Intérêt de l’analyse protéomique différentielle pour caractériser l’hypertension rénovasculaire

ARTICLE

Auteur(s) : Florence Pinet

Inserm U508, Institut Pasteur de Lille, 1, rue du Professeur Calmette, 59019 Lille Cedex

Le protéome est un concept désignant l’ensemble des protéines produites à partir du génome à un instant précis. L’analyse protéomique est une approche innovatrice pour analyser le protéome et déterminer les changements coordonnés des niveaux protéiques dans les tissus et les cellules [3, 4], en utilisant principalement l’électrophorèse bi-dimensionnelle (gel 2D) (figure 1). Les protéines sont séparées selon leurs propriétés biochimiques : par leur point isoélectrique (pI) avec la technique d’isoélectrofocalisation et par leur masse moléculaire (Mr) avec la technique gel SDS-Page.

Pour comprendre les mécanismes impliqués dans cette forme d’hypertension, les auteurs ont utilisé le modèle expérimental développé par Goldblatt [5] chez le chien, dans lequel une des artères rénales est ligaturée pour diminuer de manière chronique la perfusion rénale, l’autre rein n’étant pas touché. En utilisant l’approche protéomique, Pinet et al. [6] ont étudié les différences d’expression des protéines au niveau des artérioles afférentes provenant du rein clippé et du rein controlatéral dans le modèle d’hypertension rénovasculaire, 1 clip-2 reins chez le rat. La présence de troponine T dans les artérioles rénales a été montrée et son expression a été confirmée par immunomarquage.

Dans ce modèle d’hypertension rénovasculaire, l’imagerie en microscopie confocale de la rénine et de la troponine T a permis de suggérer que la troponine T est un nouveau (et potentiellement important) marqueur de différenciation des cellules musculaires lisses dans les artérioles rénales en cellules juxtaglomérulaires productrices de rénine.

Résultats

Modèle expérimental d’hypertension rénovasculaire

Une augmentation de la pression artérielle systolique avec un débit cardiaque normal a été observée au bout de 2 semaines chez les rats rénovasculaires avec une diminution de 42 % du poids du rein clippé par rapport au rein controlatéral. De plus, il a été montré comme attendu une élévation d’un facteur 5 des taux de rénine plasmatique (tableau 1).

L’hypertension rénovasculaire est créée chez des rats Lewis normotendus par ligature de l’artère gauche à l’aide d’un clip de 0,2 mm comme décrit précédemment [7]. Les valeurs correspondent à un traitement de 2 semaines.
Pour les animaux avec un clip de 0,2 mm, les valeurs correspondent à la moyenne ± SE.
BP : pression artérielle systolique ; HR : débit cardiaque ; ARP : rénine active plasmatique mesurée au moment du sacrifice par dosage radio-immunologique [8].

Analyse protéomique

La figure 2 montre une carte protéomique de référence établie à partir de 5 gels représentant les artérioles afférentes. Environ 1 000 spots polypeptidiques ont pu être visualisés pour chacun des échantillons (rein clippé, rein controlatéral). Les spots numérotés représentent les spots polypeptidiques différentiellement exprimés entre le rein clippé et le rein controlatéral. L’analyse différentielle a permis de mettre en évidence 14 protéines avec une différence d’expression d’un facteur au moins 1,5. Trois protéines étaient surexprimées (spots 529, 721, 1022), une protéine était supprimée (spot 670) et dix étaient sous-exprimées (spots 332, 408, 428, 567, 588, 617, 1025, 1134, 1138) dans les cellules des artérioles afférentes de rein clippé.

La spectrométrie de masse a été utilisée pour identifier les protéines différentiellement exprimées et le principe est brièvement décrit dans la figure 3. Parmi les 14 protéines différentiellement exprimées, 3 n’ont pas pu être identifiées par spectrométrie de masse (spots 529, 567 et 721). Cinq des protéines identifiées sont des enzymes impliquées dans le métabolisme, une n’a pas de fonction connue : la protéine Rik (spot 588) ; trois ont une origine musculaire : la lamine A (spot 428), la pyruvate kinase M1 isozyme (spot 487) et la troponine T (spot 1138).

