Les analogues des gonadotrophines

ARTICLE

Un bref historique

La LH et la FSH sont deux hormones d'origine hypophysaire qui stimulent la gamétogenèse et la stéroïdogenèse dans l'ovaire et le testicule, alors que l'hCG, d'origine placentaire, agit en maintenant une forte production de progestérone par le corps jaune en début de grossesse. Ces trois hormones sont des glycoprotéines composées de deux sous-unités liées de façon non covalente, les sous-unités alpha et beta (figure 1). La sous-unité alpha est commune aux trois hormones alors que la sous-unité beta est différente, permettant de conférer à chaque hormone dimérique une activité biologique spécifique. Composée de 92 acides aminés, la sous-unité alpha contient 5 ponts disulfures qui contribuent à sa structure tertiaire, et deux chaînes glucidiques localisées au niveau des asparagines 52 et 78 (sites de N-glycosylation). Les sous-unités beta sont composées de 111 (FSH), 121 (LH) ou 145 (hCG) acides aminés. Bien que différentes, les sous-unités beta comprennent des régions très conservées. Elles ont notamment en commun 12 résidus cystéines localisés à la même position. Alors que la sous-unité beta de la LH (LHbeta) a un site de N-glycosylation, les sous-unités beta de la FSH (FSHbeta) et de l'hCG (l'hCGbeta) ont deux sites de N-glycosylation. Enfin, la sous-unité hCGbeta présente 4 sites de O-glycosylation sur les résidus sérine dans sa partie carboxyl-terminale. Les chaînes oligosacchariques branchées sur les sites de N-glycosylation ou de O-glycosylation représentent 18 à 45% de la masse totale des gonadotrophines et sont responsables de la micro-hétérogénéité observée entre les différentes préparations de gonadotrophines. Surtout, la présence de ces chaînes est indispensable pour induire une réponse biologique dans les tissus cibles.

Historiquement, les gonadotrophines naturelles humaines ont été utilisées en thérapeutique bien avant la caractérisation de leur structure biochimique, et c'est à partir des années 1960 que les gonadotrophines ont été préparées et distribuées par l'industrie pharmaceutique. Initialement, un mélange de FSH et de LH préparé à partir d'urines de femmes ménopausées (Human menopausal gonadotropin ou HMG) a été produit. En parallèle, des préparations d'hCG ont été effectuées à partir d'urines de femmes enceintes. Si les HMG contenant à la fois de la FSH et de la LH dans un rapport de 1 se sont avérées efficaces dans le traitement des anovulations, il a été nécessaire de modifier leur composition pour répondre à d'autres indications, notamment pour la stimulation simultanée de plusieurs follicules pour la fécondation in vitro (FIV) ou pour la stimulation d'un follicule dominant en cas d'ovaires polykystiques (OPK). Les observations cliniques et les progrès dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques ont montré que la présence de LH dans les préparations n'était pas essentielle, et des techniques industrielles de purification ont été développées pour éliminer la LH grâce à une chromatographie d'affinité qui retenait cette gonadotrophine. Cependant, le principe actif de ces préparations, à savoir la FSH, représentait moins de 5% des protéines présentes, et les protéines urinaires contaminantes co-purifiées avec le principe actif pourraient être à l'origine d'effets secondaires. Grâce à une chromatographie d'affinité qui permet d'éluer la FSH, il a été possible d'éliminer les protéines contaminantes et, en conséquence, d'augmenter considérablement l'activité spécifique des préparations de FSH [1].

La première génération d'analogues de gonadotrophines

Les procédés d'extraction de gonadotrophines à partir d'un milieu biologique naturel (urine) posent le problème de la constance des préparations d'un lot à l'autre. Ce problème a pu être résolu en grande partie grâce aux techniques de recombinaison génétique et à la production de gonadotrophines recombinantes. Les caractéristiques physico-chimiques et structurales des gonadotrophines ont orienté le choix du système d'expression de ces hormones recombinantes et notamment : (i) la structure tertiaire de chaque sous-unité impliquant de nombreux ponts disulfures (11 pour la FSH) ; (ii) la structure quaternaire (l'hétérodimérisation des deux sous-unités) ; et (iii) les modifications post-traductionnelles (la présence de chaînes oligosaccharidiques appropriées).

A titre d'exemple, la FSH recombinante a été produite après isolation des gènes codant pour les sous-unités alpha et beta à partir d'une banque d'ADN génomique de cellules de foie fœtal humain. Ces gènes ont été introduits dans des vecteurs d'expression distincts sous le contrôle d'un promoteur fort. Ces vecteurs ont ensuite été transfectés dans des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO). Ces cellules de mammifère produisent des sous-unités alpha et beta correctement repliées, glycosylées et assemblées en hormone dimérique avant d'être secrétées dans le milieu de culture dans une conformation biologiquement active. La caractérisation biochimique de la FSH recombinante a montré que, à l'instar des préparations de FSH d'origine hypophysaire ou urinaire, la FSH recombinante contient à la fois des sous-unités dont la séquence en acides aminés correspond à la séquence nucléotidique et des formes tronquées ne comprenant pas les acides aminés aux extrémités N-terminales des deux sous-unités. De façon intéressante, les structures oligosaccharidiques de la FSH recombinante se caractérisent par une sialilation incomplète mais toutes les structures oligosaccharidiques de la FSH recombinante se retrouvent dans le pool de structures de la FSH urinaire.

