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Malgré des avancées majeures accomplies dans le diagnostic, la
stratification pronostique et le traitement des leucémies aiguës
lymphoblastiques (LAL), la majorité des LAL de l'adulte et environ
15 % des LAL pédiatriques ne sont pas guéries avec les
protocoles actuels.
L'étude cytogénétique conventionnelle des LAL a permis de
caractériser des sous-groupes pronostiques pris en compte pour
poser l'indication de greffe allogénique de cellules souches
hématopoïétiques en première rémission complète. On distingue ainsi
:
- – les LAL à cytogénétique favorable, qui représentent
environ 50 % des cas pédiatriques : hyperdiploïdie,
translocation t(12;21) (TEL-AML1) ;
- – celles à cytogénétique défavorable représentant
environ 20 % des LAL pédiatriques : hypoploïdie, translocations
t(9;22) (BCR-Abl), t(1;19) (E2A-PBX1) ou translocations impliquant
le locus 11q23 (MLL).
Depuis un peu plus de cinq ans, l'équipe du St Jude Hospital a
mis au point et exploité les techniques d'analyse génomique pour
mieux comprendre la leucémogenèse, identifier de nouveaux marqueurs
pronostiques, et décortiquer les origines des rechutes. Après un
bref rappel technique, les résultats obtenus dans ces trois
domaines seront développés.
Rappels techniques
Les techniques de micro-array ont connu un essor important ces
dernières années. Elles reposent sur le principe de l'hybridation
des brins complémentaires d'acide nucléique (ADN ou ADN
complémentaire) entre un génome d'intérêt et un échantillon témoin
que l'on a préalablement déposé sur une « puce ». Les deux
échantillons étant marqués par un fluorochrome différent (rouge et
vert), l'analyse de la fluorescence finale permet de dépister des
zones de discordance entre les deux échantillons, ou copy number
alterations (CNA), qui représentent soit une perte, soit un gain de
matériel génétique de l'échantillon d'intérêt. Du choix de
l'échantillon témoin, constitué en pratique de centaines de
milliers de fragments dont l'ensemble couvre l'étendue du génome,
dépendront les performances du test : rapport signal/bruit, taille
de la délétion minimale détectable, couverture homogène du génome,
etc. Ainsi, les premières puces ont utilisé des chromosomes
bactériens artificiels d'environ 200 kb (BAC array),
permettant une couverture grossière du génome. Une plus grande
précision a été atteinte avec l'utilisation d'oligonucléotides de
20 à 100 nucléotides (oligo-CGH array), puis en intégrant
sur la même puce les différents allèles des centaines de milliers
de polymorphismes mononucléotidiques qui jalonnent le génome humain
(single nucleotide polymorphism [SNP] array). Cette dernière
approche, utilisée dans les différents travaux du St Jude Hospital,
permet non seulement la détection des CNA, mais permet également de
détecter les pertes d'hétérozygotie (loss of heterozygosity [LOH])
sans perte quantitative de matériel et qui résultent de disomie
uniparentale. Les plateformes actuelles analysent environ 1,8
million de SNP, permettant la couverture du génome humain avec une
résolution inférieure au kilobase.
Génomique et leucémogenèse
Dans une première étude, Mullighan et al. ont étudié, au
diagnostic, 242 LAL-B (parmi lesquelles tous les sous-types
génétiques étaient représentés) et 50 LAL-T par SNP-array [1]. Leur
travail a montré un nombre relativement faible de CNA dans chaque
prélèvement (en général inférieur à 6), traduisant une faible
instabilité génomique. Certaines altérations génomiques étaient
cependant récurrentes dans les LAL, dans des régions de
relativement faible taille, permettant une analyse plus approfondie
par séquençage. Cette équipe a ainsi pu mettre en évidence
l'altération de facteurs de transcriptions essentiels à la
lymphopoïèse B dans 60 % des cas, et en particulier du gène
PAX5 dans plus de 30 % des cas (figure 1).
