ARTICLE
Auteur(s) :, Katharina F Kubatzky1,2,3,*,
Virginie Moucadel1,2, Stefan N
Constantinescu1,2
1Ludwig Institute for Cancer Research, Bruxelles
1200, Belgique
2Chrisitan de Duve Institute of Cellular Pathology, MEXP
Unit, Université de Louvain, Bruxelles 1200, Belgique
3Institut für Experimentelle und Klinische,
Pharmakologie und Toxikologie, Albert Strasse 25, D-79104
Freiburg
Depuis quelques années, de l’Epo recombinante humaine est
commercialisée pour le traitement de l’anémie chez des patients en
insuffisance rénale chronique, ou ayant subi une chimiothérapie. De
nombreuses autres applications sont à l’étude, mais les effets
secondaires de l’Epo comme l’augmentation de la pression artérielle
et les complications thrombotiques ne sont pas négligeables.
L’étude du mode d’activation et de fonctionnement du récepteur de
l’Epo se révèle donc importante à la fois pour une meilleure
compréhension de certaines maladies comme la polycythémie primaire
familiale et congénitale mais également pour le développement
ultérieur de nouvelles molécules plus spécifiques et plus
efficaces.
Ligands d’EpoR
Epo, le ligand naturel d’EpoR, se fixe à son récepteur via deux
sites, l’un de haute affinité (ordre du nanomolaire) et l’autre de
faible affinité (ordre du micromolaire), et impose une
configuration dimérique unique à son récepteur [3]. Exception faite
de l’Epo, l’activation d’EpoR peut également être induite par des
peptides synthétiques mimétiques de l’Epo (EMP), par des anticorps
monoclonaux bivalents dirigés contre EpoR, par la mutation d’un
résidu arginine du domaine extracellulaire d’EpoR en cystéine
(R129C) ou par la protéine d’enveloppe gp55 du virus SFFV (spleen
focus forming virus). Les interactions transmembranaires avec la
protéine gp55 du SFFV activent le récepteur et permettent la
formation d’érythrocytes à partir des progéniteurs érythroïdes,
mais favorisent également l’apparition d’érythroleucémie chez la
souris ( (figure 2) ). La
formation d’un pont disulfure entre deux EpoR résultant de la
mutation R129C dans le domaine extracellulaire induit une
activation constitutive du récepteur ( (figure 2) ). Cette
activation constitutive est également oncogénique chez la souris
puisqu’elle favorise l’apparition de leucémies d’origines multiples
[4].
Caractéristiques structurales des récepteurs de cytokines et
d’EpoR
EpoR appartient à la famille des récepteurs de cytokines
hématopoïétiques de classe I, qui jouent un rôle important
dans un grand nombre de mécanismes physiologiques, comme la
différenciation et la prolifération des cellules souches
hématopoïétiques ou bien la modulation de la survie des cellules
nerveuses. Les récepteurs de cytokines de classe I sont des
glycoprotéines transmembranaires qui possèdent dans la partie
extracellulaire du récepteur un domaine conservé, spécifique des
récepteurs hématopoïétiques (CRH), présent en un seul exemplaire
comme c’est le cas pour EpoR, ou en double exemplaire. Ce domaine
CRH contient deux paires de cystéines conservées à son extrémité
N-terminale et peut se diviser en deux sous-domaines fibronectine
de type III, D1 et D2. Le motif conservé Trp-Ser-X-Trp-Ser
(WSXWS) est présent dans le sous-domaine D2 [2]( (figure 1) ). Le motif
WSAWS d’EpoR joue un rôle important dans le repliement de la
protéine, de sorte que dans des cellules en culture, la plupart des
mutations touchant ce motif empêchent l’adoption d’une conformation
correcte du récepteur dans le réticulum endoplasmique, inhibent le
transport de la protéine vers la surface de la cellule, et
interrompent la fixation de l’Epo. Cependant, la substitution de
l’alanine, l’acide aminé central du motif, par un glutamate
augmente le processing de la protéine et l’expression d’EpoR à la
surface de la cellule [2].
