Contribution of bio-informatics analysis in non-Hodgkin’s lymphoma

ARTICLE

Auteur(s) :, Catherine Thieblemont, Gilles Salles^*

Service d’hématologie, centre hospitalier Lyon-Sud, EA 3737 « Pathologie des cellules lymphoïdes », Université Claude-Bernard, Lyon 1, 165, chemin du Grand-Revoyet, 69495 Pierre-Bénite Cedex

Aspects techniques

Plusieurs stratégies techniques ont été développées : 1) d’abord concernant le support solide avec le choix entre lames de verre ou membrane de nylon ; 2) puis concernant les produits immobilisés, avec soit les produits de PCR obtenus à partir de clones d’ADN complémentaire ou obtenus par amplification génique pour les organismes procaryotes (approximativement entre 0,6 et 2,4 kb), soit les oligonucléotides dits « courts », 20-25 mers (méthode Affymetrix) ou « longs », jusqu’à 70 mers ; et 3) enfin concernant le marquage : radioactivité, fluorescence, chémoluminescence ou colorimétrie. Chaque technique a des avantages et des inconvénients [4]. La limite la plus importante rapportée il y a 2-3 ans était la source des produits déposés, avec l’énorme quantité de clones de PCR devant être conservés et reproduits. En effet, malgré les meilleures pratiques, environ 1 à 5 % de ces clones ne contenaient pas la séquence supposée à cause de diverses contaminations (PCR, ADN bactérien ou phages) [5], tandis que les oligonucléotides qui paraissaient plus sûrs pouvaient également révéler des surprises, puisque la compagnie Affymetrix, référente en la matière, annonçait en 2000 que le tiers de sa puce « souris » comportait des séquences erronées [5]. Devant cette complexité, des efforts de standardisation concernant les annotations des expériences, la représentation des données, les contrôles ou les méthodes de normalisation ont été engagés depuis quelques années sur le plan international par l’organisme MGED (http://www.mged.org) afin que les biologistes puissent comparer leurs résultats, surtout lorsqu’ils sont obtenus sur des plates-formes technologiques distinctes.

La mesure simultanée de l’expression de milliers de gènes génère un ensemble de données complexe. Le problème critique est l’analyse de ces données qui nécessite des outils mathématiques et biostatistiques sophistiqués ainsi qu’une logistique informatique adaptée afin d’arriver à une interprétation ayant un sens biologique. Un certain nombre de méthodes d’analyse ont été proposées. Le regroupement d’un ensemble de gènes avec un profil d’expression similaire, autour d’une même fonction, par exemple prolifération, réponse immune, etc., présente un grand intérêt à la fois physiopathologique et pour assigner à ces signatures une ou des fonctions. Plusieurs méthodes de regroupement existent avec principalement deux grandes techniques : les algorithmes non supervisés et les algorithmes supervisés. Les algorithmes non supervisés, tels que le k-means, les som (self organizing maps) et le classement hiérarchique, vont permettre de regrouper les échantillons en fonction de la similitude de leur profil d’expression sans condition prédéfinie ni information sur les échantillons. Le classement hiérarchique est le seul à permettre de visualiser l’ensemble des données et est donc le plus utilisé [6, 7]. C’est typiquement la méthode utilisée, pour les lymphomes, par Alizadeh et al. [8]. La deuxième technique est l’algorithme supervisé, où le modèle algorithmique va être capable de prédire l’appartenance d’un échantillon à des classes préalablement définies. La probabilité de chaque échantillon d’appartenir à l’une ou à l’autre classe va être calculée en fonction des gènes les plus discriminants pour ces classes [6]. L’exemple pour les lymphomes est la méthode utilisée dans la publication de Shipp et al. [9]. La construction de modèles prédictifs d’un diagnostic ou d’un pronostic se fera ensuite par des méthodes statistiques pour définir les meilleurs gènes associés à la question posée.
Tableau 1 Identification des anomalies génomiques dans les lymphomes non hodgkiniens

Démembrement des lymphomes B diffus à grandes cellules (LBDGC)