En pratique, les études cliniques effectuées avec la FSH recombinante, la LH recombinante ou l'hCG recombinante concluent à une remarquable efficacité de ces hormones recombinantes. Par exemple, il a été montré que le taux de réussite de la stimulation ovarienne en termes de grossesse après fécondation in vitro (IVF) ou injection intra-cytoplasmique de spermatozoïde (ICSI) était semblable en utilisant la FSH recombinante ou les HMG [2]. Une autre étude comparant l'efficacité de la LH recombinante et celle de l'hCG urinaire sur la maturation folliculaire finale (après désensibilisation avec un agoniste de la GnRH et stimulation ovarienne par la FSH recombinante) conclut que la LH recombinante a une efficacité comparable à l'hCG urinaire pour induire la maturation folliculaire finale et la lutéinisation précoce après fécondation in vitro et transfert de l'embryon [3]. Un autre essai clinique a comparé l'hCG recombinante et l'hCG urinaire pour induire la maturation folliculaire et la lutéinisation (après stimulation folliculaire initiale avec la FSH recombinante) chez les femmes bénéficiant de la technologie de reproduction médicalement assistée. Cette étude a montré que l'hCG recombinante est aussi efficace et mieux tolérée que l'hCG urinaire [4]. Finalement, ces différentes études cliniques confirment que ces hormones recombinantes sont de véritables analogues biologiquement actifs et peuvent être considérées comme une première génération d'analogues des gonadotrophines.

Vers une nouvelle génération d'analogues de gonadotrophines

De nouvelles données scientifiques ont dû être obtenues avant d'imaginer et de construire de nouveaux analogues des gonadotrophines. Ces données ont porté sur la structure tertiaire et quaternaire des gonadotrophines et sur les relations entre ces structures et leur activité sur les récepteurs.

Les études de structure ont été réalisées par cristallographie et c'est en 1994 qu'a été publiée la structure d'une première gonadotrophine, l'hCG. Il s'avère que l'hCG fait partie de la superfamille des facteurs de croissance à nœud de cystine. Surtout, il a été montré que, de façon surprenante, les sous-unités alpha et beta, bien que n'ayant aucune similitude dans leurs séquences en acides aminés, ont des structures tridimensionnelles remarquablement proches (figure 2). Enfin, il apparaît que l'hétérodimère serait stabilisé par une « ceinture » formée par l'extrémité carboxyl-terminale de la sous-unité beta qui vient entourer la sous-unité alpha. Des données récentes publiées par le groupe de James Dias montrent que les structures de la FSH présentent des caractéristiques assez semblables.

Pour étudier les relations structure-activité, il a été employé des approches par cartographie épitopique à l'aide d'anticorps, par clivage enzymatique ou chimique ou par mutagenèse dirigée. Grâce à ces approches, il a été montré que l'extrémité carboxyl-terminale de l'hCGbeta (CTP) est responsable de la longue demi-vie de l'hCG dans la circulation. Puisque l'un des problèmes rencontrés en clinique avec la FSH est sa courte demi-vie qui impose des injections multiples, il a été réalisé par recombinaison génétique une fusion du CTP de l'hCGbeta à la sous-unité FSHbeta afin d'obtenir un agoniste de la FSH avec une demi-vie plus longue dans la circulation et une bioactivité
in vivo supérieure (figure 3a). A l'inverse, une FSH à demi-vie courte peut être avantageuse dans certaines situations cliniques à haut risque d'hyperstimulation ovarienne. Ceci a été réalisé en éliminant un ou plusieurs groupes sucrés fixés sur les résidus asparagines des chaînes alpha ou beta, ce qui a conduit à des analogues de la FSH éliminés plus rapidement de la circulation et avec une activité in vivo plus faible.