L'expression de ce gène pouvait être altérée par des mécanismes
très différents (délétion, mutation, translocation), conduisant
tous à une perte de fonction de l'allèle, et contribuant à
la leucémogenèse par haplo-insuffisance.
Déterminants génomiques des LAL de haut risque
En comparant les profils génomiques de 43 LAL Ph1+ et de
128 leucémies myéloïdes chroniques (LMC) avec lesquelles elles
partagent le même transcrit de fusion, cette équipe a ensuite
essayé de comprendre comment une même anomalie génétique peut être
à l'origine de deux maladies aussi différentes [2]. Les deux
hypothèses prévalentes pour expliquer cette différence portaient
alors sur la taille du transcrit de fusion BCR-Abl (p185-190 ou
p210), et sur le stade de différenciation de la cellule cible de la
translocation transformante. L'analyse génomique a encore une fois
apporté des résultats majeurs, en retrouvant une délétion du locus
IKZF1 dans 84 % des LAL BCR-Abl et dans les LMC en transformation
lymphoblastique, mais pas dans les LMC en phase chronique. D'autres
lésions génomiques comme sur les locus PAX5 et CDKN2A/B
avaient le même modèle de distribution dans la cohorte, signant un
profil génomique différenciant la LMC en phase chronique et les LAL
Ph1+ (de novo ou secondaires).
Le locus IKZF 1 code pour un facteur de transcription à
doigt de zinc nommé IKAROS, dont la fonction est indispensable à la
lymphopoïèse comme en atteste le phénotype des souris KO pour ce
gène, qui n'ont pas de lymphocyte B, T, ni NK. Les délétions
du locus IKZF 1 dans les LAL sont à l'origine d'isoformes
dominant négatives, ce qui est à rapprocher du phénotype des souris
exprimant une forme dominant-négative d'IKAROS qui développent un
syndrome lymphoprolifératif agressif. De façon intéressante,
les sites de délétion interne d'Ikaros sont des séquences consensus
pour les recombinases Rag, ce qui suggère que ces enzymes
impliquées dans la recombinaison VDJ auraient également un rôle
dans la leucémogenèse. La voie était donc toute tracée pour
rechercher des anomalies d'IKZF 1 dans 221 LAL non Ph1+ issues
d'une cohorte pédiatrique de mauvais pronostic (d'après l'âge, le
sexe et la leucocytose) du St Jude Hospital [3]. Dans cette
cohorte, 19 % des patients ont une altération du locus IKZF 1
(délétion ou mutation), ce qui leur confère un mauvais pronostic
(risque de rechute à 5 ans 73 % vs 25 %) (figure 2).
La signature moléculaire de ces LAL de très haut risque est
proche de celle des LAL Ph1+, ce qui a suggéré aux auteurs de ce
travail l'hypothèse de l'existence d'une autre tyrosine kinase
activée constitutionnellement dans ces LAL.
C'est ainsi que les mutations des Janus Kinases (JAK) 1, 2, et 3
ont été découvertes dans 10 % des LAL de haut risque avec délétion
d'IKZF 1, la plupart dans le domaine pseudo-kinase de JAK2 (celui
touché par la mutation V617F des syndromes myéloprolifératifs),
entraînant une activation constitutionnelle de cette kinase
[4].
Lors de l'étude des pertes d'hétérozygotie par SNP-microarrays,
il a également été identifié une délétion impliquant la région
1 pseudo-autosomale de Xp22.3/Yp11.3 (PAR1), qui s'étend de la
région codante CRLF2 jusqu'à l'exon non codant P2RY8 [5, 6]. Cette
fusion résultante, P2RY8-CRLF2, est à l'origine de la surexpression
de CRLF2 (cytokine receptor like factor 2). On retrouve ce
réarrangement de CRLF2 dans 5 à 7 % des progéniteurs de LALB.