La première analyse [8], réalisée par les laboratoires de Stanford, du National Institutes of Health (NIH, Bethesda) et le groupe d’Omaha, a utilisé une puce conçue pour les pathologies lymphoïdes, dite « Lymphochip », qui comprend environ 18 000 clones d’ADN complémentaires sélectionnés dans une librairie de cellules B des centres germinatifs (environ 12 000 ADNc) et enrichis par des gènes exprimés dans des lignées cellulaires de lymphome ou connus pour leur importance dans le système immunitaire et les cancers. Cette étude princeps a permis de découvrir par analyse non supervisée (regroupement hiérarchique) l’existence de deux catégories de LBDGC avec des signatures distinctes, l’une qui correspondrait au profil d’expression des cellules B normales des centres germinatifs (GCBC) et l’autre à celui des cellules B du sang périphériques activées par des anti-IgM ou la voie du CD40 (ABC). Le pronostic des patients porteurs de LBDGC avec un profil d’expression de type « centre germinatif » était meilleur, avec une survie projetée à 5 ans de 76 % contre 16 % pour l’autre groupe (tableau 2)( Tableau 2 ). Les variations d’expression de certains gènes clés impliqués dans la différenciation ou la transformation lymphoïde étaient aussi retrouvées dans ces sous-classes, tels BCL6, CD10, BCL7A, LMO2 dans les GCBC tandis que IRF4/MUM1, des inhibiteurs des caspases et BCL2 étaient hyperexprimés dans les lymphomes de type ABC. D’autres travaux [11] sur cette même série ont permis de montrer que les lymphomes de type GCBC présentaient un profil évolutif de mutations somatiques dans les gènes d’immunoglobuline et que les cas avec une translocation t(14;18)(q32;q21) ou qui exprimaient le marqueur CD10 se retrouvaient dans les lymphomes avec un profil de type GCBC. Ces résultats préliminaires ont conduit à l’organisation d’un programme international coordonné par L. Staudt et appelé LLMPP (leukemia lymphoma molecular profiling project) [12] qui a permis de rassembler 240 nouveaux échantillons LBDGC avec un recul d’observation médian de plus de 7 ans. L’analyse par regroupement hiérarchique de ces 240 cas (160 cas dans un premier groupe, puis 80 cas dans un second groupe de validation) a retrouvé les deux groupes prédictifs GCBC et ABC, et a mis en évidence un troisième groupe (type 3) encore mal caractérisé, mais qui contiendrait des lymphomes « atypiques » (certains lymphomes B riches en T, par exemple). Le groupe GCBC était à nouveau associé au réarrangement de BCL2 et à l’amplification de C-REL. La valeur pronostique du niveau d’expression de chaque gène a ensuite été testée par un modèle de Cox, les gènes les plus discriminants étant regroupés en 4 signatures : a) la prolifération cellulaire (c-myc, par exemple) ; b) la reconnaissance de la cellule d’origine (BCL6, par exemple) ; c) la présentation antigénique (MHC de classe II) ; et d) le tissu ganglionnaire (certains codant pour des protéines de la matrice extracellulaire). (Pour plus d’informations : http://www.llmpp.nih.gov/DLBCL). À partir de la sélection de 16 gènes les plus discriminants de ces 4 signatures et d’un gène hors signature codant pour BMP-6 (protéine de la famille du TGF-β), un modèle pronostique a été proposé permettant de distinguer les patients selon quatre groupes de pronostic significativement distinct. Ce modèle reste discriminant chez les patients avec un plus mauvais pronostic établi sur des critères clinicobiologiques classiques (score élevé de IPI) ainsi que chez les patients avec un bon pronostic (score IPI faible). Il se révèle donc indépendant de l’IPI. Il s’agit d’un outil puissant pour prédire l’évolution clinique des patients atteints de lymphomes B à grandes cellules, qui intègre l’analyse des paramètres biologiques présents dans la tumeur reflétant les altérations liées à la cancérogenèse, à l’origine cellulaire, et à la réponse immune, spécifique ou non. Dans le groupe des patients avec un mauvais pronostic, il a été montré une activation constitutive de la voie du facteur transcriptionnel NFκB, et les inhibiteurs pharmacologiques de cette voie tels les inhibiteurs du protéasome (PS-341) pourraient constituer un apport thérapeutique en association à la chimiothérapie, les premiers essais thérapeutiques étant en train de se mettre en place. Ces analyses ont été complétées par la validation protéique de ce profil différentiel avec l’étude de l’expression de 6 protéines (CD10, bcl6, MUM1, FOXP1, cycline D2, bcl2) dans 152 échantillons de LBDGC [13]. L’expression de bcl6 et de CD10 était significativement associée à une meilleure survie alors que l’expression de MUM1 et de la cycline D2 était associée à un mauvais pronostic. D’autre part, il était possible de classer ces patients en GCBC ou ABC en considérant l’expression de 3 protéines, CD10, bcl6 et MUM1, avec une différence de survie comparable à celle observée lorsque ces échantillons étaient séparés par l’analyse génomique par puce à ADN. Ces résultats indiquent que les informations apportées par l’étude du transcriptome, peu réalisable en routine clinique, peuvent être transférées vers des études en immunohistochimie réalisables au quotidien.

