ARTICLE
Les modifications associées à la survie, à
la prolifération ou à la différenciation de cellules
s'accompagnent de variations de l'expression de gènes. Aussi, depuis
de nombreuses années, et dans de nombreux domaines de la biologie,
la possibilité de quantifier l'expression de ces gènes joue
un rôle majeur. Plus récemment, des applications diagnostiques
fondées sur la quantification d'acides nucléiques ont pu
être élaborées, comme la détection de bactéries
et de virus, le dépistage de certains cancers...
Plusieurs méthodes permettent de quantifier les acides nucléiques.
Les plus anciennes correspondent à l'hybridation d'acides nucléiques
sur une membrane appelée northern-blot (hybridation d'ARN) ou southern-blot
(hybridation d'ADN). D'autres méthodes ont ensuite été
développées, mais toutes ces techniques nécessitent
une quantité importante de matériel d'étude. En revanche,
les techniques mettant en jeu une amplification d'acides nucléiques
par polymérisation en chaîne d'ADN (PCR) présentent
une sensibilité et une spécificité telles que de
nombreuses applications en biologie médicale ont pu être
développées à partir d'échantillons de faible
taille, notamment en hépato-gastroentérologie [1].
La PCR conventionnelle est une technique en point final. Les données
sont obtenues en fin de réaction, au niveau d'une phase de saturation
dite « plateau ». À ce stade, certains des composés
de la réaction deviennent limitants et la quantité de matériel
amplifié ne reflète pas la quantité d'acides nucléiques
de l'échantillon initial. La figure
1 illustre ce phénomène. Des échantillons ont
été dilués en série, et l'amplification d'un
gène (ici la beta2-microglobuline) a été réalisée
par 35 cycles d'amplification. Les produits d'amplification ont ensuite
été analysés par électrophorèse. La
figure 1 montre clairement
que les signaux obtenus sont semblables, bien que l'échantillon
n° 1 contienne 125 fois plus de cible que l'échantillon n°
4.
Les appareillages utilisés pour la PCR dite en temps réel
(PCR-TR) permettent, en plus de l'amplification, d'effectuer des mesures
de fluorescence au cours de chaque cycle de la PCR. L'amplification est
visualisée par une courbe de détection en temps réel.
Celle-ci montre l'augmentation du signal fluorescent au fur et à
mesure du nombre de cycles écoulés. Dans notre exemple,
la fluorescence est la même dans les 4 échantillons après
35 cycles (figure 1, B),
ce qui est concordant avec le résultat de l'électrophorèse.
En revanche, à des phases plus précoces de l'amplification,
des différences peuvent être observées facilement.
La PCR-TR collige les données d'amplification au point de départ
de la phase exponentielle de la PCR et permet par conséquent une
quantification beaucoup plus fiable que les autres techniques.
Principe de la quantification
Les résultats de l'amplification, par l'intermédiaire
de la mesure de fluorescence, sont collectés à chaque cycle.
Ils sont analysés lors des phases précoces de la PCR en
assignant un seuil arbitraire (seuil de détection ou threshold)
qui correspond à l'intensité de fluorescence significativement
plus élevée que le niveau de base. Le point d'intersection
entre la courbe d'amplification et la ligne seuil est défini comme
le Ct (cycle seuil ou cycle threshold). Plus la concentration en
cible d'un échantillon est grande, plus son Ct est faible. Une
valeur de Ct est ainsi déterminée pour chacun des points
de la gamme standard permettant de réaliser une courbe d'étalonnage
(figure 1, C). La quantité
de cibles dans l'échantillon à analyser est simplement déduite
de son Ct en se reportant sur cette courbe d'étalonnage. Ces calculs
sont réalisés par des logiciels dédiés. La
gamme étalon peut être réalisée à l'aide
de dilutions d'un plasmide contenant le gène cible, ou de l'ADN
extrait d'un nombre déterminé de cellules.
Génération de la fluorescence
La quantification se fait par mesure d'un signal fluorescent. Plusieurs
procédés permettent de générer cette fluorescence.
Le SYBR GreenTM est une molécule qui se fixe uniquement
à l'ADN double brin. Sa forme non liée est très faiblement
fluorescente (figure 2, A),
alors que sa liaison à l'ADN double brin lui permet d'émettre,
après excitation, une fluorescence intense (figure
2, B). Pendant la phase d'élongation de la PCR, le nombre de
molécules de SYBR GreenTM liées à l'ADN
synthétisé augmente, ce qui se traduit par une augmentation
de la fluorescence. La fluorescence du SYBR GreenTM est enregistrée
à la fin de chaque cycle. Comme la quantité d'ADN augmente
au cours de l'amplification, le taux de fluorescence mesurée augmente
proportionnellement.
L'utilisation de sondes fluorescentes est également très
répandue. Le principe du transfert d'énergie est utilisé.
Quand le spectre d'émission d'un fluorophore (donneur) chevauche
le spectre d'excitation d'un autre fluorophore (accepteur), l'excitation
du donneur induit la fluorescence de l'accepteur. Ce phénomène
est extrêmement dépendant de la distance entre le donneur
et l'accepteur. Il existe plusieurs types de sondes. Les plus couramment
utilisées sont les sondes d'hydrolyse et les sondes d'hybridation.
