part, il apparaît relativement aisé chez la plupart des espèces animales étudiées, y compris les primates, d’obtenir par clonage un développement embryonnaire jusqu’au stade blastocyste, stade à partir duquel peuvent être dérivées des cellules embryonnaires pluripotentes (cellules ES). D’autre part, la faisabilité du clonage thérapeutique est maintenant démontrée chez la souris et l’extension à d’autres espèces dépend de la possibilité de pouvoir établir des lignées de cellules souches ES. Ce n’est le cas à ce jour que chez la souris et les seuls primates (et dans une moindre mesure le rat). Mais ce crédit scientifique reste insuffisant car les mécanismes qui permettraient d’expliquer comment un noyau de cellule différenciée peut, une fois placé sous l’emprise du cytoplasme ovocytaire, récapituler toutes les étapes du développement, restent largement incompris. Dans ce contexte, l’acquisition de connaissances fondamentales demeure une priorité.

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