La deuxième étude a été menée par l’équipe de M.-A. Shipp en collaboration avec le Massachusetts Institute of Technology (MIT) à Boston [9], en utilisant une puce Affymetrix avec 6 817 gènes. Ce groupe a appliqué une analyse supervisée et a pu identifier un panel de 13 gènes qui serait suffisant pour prédire l’évolution clinique des patients LBDGC. Parmi ces gènes, certains étaient surexprimés chez les patients qui ont été guéris de leur lymphome : par exemple le gène appelé MINOR ou NOR1, qui est un récepteur nucléaire de la famille du NGF1B et qui pourrait sensibiliser les cellules tumorales à l’apoptose chimio-induite. D’autres sont surexprimés chez des patients dont l’évolution était fatale, telles la phosphodi-estérase PDE4B (dont les inhibiteurs induisent l’apoptose de cellules B in vitro) et la PKCβ1 qui est impliquée dans la signalisation du récepteur des cellules B (BCR). Ces deux derniers gènes pourraient constituer des cibles pour des interventions thérapeutiques, d’autant qu’il existe des inhibiteurs pharmacologiques actifs in vivo. Un deuxième travail collaboratif de ce groupe a été réalisé avec 176 échantillons analysés sur une puce Affymetrix pangénomique [14]. À l’aide de 3 algorithmes non supervisés (clustering hiérarchique, self-organizing maps, et un autre type de clustering probabiliste), les échantillons ont été clairement séparés en 3 groupes selon l’expression des gènes de différentes signatures, contenant pour la première appelée OxPhos de nombreux gènes impliqués dans la phosphorylation oxydative et les fonctions mitochondriales, contenant pour la deuxième BCR/proliferation des gènes du cycle cellulaire et de signalisation, et contenant pour la troisième host response des gènes reliés à l’activation des lymphocytes T. Par ailleurs, ces 3 groupes de patients différaient par la présence d’anomalies chromosomiques, puisqu’il existait une association entre les translocations impliquant BCL2 et le cluster OxPhos, les translocations impliquant BCL6 et la signature BCR/proliferation. Les auteurs suggèrent que le groupe de LBDGC exprimant la signature OxPhos pourrait être une cible logique pour des approches thérapeutiques utilisant les inhibiteurs de protéasome ou des inhibiteurs de BCL2, alors que les LBDGC exprimant la signature host response pourraient faire l’objet d’approches immunomodulatrices.

Ces résultats des 2 équipes américaines apparaissent plus complémentaires que divergents, compte tenu des différences dans la sélection des cas, des outils biologiques (gènes sur les puces) et informatiques utilisés. Un travail complémentaire récent du groupe de Staudt indique d’ailleurs que la classification qu’il propose peut être retrouvée dans l’étude de Shipp [15]. Dans ce travail, l’expression de la PKCβ1 (identifiée comme un gène dont la surexpression est associée à un pronostic défavorable dans l’étude de Boston) est ainsi essentiellement retrouvée dans le groupe des ABC [15]. Cependant, cette classification en sous-groupes de type GCBC et ABC nécessite probablement d’intégrer d’autres phénomènes d’hétérogénéité biologique, tels que les nombreuses anomalies cytogénétiques rencontrées dans les LBDGC (et qui ont aussi une valeur pronostique) ou les anomalies probables du contrôle du processus de mutations somatiques dans ces lymphomes pouvant conduire à l’hyper-mutation de gènes cibles (BCL6, PIM1, FAS, etc.) et à une instabilité génétique. Ces résultats n’appréhendent enfin que partiellement les mécanismes oncogénétiques aboutissant à la transformation des cellules B qui constituent la contrepartie normale de ces nouvelles sous-classes.