Sondes d'hydrolyse
Ce sont les sondes les plus utilisées aujourd'hui. Cette méthode
est fondée sur l'utilisation de l'activité exonucléasique
de l'ADN polymérase (c'est-à-dire sa capacité à
dégrader des molécules d'ADN à partir des extrémités)
et sur l'utilisation d'une sonde doublement marquée avec un absorbeur
d'énergie (A) et un rapporteur (R). Lorsque le rapporteur est excité,
le transfert d'énergie s'effectue. L'absorbeur émet une
lumière, mais pas le rapporteur (figure
2, C). Pendant l'amplification, l'activité exonucléasique
de la polymérase dégrade la sonde hybridée sur la
séquence cible, entraînant un éloignement des deux
fluorophores (figure 2, D).
Le rapporteur peut alors émettre une fluorescence proportionnelle
au nombre de copies du gène amplifié.
Sondes d'hybridation
Le test d'hybridation nécessite l'utilisation de deux sondes
différentes : une sonde donneur d'énergie A et une sonde
B qui l'accepte. Elles sont conçues pour reconnaître deux
séquences adjacentes sur le fragment d'ADN amplifié et de
telle sorte qu'elles soient distantes de quelques bases. En l'absence
d'ADN cible spécifique, l'éloignement spatial de ces deux
sondes ne permet pas de transfert d'énergie de A vers B et, dans
ce cas, seul A émet une fluorescence (figure
2, E). Au cours de l'amplification, les deux sondes s'hybrident sur
le fragment amplifié. La proximité de ces deux molécules
permet alors, après l'excitation du marqueur A, un transfert d'énergie
entraînant une émission de fluorescence de B (figure
2, F). Seule la fluorescence de B est mesurée en fin de phase
d'hybridation de la PCR. La quantité de fluorescence émise
est là aussi proportionnelle à la quantité d'amplicons
synthétisés.
Applications en hépato-gastroentérologie
Ces techniques sont aujourd'hui utilisées communément
dans la plupart des laboratoires de recherche afin d'analyser l'expression
de gènes et d'étudier leur régulation. À côté
de ces applications en recherche fondamentale, le diagnostic commence
à bénéficier de cette nouvelle technologie. L'utilisation
clinique la plus courante de la PCR quantitative en temps réel
aujourd'hui réside dans la détection et la quantification
d'organismes infectieux. En hépato-gastroentérologie, citons
par exemple la détection d'Escherichia coli entéro-hémorragique
[2], la mesure de la densité en Helicobacter pylori de la
muqueuse gastrique [3] et la quantification du virus de l'hépatite
C dans le sérum de patients [4].
L'oncologie est également un domaine ou l'utilisation de la PCR-TR
se développe rapidement. Une étude récente montre
l'existence d'une corrélation entre l'expression de la thymidilate
synthétase, déterminée par PCR quantitative, avec
la survie des patients traités par 5-fluoro-uracil et oxaliplatine
[5]. Enfin, plusieurs travaux portant sur la détection et la quantification
de cellules de cancers gastriques ou coliques dans le sang ou les ganglions
lymphatiques ont été rapportés.
Conclusion
Les techniques de quantification par PCR en temps réel présentent
de nombreux avantages par rapport aux techniques classiques de quantification.
C'est la première méthode de quantification d'acides nucléiques
à être précise, reproductible et standardisable. Les
automates réalisent l'amplification, la détection de la
fluorescence et l'analyse des résultats dans un laps de temps extrêmement
court (généralement entre 60 et 90 min). Il n'y a plus d'analyse
des produits de PCR par électrophorèse. Toute la réaction
se réalise dans un tube qui n'est pas ouvert, ce qui minimise les
risques de contamination. Cette technologie est adaptée à
la quantification d'ADN et d'ARN. Dans ce dernier cas, la rétrotranscription
et l'amplification peuvent être réalisées soit séparément,
soit dans le même tube en une seule réaction. La mise au
point des techniques est généralement simple et rapide et
la réalisation des PCR-TR permet d'analyser un grand nombre d'échantillons
en même temps. La zone de linéarité de réponse
est très grande, couvrant une région allant d'un facteur
1 à 108. Le SYBR GreenTM est de coût
peu élevé. Les méthodes utilisant des sondes sont
plus difficiles à optimiser mais sont plus spécifiques du
fait de l'hybridation de la (ou des) sondes. Le prix d'achat d'un appareil
dédié varie entre 50 000 et 100 000 euros.
Références
1. Denis MG, Lustenberger P. Amplification élective d'ADN
par PCR : applications en hépato-gastroentérologie. Hépato-Gastro
1995 ; 1 : 49-57.
2. Bellin T, Pulz M, Matussek A, Hempen HG, Gunzer F. Rapid detection
of enterohemorrhagic Escherichia coli by real-time PCR with fluorescent
hybridization probes. J Clin Microbiol 2001 ; 39 : 370-4.
3. Kobayashi D, Eishi Y, Ohkusa T, Ishige I, Suzuki T, Minami
J, et al. Gastric mucosal density of Helicobacter pylori
estimated by real-time PCR compared with results of urea breath test and
histological grading. J Med Microbiol 2002 ; 51 : 305-11.
4. Enomoto M, Nishiguchi S, Shiomi S, Tanaka M, Yokogawa T, Fukuda
K, et al. Changes in serum levels of hepatitis C virus genotype
1b monitored by real-time quantitative polymerase chain reaction as a
predictor of long term response to interferon-alpha treatment. Am J
Gastroenterol 2002 ; 97 : 420-46.
5. Shirota Y, Stoehlmacher J, Brabender J, Xiong YP, Uetake H,
Danenberg KD, et al. ERCC1 and thymidylate synthase mRNA levels
predict survival for colorectal cancer patients receiving combination
oxaliplatin and fluorouracil chemotherapy. J Clin Oncol 2001 ;
19 : 4298-304.
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