Le rôle et les limites de l’hélice alpha transmembranaire
restent à déterminer pour de nombreux récepteurs de cytokines. Des
mutations ponctuelles dans le domaine transmembranaire de certains
récepteurs de cytokines résultent en une activation constitutive
des récepteurs. Parmi ceux-ci figurent les récepteurs de la
thrombopoïétine [5], du granulocyte-colony stimulating factor
(G-CSF) [6] et de la chaîne bêta du récepteur de
l’interleukine 3 [7].
Le domaine intracellulaire des récepteurs de cytokines, dont la
principale caractéristique est son manque d’activité catalytique
intrinsèque, est également moins conservé que le domaine
extracellulaire. Toutefois, trois segments conservés ont pu être
définis dans la région du domaine cytoplasmique proche de la
membrane et ont été nommés boîte 1 (box 1) qui est un motif riche
en prolines (résidus 257-264), boîte 2 (box 2) (résidus 303-313),
et boîte variable (variable box) (entre boîte 1 et
boîte 2) [2]. En mutant un par un tous les résidus de la
région proche de la membrane en alanine, les résidus 259-284 ont pu
être identifiés comme le site de liaison de la kinase associée
JAK2. La liaison de JAK2 est indispensable au processing d’EpoR
dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi et au
transport du récepteur vers la surface cellulaire [8]. De plus, un
motif hydrophobe de conformation rigide, fortement conservé parmi
les récepteurs de cytokines, a pu être caractérisé. Comprenant les
résidus leucine 253, isoleucine 257 et tryptophane 258, il joue un
rôle important dans le positionnement correct de JAK2 de manière à
permettre son activation spécifique lors de la fixation du ligand
[9]. De par l’importance d’EpoR pour la survie de l’organisme, seul
un nombre limité de mutations du récepteur a pu être identifié chez
l’homme. La présence d’un codon stop conduisant à la formation de
récepteurs EpoR tronqués en plusieurs positions C-terminales [10] a
été rapportée chez plusieurs familles de patients souffrant
d’érythrocytose autosomale bénigne, plus connue sous la
dénomination de polyglobulie primaire familiale et congénitale
(PFCP). Ces mutations soulignent le rôle de la tyrosine phosphatase
SH-PTP1 dans l’inhibition de la signalisation d’EpoR, puisque la
délétion de son site de liaison à l’extrémité C-terminale du
récepteur conduit à une activité soutenue d’EpoR et à un nombre
élevé d’érythrocytes.
Modèle d’activation d’EpoR
Jusqu’à il y a peu, le modèle d’activation d’EpoR était celui du
récepteur de l’hormone de croissance. Dans ce modèle, les
sous-unités monomériques du récepteur restent inactives jusqu’à ce
que le facteur de croissance se fixe d’abord à une sous-unité du
récepteur monomérique puis dimérise le récepteur en se fixant à une
seconde sous-unité. Ainsi, la dimérisation initie
l’autophosphorylation des kinases intracellulaires associées au
récepteur responsable de la phosphorylation du récepteur lui-même.
Toutefois, certaines études révélaient des contradictions entre les
résultats obtenus pour le récepteur de l’hormone de croissance et
ceux obtenus pour le récepteur de l’Epo [11]. Par exemple, il était
difficile d’obtenir une inhibition du signal par de fortes doses de
l’Epo, comme cela est possible pour le récepteur de l’hormone de
croissance.
Depuis peu, des informations détaillées sur les structures
cristallines du domaine extracellulaire (EBP) associé ou non avec
l’Epo ou des protéines mimétiques (EMP) agonistes ou antagonistes
sont disponibles, et font apparaître un mécanisme d’activation
alternatif inattendu. Une étude de la structure cristalline du
domaine EBP de l’EpoR humain non lié à Epo [12] et des expériences
de complémentation protéique in vivo concernant l’EpoR murin [13]
ont mis en évidence que des récepteurs EpoR non liés au ligand
existent bel et bien en tant que dimères lorsque le domaine
extracellulaire est isolé. Cela suggère qu’une conformation
prédimérique peut évoluer en une conformation active après liaison
avec l’Epo. Selon ce modèle, à l’état non lié au ligand, la
conformation du récepteur dimérique ressemble à des ciseaux
ouverts, et les extrémités des domaines extracellulaires D2 proches
de la membrane sont séparées par un espacement de 73 Å. Cette
distance, trop importante pour permettre la transphosphorylation de
JAK2, peut se réduire à 39 Å (ou moins pour des récepteurs
transmembranaires) lorsque le récepteur est cocristallisé avec
l’agoniste EMP1, de telle façon que l’activation du récepteur
puisse avoir lieu. Toutefois, ces expériences ont été menées sur
des domaines extracellulaires isolés. Le rôle du domaine
transmembranaire et son influence sur la conformation finale
adoptée par le récepteur restent à déterminer. La pertinence des
données structurales a été vérifiée par une expérience de
complémentation dans laquelle les domaines extracellulaire et
transmembranaire d’EpoR murin ont été fusionnés par des segments
flexibles de différentes longueurs à deux fragments complémentaires
de la DHFR (dihydrofolate réductase) murine afin de pouvoir suivre
le mouvement des domaines cytoplasmiques. En l’absence du ligand,
aucune activité de complémentation de la DHFR n’a pu être détectée.