Imagerie cellulaire

La microscopie confocale a été utilisée pour mettre en évidence l’expression de la troponine T et de la rénine dans le rein. Il a été montré que le rein contralatéral (figure 4A) contient quelques cellules exprimant la rénine au niveau du pôle vasculaire du glomérule tandis que toutes les cellules musculaires lisses le long de l’artériole afférente et au niveau des artères interlobulaires expriment la troponine T. Par contre, dans le rein clippé, il y a un nombre important de cellules productrices de rénine le long de l’artériole afférente avec une diminution du nombre de cellules exprimant la troponine T (figure 4B). Ces résultats sont en accord avec les résultats obtenus en gels bi-dimensionnels. De plus, il n’a jamais été observé de co-localisation de la rénine et de la troponine T dans les mêmes cellules d’origine rénale, montrant que les cellules productrices de rénine n’expriment pas la troponine T.

Discussion

L’hypertension rénovasculaire est une forme d’hypertension rénine-dépendante dont la cause est une sténose de l’artère rénale. Le phénotype rénal est caractérisé par un recrutement de cellules productrices de rénine [11]. Sequeira Lopez et al. [12] ont montré que les cellules juxtaglomérulaires et les cellules musculaires lisses avaient pour origine les mêmes cellules mésenchymateuses (MC) métanéphriques.

L’analyse protéomique a été réalisée pour caractériser l’expression protéique rénale différentielle en utilisant un modèle expérimental d’hypertension rénovasculaire dans le but de déterminer les facteurs/protéines impliqués dans ce processus. Miksche et al. [13] ont établi le modèle 1 clip-2 reins chez le rat caractérisé par un fonctionnement contrasté des deux reins. Dans le rein clippé, l’expression, le stockage et la sécrétion de rénine sont augmentés tandis que, dans le rein controlatéral, exposé à l’hypertension, l’expression de la rénine est diminuée [7]. Pour ces expériences, une souche de rat syngénique (rat Lewis) a été utilisée pour éliminer le facteur hétérogénéité génétique. L’extraction des protéines rénales a été effectuée 2 semaines après la pose du clip pour limiter les réponses adaptatives dues à une élévation de la pression artérielle. Le choix a été de ne pas utiliser le rein total comme l’avait fait Thongboonkerd et al. [14], car le rein est un organe complexe contenant plusieurs types cellulaires. Il a été aussi choisi de ne pas sélectionner seulement les cellules juxtaglomérulaires car elles représentent moins de 0,01 % des cellules rénales et ne permettent pas l’obtention d’une quantité de protéines suffisante [15] pour une analyse protéomique. La stratégie a été d’utiliser les artérioles afférentes de rein clippé et de rein controlatéral isolées en utilisant le protocole de Chatziantoniou et al. [9] adapté de Dubey et al. [16]. Cela a permis d’effectuer une analyse dynamique des processus affectant les artérioles afférentes durant le développement de l’hypertension rénovasculaire [6].

Pour la première fois, une carte protéomique des artérioles afférentes rénales a été effectuée. L’analyse comparative a mis en évidence 14 protéines différentiellement exprimées. De manière intéressante, 5 de ces protéines sont impliquées dans le métabolisme et 3 sont d’origine musculaire. Ces dernières ont été étudiées plus en détail du fait que la sténose de l’artère rénale entraîne une modification phénotypique des cellules musculaires lisses.

Une des choses les plus surprenantes que les auteurs ont montré est la présence de troponine T dans les artérioles rénales. D’autres techniques telles que l’immunohistochimie ont été utilisées pour confirmer les résultats. Un fort marquage de la troponine T a été observé le long de l’artériole afférente, localisé au niveau des cellules musculaires lisses dans les reins de rats témoins [6]. De manière intéressante, Zanellato et al. [17] ont montré la présence de protéines ressemblant à la troponine T dans les cellules musculaires lisses vasculaires de l’aorte de bœuf et dans les artère coronaires.

Les résultats obtenus par microscopie confocale sont en accord avec ceux obtenus avec l’analyse protéomique. Dans l’hypertension rénovasculaire, la diminution du marquage pour la troponine T est associée à l’acquisition du phénotype sécrétoire des cellules musculaires lisses qui, en retour, produisent de la rénine. L’expression de la rénine et de la troponine T est inversement régulée durant le développement de l’hypertension. Les deux protéines ne sont jamais exprimées dans la même cellule du rein car il n’a jamais été observé de co-localisation en imagerie confocale.

Les auteurs ont donc fait l’hypothèse que les modifications physiologiques induites par une sténose de l’artère rénale reproduisant l’hypertension rénovasculaire conduisent à l’acquisition d’un phénotype sécrétoire déclenchant la production de rénine. Ils proposent que la troponine T, dont la présence est montrée pour la première fois dans les artérioles afférentes rénales, pourrait être un marqueur de différenciation des cellules musculaires lisses.