55 à 60 % des syndromes de Down ont ce réarrangement, avec
plus de 90 % de délétion de PAR1. Par ailleurs, on observe que tous
les patients ayant une mutation pour JAK ont un réarrangement de
CRLF2 alors que seulement 50 à 60 % des LAL avec réarrangement
de CRLF2 ont une mutation de JAK.
Le rôle de CRLF2 dans la leucémogenèse n'a pas été clairement
élucidé. On sait qu'il forme un hétérodimère avec IL7RA, et son
association fréquente avec la mutation JAK est en faveur d'une
coopération entre ces deux mutations. En effet,
l'expression concomitante de la mutation JAK2 et du réarrangement
de CRLF2 est à l'origine d'une activation constitutive de la voie
JAK-STAT et d'une transformation des cellules surexprimant
Ba/F3-Il7R.
En résumé, il est donc important de retenir les points suivants
dans le cadre des LAL de haut risque :
- – seule, la moitié des patients ayant un réarrangement
de CRLF2 a une mutation de JAK, ce qui nécessite le séquençage des
kinases restantes ;
- – dans le cas des LAL ayant une signature génomique «
BCR-ABL like », un tiers n'a pas d'altération chromosomique,
et beaucoup n'ont pas de mutation de JAK. Chez trois de ces
patients, deux nouvelles translocations ont été décrites :
NUP214-ABL1 et STRN3-JAK2 ;
- – chez les patients sans anomalie cytogénétique, plus de
la moitié n'a pas ces anomalies récemment décrites ;
- – de nouvelles approches sont donc nécessaires, à
commencer par l'étude de nouvelles cohortes dont les LAL en
échec, les LAL hypodiploïdes et les LAL de sujets plus âgés.
Analyse génomique des rechutes de LAL
Pour explorer les bases génétiques de la rechute, une étude
comparant les CNA entre les prélèvements au diagnostic et à la
rechute a été menée chez 61 patients en rechute de LAL [7].
Quarante-huit paires d'échantillons étaient évaluables. Dans la
majorité des cas (92 %), les échantillons au diagnostic et à la
rechute montraient des différences de CNA, avec des anomalies
acquises à la rechute qui affectaient préférentiellement les gènes
impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et le
développement cellulaire B. Les échantillons entre le
diagnostic et la rechute avaient un profil commun puisque 89 %
avaient au moins un CNA du diagnostic à la rechute. Cependant, la
plupart des prélèvements à la rechute avaient des délétions et des
gains de matériel absents au diagnostic (72 %), suggérant la
sélection d'un sous-clone préexistant au traitement, soit
l'apparition d'anomalies secondaires (tableau 1). Il a donc été effectué une
étude rétrospective des prélèvements du diagnostic par PCR pour y
rechercher 10 CNA acquis à la rechute : 7 étaient en fait
présents de façon minoritaire au diagnostic. Dans ces cas-là, les
anomalies génétiques contribuant à la rechute des LAL ont
probablement été sélectionnées durant le traitement : les voies de
signalisation affectées par ces altérations génétiques acquises
pourraient être des cibles thérapeutiques (figure 3).
Ces données ont été la base d'un travail présenté à l'ASH
en 2009 : le reséquençage de rechutes de LAL, sur
238 gènes cibles de CNA récurrentes [1-3, 7-9]. Les voies
de signalisation cibles de ces gains/délétions concernent
essentiellement le développement cellulaire B, les suppresseurs de
tumeur, la régulation du cycle cellulaire, et des facteurs de
transcription. Il a été retrouvé des mutations récurrentes
dans CREBBP (CBP) et ERG. Plusieurs arguments suggèrent que
les mutations de CREBBP ont un rôle pathogène, puisqu'elles
impliquent des résidus hautement conservés (R1408 et Q1462P),
et que l'on observe une duplication de la mutation de CREBBP
à la rechute par disomie uniparentale.