La stimulation par l’Epo a permis un changement de conformation qui
a eu pour résultat le rapprochement des deux fragments DHFR
complémentaires et la complémentation de l’activité enzymatique
[13]. Ainsi, l’autoassociation des récepteurs de l’Epo pourrait
expliquer l’une des énigmes dans ce domaine, à savoir que l’Epo
peut transmettre un signal très efficace depuis la surface
cellulaire où comparativement peu de récepteurs sont exprimés
(< 1 000).
Un autre aspect intéressant de ces études structurales réside
dans la plasticité de reconnaissance d’EpoR. En effet, EpoR est
capable d’interagir avec une variété de ligands via un seul site de
liaison. Différents ligands conduisent à des orientations
distinctes du domaine extracellulaire qui affectent en conséquence
l’efficacité de l’activation du récepteur de l’Epo.
Plusieurs molécules permettant la dimérisation du récepteur mais
pas son activation (antagonistes) ont été identifiées, démontrant
ainsi que la dimérisation des domaines extracellulaires est
nécessaire mais pas suffisante pour induire un signal, et qu’une
orientation spécifique des sous-unités d’EpoR est requise [14].
Domaine transmembranaire d’EpoR et signalisation
Domaine transmembranaire et activation du signal
Ce modèle de récepteur dimérique préformé à la surface cellulaire
indique que le domaine extracellulaire est la force motrice de la
dimérisation du récepteur, mais des études portant sur
l’interaction entre la protéine virale gp55 et EpoR démontrent
aussi que le domaine transmembranaire d’EpoR a également une
fonction importante dans l’activation du récepteur.
La gp55 est une glycoprotéine membranaire codée par le virus
SFFV (friend spleen focus-forming virus) qui cause des
érythroblastoses après interaction spécifique avec le récepteur
EpoR murin. Les récepteurs EpoR de la souris et de l’homme
comportent 507 et 508 acides aminés respectivement et leurs
séquences sont identiques à 82 %. Néanmoins, l’EpoR humain
s’avère résistant à l’activation médiée par la protéine gp55 [15].
La gp55 se présente principalement sous forme d’un monomère dans le
réticulum endoplasmique granuleux, mais un faible pourcentage
(5 %) forme des dimères reliés par ponts disulfures qui
subissent des transformations plus poussées dans l’appareil de
Golgi et sont transportés vers la surface cellulaire [16]. Cette
forme dimérique de surface est requise pour l’oncogénicité, et sa
forte proximité avec EpoR a d’abord été démontrée par le pontage
chimique de la protéine gp55 avec de l’EpoR marquée à l’iode I
125[17]. Ruscetti et al. ont localisé la zone
d’interaction entre EpoR et la glycoprotéine gp55 à la portion
transmembranaire des molécules, et ont montré que ces contacts
étaient essentiels pour activer le récepteur en absence d’Epo
[18].
