Auteur(s) : Dominique Labie
Institut Cochin, GDPM, 24, rue du Faubourg Saint-Jacques,
75014 Paris, France
L’hématopoïèse cyclique humaine est une maladie autosomique
dominante, caractérisée par une oscillation périodique d’environ
21 jours de production des cellules sanguines. Les
neutrophiles, en particulier, oscillent entre zéro et des valeurs
presque normales, permettant entre temps le développement
d’infections opportunistes. Le criblage du génome, et un clonage
positionnel, ont permis en 1999 à une équipe de l’Université de
Washington, Seattle, États-Unis, de localiser le gène responsable
en 19p13.3 et de mettre en évidence chez des malades sept
substitutions du gène ELA2, codant pour une sérine protéase
de 240 aa. normalement présente dans les granules des
neutrophiles et des monocytes [1]. Cette observation a été
corroborée dans une autre étude, évoquant le rôle de la même
élastase dans les neutropénies congénitales sévères (SCN), les
mutations semblant cependant différentes dans les deux syndromes
[2]. Il s’agît, dans la majorité des cas, de mutations de
novo, l’enzyme mutée interférant avec le trafic normal
[3].
Un phénotype comparable, autosomique récessif, d’hématopoïèse
cyclique a été observé chez le chien, mais aucune mutation du gène
homologue ELA2 n’a été retrouvée [4]. Chez le chien la
maladie s’accompagne de plaques d’hypopigmentation qui évoquent le
syndrome d’Hermansky-Pudlak chez l’homme. Les études moléculaires,
dans ces derniers cas, avaient mis en évidence des mutations de la
sous-unité β3a du complexe adaptateur AP-3 [5]. Ce complexe est un
hétérotétramère (deux dimères α3/δ et µ3/β3) associé au
trans-Golgi, et qui serait impliqué dans le transport des
protéines cargo vers les lysosomes [6, 7]. Des mutations de la
sous-unité Ap3b1 ont aussi été mises en évidence dans le modèle
murin de la maladie d’Hermansky-Pudlak, entraînant une dégradation
globale de AP-3 [8]. Une autre étude, comparant chez la souris les
mutants naturels et ceux obtenus par invalidation génique, a
démontré que le gène Ap3b1 est bien à l’origine du
phénotype, par suite d’un défaut de transport des protéines
membranaires [9].
L’ensemble de ces données a amené les auteurs du dernier article
[4] à explorer le gène AP3B1 au cours de l’hématopoïèse
cyclique du chien. Ils ont ainsi mis en évidence l’insertion d’une
adénine dans une séquence 9A de l’exon 20, traduite par un décalage
de phase de lecture et une terminaison prématurée de la traduction.
Au niveau protéique, on ne retrouvait ni la sous-unité β3a mutée,
ni la sous-unité µ3a dégradée.
Des mutations dans des gènes différents entraînant un phénotype
similaire évoquent évidemment que les produits de ces gènes
interagissent fonctionnellement, et c’est ce qui a été recherché.
L’hypothèse était que AP-3 reconnaisse l’élastase neutrophile comme
une protéine cargo et assure son transport vers les granules. Le
mode d’interaction a été exploré en technique de double
hybride : avec d’une part les sous-unités β3a ou µ3a de AP-3,
d’autre part la moitié distale de l’élastase neutrophile, ou un
variant. L’élastase neutrophile comporte, en effet, une extension
C-terminale de 20 résidus, clivable par protéolyse, de
fonction jusqu’alors inconnue. L’expérience a été fait avec ou sans
cette extension. On a constaté que la protéine clivée interagît
avec µ3a, mais pas avec β3a, la protéine non clivée n’interagissant
avec aucune des deux sous-unités. L’interaction se présentait comme
inhibée par la présence de l’extension C-terminale. L’examen de la
séquence protéique, par ailleurs, ne montre qu’une seule tyrosine
en position 199 (séquence LYPDA). Cette tyrosine devait être le
signal de sortie et d’interaction avec µ3a. L’exploration par
algorithmes de la séquence de l’élastase a montré l’existence d’un
domaine transmembranaire juste avant ce signal Y. Les mutations les
plus fréquentes s’alignent dans ce domaine (figure
1). En délétant ce signal Y, sont-elles susceptibles de
modifier le trafic subcellulaire ?
Plusieurs abords ont été utilisés pour vérifier cette hypothèse.
Elles ont utilisé, par comparaison avec l’élastase neutrophile
normale, deux constructions de mutants : La mutation 205ΔC
correspond à une délétion de l’extension C-terminale et retient le
signal de sortie, la mutation Y199X abolit ce signal. Les
différentes protéines ont été localisées par immunofluorescence
dans des cellules basophiles de rat dénuées d’élastase endogène. La
forme sauvage se localise majoritairement dans les granules, un peu
dans la zone périnucléaire, la localisation granulaire s’accentue
chez le mutant 205ΔC, alors que l’élastase n’est retrouvée qu’au
niveau de la membrane plasmique et de l’enveloppe nucléaire quand
il y a suppression du signal chez Y199X. Un autre contrôle a
utilisé les mêmes constructions explorées par Western blot
avec des résultats comparables. La question se posait de savoir
comment peut s’opérer cette interaction. L’élastase est une
protéine soluble qu’on trouve dans les granules, alors que AP-3
revêt la surface cytoplasmique des vésicules. Les deux protéines
sont situées sur les surfaces opposées d’une membrane.