Les études structurales et les données obtenues par mutagenèse dirigée ont également permis de construire des analogues où les problèmes liés à l'assemblage et à la dissociation des sous-unités alpha et beta sont surmontés. Ainsi, il a été construit des analogues de l'hCG « simple chaîne » par fusion de l'extrémité carboxyl-terminale de l'hCGbeta avec l'extrémité amino-terminale de l'hCGalpha (figure 3b). Cette orientation était basée sur les données montrant que les extrémités C-terminale de l'hCGbeta et N-terminale de l'hCGalpha contiennent des sites déterminants pour la liaison avec le récepteur. De plus, l'extrémité CTP de l'hCGbeta sert de « maillon » (linker) entre les deux chaînes [5]. De façon également surprenante, il a été montré que l'analogue ainsi produit en cellules CHO ou en cellules d'insectes avait une activité biologique in vitro et in vivo comparable à celle de l'hCG native. Sur ce modèle, des analogues « simple chaîne » de la LH et de la FSH (figure 3c) ont été construits en utilisant toujours le CTP comme « maillon », et il a également été montré que ces analogues étaient biologiquement actifs. Une autre approche a été utilisée pour lier les chaînes alpha et beta : en introduisant des résidus cystéines dans ces chaînes, il a été réalisé des ponts disulfures et il s'avère que les mutants de l'hCG, de la FSH et de la LH ainsi construits se lient à leur récepteur, sont biologiquement actifs et sont plus thermostables que les hormones natives. En fait, ces modèles « simple chaîne » ont été de puissants outils pour mieux comprendre les relations structure-activité des gonadotrophines. Ils ont montré que les résidus de la sous-unité alpha importants pour l'assemblage des sous-unités n'ont pas une forte influence sur la bioactivité puisqu'ils peuvent être remplacés dans les analogues « simple chaîne » sans affecter l'activité biologique de ces analogues. En fait, une association étroite entre les domaines d'interaction alpha et beta n'est pas nécessaire pour l'activité biologique des dimères. Ces données impliquent que, si les interactions quaternaires sont essentielles pour le trafic intracellulaire des hétérodimères (assemblage, apprêtage des oligosaccharides spécifiques de chaque hormone et secrétion), elles ne le sont pas pour la reconnaissance du récepteur et pour l'activation des signaux. Le fait que les hétérodimères alpha-beta avec différentes conformations (native, « simple chaîne », addition de ponts disulfures...) se lient et activent le récepteur suggèrent que les récepteurs des gonadotrophines reconnaissent différentes formes de ligands. Une telle permissivité pour des variations structurales des dimères alpha-beta pourrait être due au domaine extracellulaire des récepteurs pour ces hormones, qui est particulièrement large.

Cette permissivité a des implications importantes dans la définition d'analogues de gonadotrophines utilisables en clinique puisque des contraintes structurales modérées facilitent la construction d'agonistes ou d'antagonistes avec une taille et une complexité réduites. Ainsi, il a été construit une « mini »- hCG. De tels « mini »-analogues pourraient être utiles en clinique, en association avec d'autres formes de gonadotrophines ou pour éviter la voie parentérale.

A l'inverse des « mini »-analogues, il a été construit des « maxi »-analogues, en l'occurrence des chimères « triple domaines » sur les bases rationnelles suivantes : (i) il existe une permissivité dans la structure quaternaire des dimères alpha-beta sans modification importante de l'activité biologique (voir paragraphes précédents) ; et (ii) les sites de contact de la sous-unité alpha avec les différentes sous-unités beta différent en fonction de la sous-unité beta, rendant possible l'interaction d'une sous-unité a avec deux sous-unités beta. Une chimère «triple domaines» a alors été construite avec l'orientation FSHbeta-CTP-CGbeta-alpha (figure 3d). Produite dans des cellules CHO, il s'avère que cette chimère « triple domaines » se lie avec une forte affinité à la fois au récepteur FSH et au récepteur CG/LH. Surtout, il apparaît que les activités biologiques de ces structures trimériques peuvent être influencées par les arrangements des sous-unités beta. Ceci pourrait avoir des implications cliniques. En effet, ces observations suggèrent une méthode pour modifier les rapports entre l'activité FSH sur LH d'une même molécule, conduisant à la définition d'analogues des gonadotrophines avec une activité biologique double et modulable. De tels analogues pourraient être utilisés pour un traitement « sur mesure » des infertilités où la demi-vie et l'activité de la FSH et de la LH seraient adaptées à la patiente.

CONCLUSION

REFERENCES

1. Dreano M., Ythier. A. 1997. Production et purification des gonatropines naturelles et recombinantes pour la clinique humaine. In : Les gonadotropines. Y. Combarnous & P. Volland-Nail, Eds. INRA Paris, pp. 305-317.

2. Strehler E., Abt M., El-Danasouri I., De Santo M., Sterzik. K. 2001. Impact of recombinant follicle-stimulating hormone and human menopausal gonadotropins on in vitro fertilization outcome. Fertil Steril 75 : 332-336.

3. The European recombinant LH study group. 2001. Human recombinant luteinizing hormone is as effective as, but safer than, urinary human chorionic gonadotropin in inducing final follicular maturation and ovulation in in vitro fertilization procedures : results of a multicenter double-blind study. J Clin Endocrinol Metab 86 : 2607-2618.

4. International recombinant human chorionic gonadotropin study group. 2001. Induction of ovulation in world health organization group II anovulatory women undergoing follicular stimulation with recombinant human follicle-stimulating hormone: a comparison of recombinant human chorionic gonadotropin (rhCG) and urinary hCG. Fertil Steril 75 : 1111-1118.

5. Garcia-Campayo V., Boime I. 2001. Novel recombinant gonadotropins. Trends Endocrinol Metab 12 : 72-77.