Deux souches virales SFFV, nommées SFFV-A et SFFV-P, ont été
identifiées et produisent deux types de gp55, gp55-A et gp55-P
respectivement. Les protéines gp55 des deux souches sont capables
de conduire au développement d’une érythroleucémie. Mais, alors que
gp55-P déclenche une prolifération du nombre de globules rouges
(polycythémie) qui rappelle la maladie humaine Polycythemia vera,
gp55-A induit une anémie due à l’hémodilution. In vitro, la
coexpression simultanée d’EpoR et de gp55-P dans une lignée de
cellules lymphoïdes murines proB appelées Ba/F3 qui n’exprime pas
EpoR de manière endogène provoque une prolifération cellulaire
autonome. La coexpression de gp55-A et EpoR exige toujours quant à
elle de l’Epo pour une prolifération maximale. Chez la souris, les
deux protéines virales induisent la formation de progéniteurs CFU-E
(erythroid differentiation of colony-forming unit-erythroid) à
partir de cellules de foie fœtal, mais seule gp55-P est capable
d’induire la différenciation de progéniteurs et la formation de
colonies à partir des cellules BFU-E (burst-forming unit-erythroid)
[19]. La comparaison des domaines transmembranaires de gp55-A et
gp55-P révèle plusieurs différences, parmi lesquelles le
remplacement de la méthionine 390 de gp55-P par une isoleucine à la
position correspondante pour gp55-A, ainsi que l’insertion de deux
résidus additionnels de leucine aux positions 396 et 397 dans la
séquence de gp55-P [20]. Fang et al. ont démontré par
co-immunoprécipitation que la délétion du double motif de leucine
de gp55-P interfère avec la liaison d’EpoR en diminuant l’affinité
de gp55-P pour le récepteur. Cette diminution de l’affinité a pour
conséquence l’incapacité à promouvoir la prolifération cellulaire
indépendamment de l’addition d’Epo. D’autre part, la substitution
de la méthionine 390 par une isoleucine n’a aucun effet sur la
liaison avec le récepteur, mais réduit de façon significative la
réponse mitogénique d’EpoR. Bien que le domaine transmembranaire
d’EpoR humain ne diffère de son équivalent murin que par
3 acides aminés sur 21, gp55 est capable de se fixer mais pas
d’activer l’EpoR humain et d’induire une prolifération cellulaire
indépendamment de l’ajout d’Epo [15]. La mutation de la leucine 239
de l’EpoR humain, en une sérine, acide aminé présent dans la
protéine murine à la position correspondante (238), permet à gp55
d’induire une croissance cellulaire indépendante de l’Epo. A
contrario, le remplacement de la sérine 238 du récepteur murin par
une leucine supprime l’indépendance des cellules vis-à-vis de
l’Epo. Cela démontre que la sérine 238 est essentielle à une
interaction fonctionnelle de gp55-P avec EpoR. De plus, des
simulations moléculaires dynamiques ont été réalisées et suggèrent
fortement que la serine 238 est la cible de la méthionine 390 de
gp55-P dans le but de former une structure de type
« superhélice » ou « coiled-coil » orientée à
gauche et stabilisée par des interactions tout au long de
l’interface du dimère [21].
Pour pouvoir visualiser directement le complexe EpoR-gp55 à la
surface cellulaire, nous avons réalisé une expérience de
copatching. De manière inattendue, l’utilisation de deux versions
différemment marquées de gp55-A ou de gp55-P a montré que les deux
protéines virales avaient tendance à former des homo-oligomères à
la surface cellulaire. L’analyse de l’association des hélices alpha
des domaines transmembranaires isolés de gp55-A et de gp55-P par
TOXCAT a révélé que seuls les domaines transmembranaires de gp55-P
avaient la capacité de s’associer en homodimères. Néanmoins, les
deux protéines gp55-P et gp55-A sont capables de former des
complexes avec EpoR à la surface cellulaire et cette interaction
est spécifique dans la mesure où elle se produit uniquement en
présence d’EpoR et pas des récepteurs pour la thrombopoïétine ou
pour la prolactine (( figure 4 )). Les deux
phénotypes observés pour gp55-A et P pourraient donc être liés à
leur différente capacité de s’homodimériser via le domaine
transmembranaire [22].
Afin d’étudier les rôles potentiels des domaines
extracellulaire, transmembranaire et cytoplasmique d’EpoR dans
cette interaction, nous avons utilisé une série de récepteurs
chimériques, composés de domaines appartenant au récepteur de l’Epo
et au récepteur de la prolactine. Lors d’études de copatching et de
co-immunoprécipitation, nous avons pu montrer que seul le domaine
transmembranaire d’EpoR est nécessaire à la formation de complexes
hétéromériques avec les deux protéines gp55 et que la partie
extracellulaire du récepteur ne suffit pas à la formation d’un
complexe ( (figure 3) ).