L’interaction requiert donc que l’élastase traverse la membrane.
Les expériences ont comparé l’élastase sauvage normale à deux
mutants naturels, dont l’un était une délétion partielle du domaine
transmembranaire (ΔV161-F170), l’autre un variant R191Q qui
augmentait l’hydrophobicité de la protéine. Elles ont comporté
d’une part des ultracentrifugation de lysats cellulaires séparant
la fraction soluble et la fraction membranaire, d’autre part le
traitement des neutrophiles par un certain nombre d’agressions,
perméabilisation par congélation/décongélation, protéolyse par la
protéinase K, traitement par le triton, éventuellement suivie de la
localisation des différentes protéines par des anticorps
spécifiques.
Les auteurs proposent une explication de l’ensemble des résultats
obtenus. L’élastase neutrophile existe normalement sous deux
isoformes de 34 et 31 kDa, avec ou sans l’extension
C-terminale. L’ultracentrifugation sépare la fraction de
31 kDa soluble granulaire de la fraction de 34 kDa
insoluble et membranaire. La maturation normale implique que la
forme qui a retenu le C-terminal traverse les membranes du
trans-Golgi vers le cytosol. Après clivage du C-terminal, la
protéine, associée à la membrane, fixe AP-3. La protéine clivée est
alors libérée dans le lumen et transportée vers les granules, la
perte du signal ou l’absence de clivage empêchant de fait
l’interaction. La localisation vers les membranes est due à un
routage erroné. Dans l’hématopoïèse cyclique du chien, il y a
déficit en AP-3, alors que dans la plupart des cas de neutropénie
congénitale sévère il y a délétion du signal, mais l’erreur de
routage est la même. Dans l’hématopoïèse cyclique humaine, en
revanche, les mutations entraînent le plus souvent une interruption
du domaine transmembranaire et la protéine soluble se localise dans
les granules.
Références
1. Horwitz M, Benson KF, Person RE, Aprikyan AG,
Dale DC. Mutations in ELA2, encoding neutrophil elastase,
define a 21-day biological clock in cyclic haematopoiesis.
Nature Genet 1999 ; 23 : 433-6.
2. Dale DC, Person RE, Bolyard AA, Aprikyan AG, Bos
C, Bonilla MA, Boxer LA, Kannourakis G, Zeidler C, Welte K, Benson
KF, Horwitz M. Mutations in the gene encoding neutrophil elastase
in congenital and cyclic neutropenia. Blood 2000 ;
96 : 2317-22.
3. Li FQ, Horwitz M. Characterization of mutant
neutrophil elastase in severe congenital neutropenia. J Biol
Chem 2001 ; 276 : 14230-41.
4. Benson KF, Li FQ, Person RE, Albani D, Duan Z,
Wechsler J, Meade-White K, Williams K, Acland GM, Niemeyer G,
Lothrop CD, Horwitz M. Mutations associated with neutropenia in
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5. Dell’Angelica EC, Shotelersuk V, Aguilar RC, Gahl
WA,Bonifacino JS. Alterd trfficking of lysosomal proteins in
Hermansky-Pudlak syndrome due to mutations in the β3a subunit of
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6. Simpson F, Peden AA, Christopoulou L, Robinson
MS. Characterization of the adaptor-related protein complex, AP-3.
J Cell Biol 1997 ; 137 : 835-45.
7. Robinson MS, Bonifacino JS. Adaptor-related
proteins. Curr Op Cell Biol 2001 ; 13 :
444-53.
8. Feng L, Seymour AB, Jiang S, To A, Peden AA,
Novak EK, Zhen L, Rusiniak ME, Eicher EM, Robinson MS, Gorin MB,
Swank RT. The β3A subunit gene (Ap3b1) of the AP-3 adaptor
complex is altered in the mouse hypopigmentation mutant pearl, a
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Genet 1999 ; 8 : 323-30.
9. Yang W, Li C, Ward DM, Kaplan J, Mansour
SL ; Defective organellar membrane protein trafficking in
Ap3b1- deficient cells. J Cell Sci 2000 ;
113 : 4077-86.
Figure 1. Représentation schématique de l’élastase
neutrophile. En N-terminal les séquences pré- et proélastse. En
C-terminal l’extension de 20 aa qui sera clivée par
protéolyse. Les mutations ponctuelles sont réparties sur l’ensemble
de la séquence (cf. réf. 4), elles ne sont pas figurées ici. Deux
catégories de mutations sont représentées spécifiquement.
1) La délétion ΔV161-F170 est retrouvée de façon
itérative, entraînant presque toujours une neutropénie cyclique.
Elle représente une interruption partielle du domaine
transmembranaire, le signal Y199 est respecté. Le routage de
l’élastase, soluble, se fait vers les granules. 2) Une
série de mutations, à partir du résidu 192 et au-delà, entraîne,
par décalage de phase de lecture, une terminaison prématurée de la
traduction avec suppression du signal et délétion de toute
l’extrémité C-terminale. Ces mutations sont à l’origine d’une
neutropénie congénitale sévère et d’un routage erroné de l’élastase
vers les membranes.bn
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