Conclusion

Cette étude a montré l’intérêt d’utiliser une technologie récente, l’analyse protéomique, approche innovatrice pour déterminer les changements coordonnés des niveaux protéiques quantitatifs et qualitatifs dans une cellule ou un organe à un instant donné. Cette technique est complémentaire de l’approche transcriptionnelle car elle permet l’accès à des renseignements concernant les modifications post-traductionnelles (phosphorylation, glycosylation, acylation,...) affectant les protéines. En effet, ces modifications confèrent aux protéines leurs propriétés finales et des changements survenant dans les modifications post-traductionnelles peuvent transformer une protéine « normale » en protéine « anormale ». Un nombre élevé de ces protéines prédites par les données génomiques sont inconnues ou leur rôle n’a pas encore été identifié.

Cette technique permet de quantifier les protéines impliquées dans une pathologie par une analyse différentielle. Ses perspectives sont de pouvoir étudier les profils protéiques plasmatiques chez un individu sain malade ou sous traitement, ce qui permettra d’identifier des marqueurs spécifiques d’une maladie, de son évolution et des traitements prescrits.

Remerciements

Fondation Leducq pour son aide financière.

Références

1. Wiesel P, Mazzolai L, Nussberger J, Pedrazzini T. Two-kidney, one clip and one-kidney, one clip hypertension in mice. Hypertension 1997 ; 29 : 1025-30**.

2. Taugner R, Hackenthal E. The juxtaglomerular apparatus. New York : Springer-Verlag, 1989*.

3. Banks RE, Dunn MJ, Hochstrasser DF, Sanchez JC, Blackstock W, Pappin DJ, et al. Proteomics : new perspectives, new biomedical opportunities. Lancet 2000 ; 356 : 1749-56***.

4. Patterson SD. Mass spectrometry and proteomics. Physiol Genomics 2000 ; 2 : 59-65***.

5. Goldblatt HH, Lynch J, Hanzal RF, Summerville WW. The production of persistent elevation of systolic blood pressure by means of renal ischemia. J Exp Med 1934 ; 59 : 347-80**.

6. Pinet F, Poirier F, Fuchs S, et al. Troponin T as a marker of differentiation revealed by proteomic analysis in renal arterioles. FASEB J 2004 ; 18 : 585-8, Epub Janv 8***.

7. Michel JB, Dussaule JC, Choudat L, Auzan C, Nochy D, Corvol P, Menard J. Effects of antihypertensive treatment in one-clip, two kidney hypertension in rats. Kidney Int 1986 ; 29 : 1011-20***.

8. Menard J, Catt KJ. Measurement of renin activity, concentration and substrate in rat plasma by radioimmunoassay of angiotensin I. Endocrinology 1972 ; 90 : 422-30**.

9. Chatziantoniou C, Arendshorst WJ. Angiotensin receptor sites in renal vasculature of rats developing genetic hypertension. Am J Physiol 1993 ; 265 : F853-62***.

10. Joubert-Caron R, Le Caer JP, Montandon F, et al. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching : a proteomic approach to identify human lymphoblastoid cell line proteins. Electrophoresis 2000 ; 21 : 2566-75***.

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12. Sequeira Lopez ML, Pentz ES, Robert B, Abrahamson DR, Gomez RA. Embryonic origin and lineage of juxtaglomerular cells. Am J Physiol Renal Physiol 2001 ; 281 : F345-56***.

13. Miksche LW, Miksche U, Gross F. Effect of sodium restriction on renal hypertension and on renin activity in the rat. Circ Res 1970 ; 27 : 973-84*.

14. Thongboonkerd V, Gozal E, Sachleben LR, et al. Proteomic analysis reveals alterations in the renal kallikrein pathway during hypoxia-induced hypertension. J Biol Chem 2002 ; 277 : 34708-16**.

15. Kurtz A, Pfeilschifter J, Bauer C. Is renin secretion governed by the calcium permeability of the juxtaglomerular cell membrane ? Biochem Biophys Res Commun 1984 ; 124 : 359-66*.

16. Dubey RK, Roy A, Overbeck HW. Culture of renal arteriolar smooth muscle cells. Mitogenic responses to angiotensin II. Circ Res 1992 ; 71 : 1143-52**.

17. Zanellato AM, Borrione AC, Saggin L, Giuriato L, Schiaffino S, Sartore S. Troponin T- and troponin I-like proteins in bovine vascular smooth muscle. Circ Res 1991 ; 68 : 1349-61**.