Ces résultats ont conduit à la réalisation d’une intéressante étude [16] de validation de la valeur pronostique des gènes publiés par les 3 grandes études internationales d’analyse d’expression génique [8, 9, 12] comme étant prédictifs de la survie dans les LBDGC, ainsi que 13 autres gènes prédictifs identifiés dans d’autres analyses. En utilisant une technique de RT-PCR quantitative, Lossos et al. ont pu ainsi démontrer que les niveaux d’expression de 6 gènes (LMO2, BCL6, FN1, CCND2, SCYA3 et BCL2) étaient significativement liés au pronostic des patients LBDGC, sans qu’aucun d’entre eux ne puissent prédire la survie de façon indépendante. Cependant, avec la pondération de la valeur d’expression de chacun de ces 6 gènes, il était possible d’identifier 3 groupes de patients de pronostic très différent, de façon indépendante de l’IPI.
Tableau 2 Les deux catégories de lymphomes B diffus à grandes cellules B (LBDGC) déterminées par Alizadeh et al. en 2000 [8]

Proximité génomique des lymphomes B du médiastin et de la maladie de Hodgkin

Les deux équipes ont donc analysé le transcriptome (sur les puces Affymetrix U133A et A133B pour l’une [17] ou sur la Lymphochip pour l’autre [18]) des lymphomes primitifs du médiastin (n = 34 pour Savage et al. [17] et n = 35 pour Rosenwald et al. [18]) et ont comparé les profils d’expression avec ceux observés dans les LBDGC et la maladie de Hodgkin. L’équipe de Boston a utilisé pour cette comparaison in silico des données publiées sur les maladies de Hodgkin et obtenues sur une puce Affymetrix moins dense [21]. L’autre équipe a choisi de réaliser la comparaison à partir de 2 types de données : d’une part l’hybridation de lignées cellulaires, (2 lignées cellulaires de Hodgkin – L428 et HDLM2 –, 1 lignée de lymphome du médiastin – K1106 – et 6 lignées de lymphomes B diffus à grandes cellules de type GC), et d’autre part des données également obtenues sur puce Affymetrix et comparées in silico [22].

Les résultats des 2 études sont très similaires, avec l’identification d’un profil spécifique des lymphomes B primitifs du médiastin. Une comparaison statistique de l’expression différentielle des gènes entre différentes entités a permis de conclure que le profil des lymphomes du médiastin était plus proche de celui des lymphomes hodgkiniens que de celui observé dans les LBDGC, avec une forte expression tant dans les lymphomes du médiastin que dans les lymphomes hodgkiniens des gènes des membres de la superfamille du TNF et de ses récepteurs (TNFSF4, TNFRSF6…), des voies de signalisations de cytokines (chaîne α de R-IL13…) et de certaines molécules impliquées dans l’adhésion ou les interactions avec la matrice extracellulaire (TNFAIP6, CD58/LFA3, intégrine αM…), et une faible expression de certains composants de la cascade de signalisation du BCR (NFATc, PKCβ…) et de l’endopeptidase CD10, contrairement au profil LBDGC. De plus, il était montré par immunohistochimie que la protéine cREL était localisée au niveau du noyau prouvant ainsi l’activité possible de la voie de NF-kB dans les 2 entités. Par rapport aux LBDGC, un certain nombre de gènes (respectivement 100 [17] et 46 [18]), incluant en particulier MAL, FIG1 et CD58/LFA3, ont permis de créer un prédicteur diagnostique et de classer ainsi les échantillons de lymphomes du médiastin et les LBDGC de façon correcte dans respectivement 97 % et 98 % des cas. Parmi les cas connus sur le plan anatomoclinique comme étant des LBDGC, 6 étaient classés comme lymphome du médiastin par le prédicteur moléculaire et ces patients présentaient de fait une localisation médiastinale prédominante ou exclusive tandis que 45 patients avec un profil de type LBDGC et une localisation ganglionnaire médiastinale présentaient une maladie disséminée sur le plan ganglionnaire (donc ne correspondant pas à la définition clinique des lymphomes primitifs du médiastin) [17].

L’ensemble de ces données confirme la singularité des lymphomes B du médiastin, valide l’expression de gènes (MAL) ou de voies de signalisation (JAK/STAT, récepteurs du TNF) particulières dans ces lymphomes et ouvre des perspectives intéressantes pour une compréhension globale de l’origine cellulaire des lymphomes du médiastin et des maladies de Hodgkin. Là encore, ces résultats ouvrent la voie vers de possibles interventions thérapeutiques ciblées.