Tableau 1 Cibles des CNA acquis
à la rechute dans les LAL par ordre
de fréquence
|
Locus
|
B
|
T
|
|
Délétion
|
|
|
|
CDKN2A/B
|
16
|
2
|
|
ETV6
|
10
|
1
|
|
IKZF1
|
5
|
2
|
|
NR3C1
|
4
|
0
|
|
TCF3
|
3
|
0
|
|
DMD
|
2
|
0
|
|
ARPP-21
|
2
|
0
|
|
BTLA/CD200
|
2
|
1
|
|
RAG1/2
|
2
|
0
|
|
IKZF2
|
1
|
1
|
|
Gain
|
|
|
|
MYB
|
0
|
2
|
Conclusion
Les déterminants génomiques des LAL sont multifactoriels.
Les analyses génomiques de haute résolution permettent
d'identifier de nouvelles anomalies inframicroscopiques, ciblant
des voies de signalisation essentielles. L'intégration de l'analyse
génomique permet de définir de nouveaux sous-types de LAL, ainsi
que des cibles thérapeutiques potentielles. On sait maintenant que
la LAL est composée de clones multiples, avec des anomalies
génétiques différentes qui peuvent influencer la réponse
thérapeutique.
Pour l'avenir, l'utilisation de séquençage de nouvelle
génération à haut débit permettant l'étude rapide de l'intégralité
du génome et l'intégration de données additionnelles
telles que l'épigénétique, ou l'étude des miRNA, permettra
d'approfondir ces résultats prometteurs. Le St Jude Hospital a
ainsi mis en place un programme ambitieux de séquençage du génome
complet de 600 LAL pédiatriques dans les trois prochaines années !
Par ailleurs, il est également nécessaire d'analyser sur le plan
fonctionnel ces nouveaux sous-types de LAL, et d'intégrer les
données de la génomique dans les essais cliniques prospectifs afin
d'en tirer tout le bénéfice clinique potentiel.
Références
1 Goorha S, Radtke I, Miller CB, et al.
Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic
leukaemia. Nature 2007 ; 446 : 758-64.
2 Mullighan CG, Miller CB, Radtke I, et al.
BCR-ABL1 lymphoblastic leukaemia is characterized by the deletion
of Ikaros. Nature 2008 ; 453 : 110-4.
3 Mullighan CG, Su X, Zhang J, et al.
Children's Oncology Group. Deletion of IKZF1 and prognosis in acute
lymphoblastic leukemia. N Engl J Med 2009 ; 360 :
470-80.
4 Mullighan CG, Zhang J, Harvey RC, et al.
JAK mutations in high-risk childhood acute lymphoblastic
leukemia. Proc Natl Acad Sci USA 2009 ; 106 : 9414-8.
5 Hertzberg L, Vendramini E, Ganmore I,
et al. Rearrangement of CRLF2 is associated with mutation
of JAK kinases, alteration of IKZF1, Hispanic/Latino ethnicity, and
a poor outcome in pediatric B-progenitor acute lymphoblastic
leukemia. Blood 2010 ; 115 : 1006-17.
6 Mullighan CG, Collins-Underwood JR,
Phillips LA, et al. Rearrangement of CRLF2 in
B-progenitor- and Down syndrome-associated acute lymphoblastic
leukemia. Nat Genet 2009 ; 41 : 1243-6.
7 Mullighan CG, Phillips LA, Su X, et al.
Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute
lymphoblastic leukemia. Science 2008 ; 322 : 1377-80.
8 Akagi T, Shih LY, Kato M, et al. Hidden
abnormalities and novel classification of t(15;17) acute
promyelocytic leukemia (APL) based on genomic alterations. Blood
2009 ; 113 : 1741-8.
9 Kuiper RP, Schoenmakers EF, van Reijmersdal SV,
et al. High-resolution genomic profiling of childhood ALL
reveals novel recurrent genetic lesions affecting pathways involved
in lymphocyte differentiation and cell cycle progression. Leukemia
2007 ; 21 : 1258-66.
|
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