Domaine transmembranaire et dimérisation
Récemment, nous avons montré que le domaine transmembranaire d’EpoR
ne joue pas seulement un rôle crucial dans l’activation du
récepteur médiée par gp55, mais aussi dans l’oligomérisation du
récepteur indépendamment du ligand.
Dans des expériences de copatching, en utilisant des récepteurs
de l’Epo contenant des épitopes de reconnaissance différents et des
anticorps fluorescents spécifiques, nous avons pu montrer qu’une
majeure partie des EpoR existe en tant que dimères préformés à la
surface de la cellule, ainsi que cela avait été avancé à la fois
par les équipes de Livnah et de Remy [12, 13]. Ces complexes
préformés d’EpoR ne manifestent pas d’activation constitutive et
requièrent de l’Epo pour leur activation. De façon plus
intéressante, il a été montré que le domaine transmembranaire
d’EpoR possède une capacité d’association et que la substitution du
domaine transmembranaire du récepteur de la prolactine par celui
d’EpoR permet un copatching efficace de ce récepteur chimérique
avec EpoR ( (figure 4) ). Bien que
l’on ait cru, en se basant sur certaines données
cristallographiques, que les domaines extracellulaires d’EpoR
seraient suffisants à la dimérisation [12], il apparaît qu’un
récepteur chimérique Prl-Epo qui ne contient que le domaine
extracellulaire du récepteur EpoR ne forme pas de dimères
autoassociés à la surface cellulaire [23]. L’aptitude des domaines
transmembranaires d’EpoR murin à induire une activation de la
transcription suite à leur dimérisation a été mesurée dans une
expérience de ToxR. Il a été montré que les domaines
transmembranaires d’EpoR murin sont capables de s’autoassocier très
efficacement. En revanche, le domaine transmembranaire équivalent
du récepteur de l’hormone de croissance ne manifeste aucune
homodimérisation significative, indiquant que l’aptitude à
dimériser n’est pas une caractéristique commune à l’ensemble des
récepteurs de cytokines, mais bien spécifique à EpoR [24].
L’introduction d’une double mutation à l’intérieur du domaine
transmembranaire d’EpoR qui remplace deux leucines consécutives par
une glycine et une proline (Leu 240 Gly ; Leu 241
Pro) supprime complètement l’autoassociation du domaine
transmembranaire d’EpoR dans une expérience ToxR, prouvant qu’une
hélice alpha transmembranaire intacte est indispensable à la
dimérisation. En effet, l’insertion de résidus glycine et proline à
l’intérieur d’une hélice alpha introduit une anomalie dans la
structure de l’hélice, laquelle semble affecter négativement les
interactions hélice-hélice de l’interface dimérique. L’introduction
de cette double mutation dans le récepteur sauvage et l’expression
de la protéine dans la lignée hématopoïétique Ba/F3 se soldent par
une efficacité amoindrie de la signalisation induite par EpoR et
par une diminution de la prolifération cellulaire. La réinsertion
de ce récepteur mutant dans des progéniteurs érythroïdes de souris
EpoR–/– induit la formation d’un nombre restreint de colonies
érythroïdes, comparé au récepteur sauvage. Il est intéressant de
noter que l’inhibition de l’auto-association des domaines
transmembranaires du mutant EpoR constitutivement actif R129C
supprime la formation de ponts disulfures intermoléculaires entre
les sous-unités du récepteur. Le résultat biologique de
l’expression de ce récepteur mutant R129C est la perte de la
signalisation indépendante du ligand. Ces résultats indiquent que
non seulement le domaine transmembranaire du récepteur de l’Epo
joue bien un rôle dans l’auto-association du récepteur indépendante
du ligand, mais que la liaison de R129C au niveau de la membrane
est facilitée par l’autoassemblage du domaine transmembranaire
d’EpoR. Il est tentant de penser que les domaines transmembranaires
d’EpoR servent d’interface de dimérisation pour le récepteur
sauvage et qu’une transduction efficace du signal est déterminée
par la dynamique de l’autoassemblage du domaine transmembranaire.