Aide au diagnostic des lymphomes non folliculaires à petites cellules B

L’hybridation d’un groupe test de 99 échantillons provenant de patients atteints de l’une de ces 3 entités (LL, LCM, LZM de type splénique) a permis d’identifier par regroupement hiérarchique un profil bien distinct pour chaque entité [23]. En utilisant la technique du score discriminant et en se plaçant à un niveau de significativité de 10^-4 (test de permutation), 415 gènes ont été identifiés comme discriminant pour les 3 entités. Les 178 gènes dont l’expression était significativement corrélée au diagnostic de LL étaient liés aux fonctions d’adhésion cellulaire (P- et L-SÉLECTINE, intégrines, collagènes…), d’inhibition de l’apoptose (SURVIVINE, BCL2, TFNR10) et d’angiogenèse (FIGF, ANIOPOIETIN-LIKE 3). Les 154 gènes distinguant les LCM étaient liés à la prolifération cellulaire (PCNA, CDK4, cyclines F) et à la résistance aux drogues (MDR-ATP binding cassette, GST-π). Tous les LCM exprimaient la cycline D1 et les gènes qui lui sont liés dans le même cluster, indépendamment des autres gènes spécifiquement corrélés au diagnostic de LCM. Les 83 gènes liés au LZM splénique étaient inclus dans 2 clusters : des gènes liés à la signalisation intracellulaire (AKT1, AGER) et à la transcription (TCFP2, MXI1) et des gènes liés au site de prélèvement splénique. La création d’un prédicteur diagnostique a été basée sur la sélection des clusters de gènes discriminant les classes, pour s’affranchir de la signature d’organe « rate » polluant la signature des LZM. À partir des 44 gènes du prédicteur diagnostique ( (figure 2) ), l’ensemble des échantillons du groupe préliminaire a pu être classé, en particulier les cas frontières inclassables par les méthodes morphologiques classiques. Trois échantillons LCM avaient un profil génomique de type LZM. La validation de ce prédicteur a été réalisée par l’hybridation indépendante d’un groupe de validation (n = 28) et a permis le classement adéquat de 96 % des cas (4 échantillons n’ont pu être classés du fait de la mauvaise qualité de l’ARN). L’utilisation de ce prédicteur pour une application de routine est actuellement développée avec la mise au point de techniques immunohistochimiques en sélectionnant un set de marqueurs protéiques spécifiques correspondant à certains gènes surexprimés dans chacune des 3 entités.

Les lymphomes folliculaires et leur transformation

Les résultats ont mis en évidence que les 2 entités présentaient une différence d’expression transcriptionnelle pour un certain nombre de gènes (n = 113 [29] et n = 671 [30]). Elenitoba-Johnson et al. ont rapporté une surexpression dans les lymphomes folliculaires transformés des gènes liés à la croissance cellulaire (C-MET, FGFR3, LTβ-R, PDGF-Rβ) et en particulier p38β MAPK [29]. Cette kinase est un médiateur important dans la réponse au stress cellulaire et pourrait potentiellement servir de cible thérapeutique, d’autant que les auteurs ont confirmé la corrélation entre l’augmentation de la transcription du gène p38β MAPK et l’expression de la protéine, et que l’inhibition in vivo dans un modèle murin de l’activité de p38β MAPK induit une apoptose de lignées cellulaires de LBDGC avec une t(14;18) via la caspase 3.

Le groupe de Ron Levy à Stanford rapportait la dérégulation de gènes liés à l’organisation de la morphologie cellulaire (actines, tubulines) et surtout l’existence de 2 processus de transformation différents : l’un associé à une surexpression de C-MYC et de 91 de ses gènes cibles, et l’autre associé à une diminution de l’expression de C-MYC et de ses gènes cibles et qui serait lié, selon les auteurs, à des altérations des voies de mort cellulaire [30]. De plus, le profil transcriptionnel observé dans les lymphomes folliculaires transformés reste plus proche de celui des lymphomes folliculaires sans transformation que de celui des lymphomes B à grandes cellules de novo, indiquant bien l’existence d’événements génétiques distincts dans la genèse de ces pathologies.