Gurezka et al. ont émis l’idée que l’interface du dimère de
certaines protéines de membrane cristallisées était équivalente aux
domaines d’interaction des leucine-zipper solubles, dans lesquelles
les leucines importantes sont espacées tous les 7 résidus (motif
heptamérique) [25]. La leucine est l’acide aminé le plus courant à
l’intérieur de l’interface des leucine-zipper, probablement à cause
de son aptitude à adopter de multiples conformations.
En définitive, un modèle a été proposé dans lequel il existe un
équilibre conformationnel en l’absence du ligand, entre 1) une
configuration dans laquelle les domaines transmembranaires sont
positionnés l’un par rapport à l’autre à une distance incompatible
avec la transduction du signal à cause de la préassociation des
domaines extracellulaires, et 2) une configuration dans laquelle
les domaines transmembranaires sont juxtapositionnés. Cette
dernière serait transitoire jusqu’à ce que la liaison de l’hormone
stabilise la conformation et rende possible une transmission du
signal efficace [24].
Interfaces active et inactive du domaine transmembranaire
Suite à ces découvertes, il est apparu clairement que la structure
et la fonction des domaines transmembranaires d’EpoR jouaient un
rôle crucial dans l’activation d’EpoR et qu’elles devaient donc
faire l’objet d’investigations plus poussées. Comme il n’existait
pas de données structurales directes sur les régions
transmembranaire et cytosolique d’EpoR, des approches alternatives
ont été choisies pour caractériser le domaine transmembranaire et
pour déterminer quels résidus stabilisaient les conformations
active ou inactive du dimère récepteur.
Tout d’abord, les conformations actives et inactives du
récepteur ont été déterminées. L’utilisation d’une séquence
d’acides aminés induisant la formation d’une superhélice
« coiled-coil » peut s’avérer intéressante pour
identifier l’orientation active d’une hélice. En effet, ce type de
séquence possède une série d’acides aminés hydrophobes (leucines),
répartis selon une distribution caractéristique et qui confèrent à
l’hélice alpha qu’ils forment la capacité de dimériser en une
structure très stable appelée « superhélice » ou
« coiled-coil ». Lorsqu’une telle séquence est fusionnée
à une hélice alpha quelconque, la structure en
« superhélice » est imposée à cette hélice alpha et
l’oblige à dimériser. Le domaine « coiled-coil » d’hélice
gauche de l’activateur de transcription Put3 de levure a donc été
fusionné aux domaines transmembranaire et cytoplasmique d’EpoR.
Pour étudier les sept interfaces dimériques mécaniquement possibles
par rotation, de 0 à 6 acides aminés de la séquence du domaine
transmembranaire ont été éliminés, à la jonction entre le domaine
« coiled-coil » extracellulaire et le domaine
transmembranaire [26]. Sur les sept constructions obtenues, une
seule conformation dimérique, qui est présente dans deux
constructions, est capable d’induire une signalisation puissante et
complète d’EpoR après expression dans les cellules Ba/F3. Cette
conformation correspond à l’interface active du dimère. Une
protéine de fusion orientée différemment montre une activation
forte des MAP kinases, mais pas d’activation de la voie JAK-STAT.
Ces résultats suggèrent que des voies de signalisation distinctes
peuvent être activées préférentiellement en fonction de
l’orientation du récepteur. Une autre protéine de fusion dont
l’interface est radicalement différente comparée à la conformation
active est rendue active par coexpression de gp55-P. En fait,
l’interface de cette conformation est supposée contenir un résidu
sérine 238, résidu important pour l’interaction avec la
méthionine 390 de la protéine gp55-P pour la formation d’un
complexe hétérodimérique [21]. On peut donc présumer que cette
protéine de fusion correspond à l’interface dimérique inactive du
récepteur. En conclusion, nos résultats suggèrent que l’activité
d’EpoR est déterminée par la périodicité hélicoïdale d’une hélice
alpha orientée à gauche et par l’orientation des domaines
transmembranaire et cytosolique. De plus, il semblerait que
différentes orientations de l’hélice soient capables d’influencer
l’activité des voies de signalisation. Comme EpoR est exprimé non
seulement dans les cellules hématopoïétiques, mais également dans
les cellules endothéliales et nerveuses, il est possible que des
différences de spécificité cellulaire dans l’orientation des
dimères EpoR à la surface cellulaire expliquent les différences de
signalisation observées [26].
Domaine transmembranaire et maintien du récepteur à l’état
inactif
Récemment nous avons acquis davantage de compréhension de la
structure du domaine transmembranaire d’EpoR [27]. La mutation
systématique de tous les acides aminés du domaine transmembranaire
en cystéine et le pontage des cystéines avec un agent spécifique
des groupes sulhydryl, ainsi que des expériences de simulations
dynamiques au niveau moléculaire et de NMR nous ont permis de
montrer qu’à l’inverse de la plupart des prédictions de structure
secondaire, les résidus depuis la leucine 226 jusqu’à la leucine
230 ne font pas partie d’une hélice alpha mais qu’ils adoptent une
conformation helix cap N-terminale. En effet, bien qu’il soit admis
que le domaine transmembranaire d’EpoR de souris s’étende du résidu
leucine 226 au résidu leucine 247, la longueur et
l’hydrophobicité de la séquence à partir de la leucine 230
jusqu’à l’arginine 250 sont compatibles avec les conditions
requises pour une hélice alpha transmembranaire. De plus, il a été
montré que la conformation alpha-hélicoïdale de la séquence
juxtamembranaire cytosolique contenait un motif hydrophobe rigide,
requis pour l’activation de JAK2 [9]. Le remplacement du motif
helix cap par un segment d’oligo-leucines conduit à une survie
cellulaire de cellules Ba/F3 indépendamment de l’ajout du ligand,
ce qui suggère que le motif est impliqué dans le maintien du
récepteur à l’état inactif en l’absence du ligand [27]. Ces
résultats mettent en avant l’intérêt majeur du segment
extracellulaire juxtamembranaire de 10 acides aminés pour la mise
au point de molécules capables de moduler la fonction du récepteur.
Implications de ces recherches pour la médecine
En conclusion, ces études suggèrent que des détails structuraux de
l’interface dimérique déterminent les orientations relatives des
sous-unités du récepteur et qu’à l’intérieur d’une famille de
protéines comme les récepteurs de cytokines, il pourrait y avoir
beaucoup de modes d’activation différents.
Les régions critiques d’EpoR dont les résultats structuraux et
fonctionnels les font apparaître comme des cibles moléculaires
potentielles sont indiquées dans la ( figure 5 ). Ces
régions sont constituées de la jonction entre les domaines
extracellulaire et transmembranaire, des résidus qui composent
l’interface active entre les monomères et des résidus hydrophobes
clefs du domaine cytosolique juxtamembranaire.
Une meilleure compréhension des interactions entre domaines
transmembranaires est essentielle dans la mesure où elle nous
permettra dans l’avenir de développer des agents (molécules
chimiques, anticorps monoclonaux…) qui pourront activer ou
inactiver la signalisation complète du récepteur de manière très
spécifique ou bien seulement certaines voies de signalisation
activées par le récepteur. Ainsi il serait par exemple possible de
dissocier les fonctions de prolifération des fonctions de
différenciation, ou encore de cibler préférentiellement certains
types de cellules. Pour les patients dont l’administration d’Epo
conduit à la synthèse d’anticorps dirigés contre l’Epo, des
molécules mimant l’effet de l’Epo pourraient être proposées en
association avec une thérapie immunosuppressive.
Chez l’homme, l’administration d’Epo par voie systémique permet
également une neuroprotection lors d’une ischémie cérébrale. Le
récepteur de l’Epo responsable de cet effet aurait des propriétés
quelque peu différentes de celui impliqué dans l’érythropoïèse. La
compréhension des différences entre ces deux récepteurs pourrait
donc amener à la synthèse d’analogues de l’Epo pouvant exercer une
protection des neurones sans pour autant exposer l’individu aux
risques liés à une augmentation importante de l’hématocrite.
Ainsi, il apparaît clairement que de telles recherches, aussi
fondamentales qu’elles soient, devraient intéresser la médecine
clinique tant au niveau de la compréhension moléculaire des
mécanismes qu’elles apportent qu’au niveau des perspectives
d’avenir qu’elles offrent en termes de traitements.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier particulièrement
J.-B. Demoulin et S. Hoppe pour la traduction de cet article
en français et l’Institut Christian de Duve pour le soutien
financier de K.-F. Kubatzky par la bourse « Delori »
ainsi que le programme Marie Curie pour le soutien financier de
V. Moucadel.
Références
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