Cette même équipe a aussi analysé des lymphomes folliculaires traités par l’anticorps monoclonal anti-CD20 (rituximab) et montré que l’expression des gènes impliqués dans la réponse immune non spécifique semblait pouvoir prédire la réponse à cet anticorps [31]. En particulier, les patients non répondeurs avaient un profil transcriptionnel dans les échantillons cliniques très proche de celui observé dans les organes lymphoïdes normaux, avec l’expression de nombreux gènes impliqués dans la réponse cytokinique (en particulier à l’interféron), dans la signalisation du TNF, des lymphocytes T ou du complément. Ces données suggèrent que les mécanismes d’action de cet agent thérapeutique, lorsqu’il est utilisé seul, sont dépendants des cellules immunitaires et peut-être de l’immunité innée (monocytes et cellules NK), rejoignant en cela d’autres observations obtenues par l’analyse génétique des individus [32].

Très récemment, un autre travail majeur a été réalisé par le groupe de Staudt sur une série de 191 cas de lymphomes folliculaires [33] qui démontre l’importance des cellules immunitaires réactionnelles des ganglions tumoraux dans la physiopathologie et le pronostic des lymphomes folliculaires, suggérant l’existence d’un contrôle de ces proliférations indolentes par l’hôte. Les auteurs ont développé un prédicteur moléculaire de survie basé sur 2 signatures appelées immune response 1 et immune response 2 permettant une ségrégation des patients en groupes de pronostic très différent. Les gènes de ces signatures pronostiques étaient exprimés par les cellules T, les macrophages ou les cellules dendritiques, mais pas par les cellules tumorales. Cela suggère que l’agressivité clinique du lymphome folliculaire est principalement déterminée par le microenvironnement ganglionnaire. Cela est donc différent de ce qui est décrit dans les LBDGC ou les lymphomes à cellules du manteau décrits ci-dessous.

Lymphomes à cellules du manteau et indicateur génomique quantitatif de survie

Pour tenter de mieux comprendre cette maladie, Rosenwald et al. ont analysé le profil transcriptionnel de 101 échantillons de LCM, dont 92 présentaient une surexpression de la cycline D1 [36]. L’hybridation a été réalisée sur une biopuce similaire à la Lymphochip utilisée pour l’analyse des LBDGC permettant ainsi de comparer facilement les données. Le premier résultat a montré que les LCM présentaient un profil bien distinct des LBDGC et d’autres lymphomes à petites cellules B tels que les lymphomes lymphocytiques. Ce profil, excluant la cycline D1, contenait plusieurs milliers de gènes permettant de créer un test diagnostique de 114 gènes et de classer 98 % des LCM de façon correcte, en particulier 7 des 9 cas de LCM n’exprimant pas la cycline D1.

Le second objectif était de déterminer un ensemble de gènes dont l’expression était associée à la survie. Sur l’ensemble des gènes de la biopuce, 48 avaient une valeur pronostique défavorable puisqu’une expression forte de ces gènes était associée à une survie courte [36]. Ces gènes étaient liés pour la moitié d’entre eux (28/48) à une signature de prolifération cellulaire. Parmi ces 28, les 20 ayant une variance la plus élevée parmi les LCM ont été sélectionnés pour créer une moyenne de prolifération pour chaque échantillon. Cette moyenne était inversement corrélée à la survie et pouvait prédire la survie de chaque patient dans le groupe préliminaire ou le groupe de validation avec une signification élevée (p = 7,44.10^-5), le nombre minimal de gènes pouvant prédire la survie étant de 4 gènes (CDC2, ASPM, tubuline-α, CENP-F).

La dernière partie du travail [36] a porté sur la compréhension des mécanismes moléculaires de cette prolifération cellulaire dans les LCM ( (figure 3) ). L’une des hypothèses émises par les auteurs est que la durée de survie dépendrait de différences quantitatives dans le niveau d’expression des transcrits impliqués dans la progression de la phase G1 et S du cycle cellulaire (( (figure 3) ), principalement le gène codant pour la cycline D1 ou, en ce qui concerne les patients « cycline D1-négatifs », les transcrits des gènes cycline D2 ou D3. Cette différence de niveau d’expression des différents transcrits serait liée pour la cycline D1 aux variations de l’extrémité 3′ UTR du gène de la cycline D1, à l’origine d’un transcrit de différente longueur – 4,5 kb ou 1,7 kb – pouvant expliquer une stabilité distincte. Les échantillons surexprimant le transcrit de 1,7 kb avaient un niveau de prolifération cellulaire plus élevé (p = 1,3.10^-7) et ces patients présentaient une survie plus courte (p = 7,97.10^-5). Les auteurs se sont ensuite interrogés sur la participation des gènes suppresseurs de tumeur intervenant au niveau de la phase G1, p16^INK4 et p14^ARF, les produits des 2 allèles du gène INK4/ARF. Les patients (21 %) qui présentaient des délétions du locus INK4/ARF correspondaient préférentiellement à des patients dont les échantillons étaient hautement proliférant, cette anomalie étant un paramètre indépendant de survie lorsqu’elle était ajoutée à la surexpression de la cycline D1. Pour les autres gènes suppresseurs de tumeur P53 et ATM, des délétions étaient retrouvées chez respectivement 11 % et 35 % des cas, mais de façon indépendante des délétions du locus INK4/ARF. De plus, ces délétions n’étaient pas reliées à la prolifération ou au pronostic des patients. Cela suggère que les délétions d’ATM ne seraient pas impliquées dans la dérégulation de la prolifération, mais dans d’autres processus oncogéniques des LCM. Ainsi, bien que 2 gènes (CYCLINE D1 et INK4/ARF) soient identifiés comme ayant un rôle clé dans la dérégulation de l’entrée de cellules LCM en phase S du cycle cellulaire, d’autres gènes non encore identifiés interviennent probablement dans le contrôle de la prolifération de ces cellules puisque le modèle statistique basé sur l’expression de ces 2 gènes ne pèse que pour un tiers du score pronostique établi par les auteurs.

Ainsi ce travail apporte-t-il plusieurs éléments importants tant dans la compréhension des mécanismes de dérégulation du cycle dans les lymphomes du manteau que pour la démarche diagnostique et pronostique de cette entité.

Conclusion

Références

2 Hermine O, Haioun C, Lepage E, et al. Prognostic significance of bcl-2 protein expression in aggressive non-Hodgkin’s lymphoma. Groupe d’Étude des Lymphomes de l’Adulte (GELA). Blood 1996 ; 87 : 265-72.

3 A predictive model for aggressive non-Hodgkin’s lymphoma. The International Non-Hodgkin’s Lymphoma Prognostic Factors Project. N Engl J Med 1993 ; 329 : 987-94.

4 Duggan D, Bittner M, Chen Y, Meltzer P, Trent J. Expression profiling using cDNA microarrays. Nat Genet 1999 ; 21(Suppl.1) : 10-4.

5 Knight J. When the chips are down. Nature 2001 ; 140 : 860-1.

6 Brown M, Grundy W, Lin D, et al. Knowledge-based analysis of microarray gene expression data by using support vector machines. Proc Natl Acad Sci USA 2000 ; 97 : 262-7.

7 Eisen M, Spellman P, Brown P, Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 95 : 14863-8.

8 Alizadeh A, Eisen M, Davis R, et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 2000 ; 403 : 491-2.

9 Shipp M, Ross K, Tamayo P, et al. Diffuse large B-cell lymphoma outcome prediction by gene-expression profiling and supervised machine learning. Nat Med 2002 ; 8 : 68-74.

10 Shipp MA. Prognostic factors in aggressive non-Hodgkin’s lymphoma : who has “high-risk” disease? Blood 1994 ; 83 : 1165-73.

11 Huang J, Sanger W, Greiner T, et al. The t(14 ;18) defines a unique subset of diffuse large B-cell lymphoma with a germinal center B-cell gene expression profile. Blood 2002 ; 99 : 2285-90.

12 Rosenwald A, Wright G, Chan W, et al., Project LLMP. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med 2002 ; 346 : 1937-47.

13 Hans C, Weisenburger D, Greiner T, et al. Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray. Blood 2004 ; 103 : 275-82.

14 Monti S, Savage K, Kutok J, et al. Molecular profiling of diffuse large B-cell lymphoma identifies robust subtypes including one characterized by host inflammatory response. Blood 2004.

15 Wright G, Tan B, Rosenwald A, Hurt E, Wiestner A, Staudt L. A gene expression-based method to diagnose clinically distinct subgroups of diffuse large B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA 2003 ; 17 : 9991-6.

16 Lossos I, Czerwinski D, Alizadeh A, et al. Prediction of survival in diffuse large-B-cell lymphoma based on the expression of six genes. N Engl J Med 2004 ; 350 : 1828-37.

17 Savage K, Monti S, Kutok J, et al. The molecular signature of mediastinal large B-cell lymphoma differs from that of other diffuse large B-cell lymphomas and shares features with classical Hodgkin’s lymphoma. Blood 2003 ; 102 : 3871-9.

18 Rosenwald A, Wright G, Leroy K, et al. Molecular diagnosis of primary mediastinal B cell lymphoma identifies a clinically favorable subgroup of diffuse large B cell lymphoma related to Hodgkin lymphoma. J Exp Med 2003 ; 198 : 851-62.

19 Barth T, Leithauser F, Joos S, Bentz M, Moller P. Mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma: where do we stand? Lancet Oncol 2002 ; 3 : 229-34.

20 Copie-Bergman C, Plonquet A, et al. MAL expression in lymphoid cells: further evidence for MAL as a distinct molecular marker of primary mediastinal large B-cell lymphomas. Mod Pathol 2002 ; 15 : 1172-80.

21 Schwering I, Brauninger A, Klein U, et al. Loss of the B-lineage-specific gene expression program in Hodgkin and Reed-Sternberg cells of Hodgkin lymphoma. Blood 2003 ; 101 : 1505-12.

22 Kuppers R, Klein U, Schwering I, et al. Identification of Hodgkin and Reed-Sternberg cell-specific genes by gene expression profiling. J Clin Invest 2003 ; 111 : 529-37.

23 Thieblemont C, Nasser V, Felman P, et al. Small lymphocytic lymphoma (SLL), marginal zone B-cell lymphoma (MZL), mantle cell lymphoma (MCL) exhibit distinct gene-expression profiles allowing molecular diagnosis. Blood 2004 ; 103 : 2727-37.

24 Lo Coco F, Gaidano G, Louie D, Offit K, Chaganti R, Dalla-Favera R. p53 mutations are associated with histologic transformation of follicular lymphoma. Blood 1993 ; 82 : 2289-95.

25 Sander C, Yano T, Clark H, et al. p53 mutation is associated with progression in follicular lymphomas. Blood 1993 ; 82 : 1994-2004.

26 Elenitoba-Johnson K, Gascoyne R, Lim M, Chhanabai M, Jaffe E, Raffeld M. Homozygous deletions at chromosome 9p21 involving p16 and p15 are associated with histologic progression in follicle center lymphoma. Blood 1998 ; 91 : 4677-85.

27 Yano T, Jaffe E, Longo D, Raffeld M. MYC rearrangements in histologically progressed follicular lymphomas. Blood 1992 ; 80 : 758-67.

28 Lossos I, Levy R. Higher-grade transformation of follicle center lymphoma is associated with somatic mutation of the 5’ noncoding regulatory region of the BCL-6 gene. Blood 2000 ; 96 : 635-9.

29 Elenitoba-Johnson K, Jenson S, Abbott R, et al. Involvement of multiple signaling pathways in follicular lymphoma transformation: p38-mitogen-activated protein kinase as a target for therapy. Proc Natl Acad Sci USA 2003 ; 100 : 7259-64.

30 Lossos I, Alizadeh A, Diehn M, et al. Transformation of follicular lymphoma to diffuse large-cell lymphoma: alternative patterns with increased or decreased expression of c-myc and its regulated genes. Proc Natl Acad Sci USA 2002 ; 99 : 8886-91.

31 Bohen S, Troyanskaya O, Alter O, et al. Variation in gene expression patterns in follicular lymphoma and the response to rituximab. Proc Natl Acad Sci USA 2003 ; 100 : 1926-30.

32 Cartron G, Dacheux L, Salles G, et al. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood 2002 ; 99 : 754-8.

33 Dave S, Wright G, Tan B, et al. Prediction of survival in follicular lymphoma based on molecular features of tumor-infiltrating immune cells. N Engl J Med 2004 ; 351 : 2159-69.

34 Banks P, Chan J, Cleary M, et al. Mantle cell lymphoma. A proposal for unification of morphologic, immunologic, and molecular data. Am J Surg Pathol 1992 ; 16 : 637-40.

35 Raffeld M, Jaffe E. bcl-1, t(11 ;14), and mantle cell-derived lymphomas. Blood 1991 ; 78 : 259-63.

36 Rosenwald A, Wright G, Wiestner A, et al. The proliferation gene expression signature is a quantitative integrator of oncogenic events that predicts survival in mantle cell lymphoma. Cancer Cell 2003 ; 3 : 185-97.

37 Shaffer AL, Rosenwald A, Staudt LM. Lymphoïd malignancies: the dark side of B-cell differentiation. Nat Rev Immunol 2002 ; 2 : 920-32.