Clinical and molecular basis of the X‐linked α‐thalassemia and mental retardation syndrome (ATR‐X)

ARTICLE

Auteur(s) : Carlos Cardoso¹, Catherine Badens², Marie-Geneviève Mattei¹, Michel Fontés¹

¹ Unité Inserm 491, faculté de médecine la Timone, 27, bd Jean-Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France. 
² Laboratoire de génétique moléculaire, département de génétique médicale, hôpital d'enfants de la Timone, 13385 Marseille cedex 5, France.

Signes cliniques du syndrome ATR-X

Le tableau clinique du syndrome ATR-X (tableau 1) est dominé par un retard mental sévère et une dysmorphie faciale caractéristique (figure 1), alors que les anomalies hématologiques sont mineures. Les antécédents anté et périnatals sont sans particularité, le poids et la taille sont normaux à la naissance. En période néonatale, les enfants atteints de syndrome ATR-X présentent une hypotonie sévère et des troubles associés de l'alimentation. Pendant la petite enfance, toutes les acquisitions sont retardées : la marche ne survient que tardivement voire jamais, le langage se limite à quelques mots et les patients restent dépendants toute leur vie. Environ 30 % d'entre eux présentent une épilepsie tonico-clonique ou myoclonique. En règle générale, il n'y a pas d'anomalie cérébrale à l'imagerie en résonance magnétique mais des cas d'atrophie cérébrale discrète ont été rapportés. Bien qu'aucun phénotype comportemental particulier n'ait été décrit, les enfants sont, en général, affectueux et gais [8].

La dysmorphie est très discrète chez le nourrisson ; elle s'affirme avec l'âge et est, en général, bien établie dès l'enfance. On note un épicanthus, un télécanthus, une hypoplasie de l'étage moyen de la face, un petit nez et des narines antéversées ; la lèvre supérieure est incurvée en chapeau de gendarme. Les incisives sont fréquemment espacées et en avant, la langue est hypotone (figure 1).
Des malformations génitales de sévérité variable sont présentes dans 80 % des cas : cryptorchidie, anomalies du prépuce, mais aussi hypospadias, micropénis, voire ambiguïté sexuelle pouvant conduire à des erreurs de diagnostic de sexe. La puberté est fréquemment retardée.
Les anomalies hématologiques décrites dans certains cas d'ATR-X sont mineures, évoquant les particularités notées chez les patients atteints d'α-thalassémie : microcytose discrète associée à une pseudopolyglobulie. Elles sont l'expression d'un léger déséquilibre dans le taux de synthèse des deux chaînes de globine alors que, chez le sujet normal, ces deux chaînes, codées par des gènes localisés sur des chromosomes différents, sont synthétisées à des taux identiques. Bien que cette caractéristique soit l'un des éléments de base dans la définition initiale du syndrome, elle est très inconstante et, par conséquent, son absence ne doit pas faire exclure le diagnostic de syndrome ATR-X [8].
Les anomalies osseuses sont également fréquentes et variables : les anomalies des doigts et des orteils sont communes (clinodactylie, brachydactylie, extrémités en baguette de tambour, syndactylie) de même que celles du rachis (scoliose et cyphose). Un retard statural est présent dans 60 % des cas.
D'autres signes cliniques sont notés de manière moins constante : hypoglycémie, troubles de la régulation thermique. Une forte sialorrhée, des éructations et des vomissements fréquents sont rapportés, causés par un dysfonctionnement intestinal général. Enfin, des anomalies cardiaques variables et non spécifiques sont rapportées : malformations septales, canal artériel persistant, sténose pulmonaire.

Gène XNP et protéine XNP/ATR-X

Le gène XNP s'étend sur 350 kb d'ADN génomique et conduit à un transcrit de 10,5 kb exprimé de manière ubiquitaire mais majoritairement dans le cerveau et le muscle [5]. Le même profil d'expression est observé pour l'homologue murin : des expériences d'hybridation in situ réalisées sur des coupes de cerveau de souriceaux nouveau-nés montrent une expression majoritaire dans les structures du système nerveux central en cours de différenciation comme le bulbe olfactif, l'hippocampe ou le cervelet [9]. Le gène XNP est constitué de 35 exons, les exons 1, 2 et 6 étant soumis à un épissage alternatif [10, 11]. Le transcrit XNP code pour une protéine putative de 2 492 acides aminés contenant, dans sa partie N-terminale, trois motifs correspondant à des « doigts de zinc » de type C2-C2 (acides aminés 131 à 338) et un domaine dit coiled-coil (acides aminés 321 à 475). La présence, dans la région C-terminale, des sept motifs caractéristiques des ADN-hélicases de type SNF2 fait de la protéine XNP/ATR-X (figure 2) un nouveau membre d'un groupe de la famille des hélicases : les « hélicases à doigt de zinc » [11, 12]. Ce groupe est essentiellement constitué de protéines impliquées dans les processus de remodelage de la chromatine comme la protéine MI-2 [13].
La production d'anticorps monoclonaux reconnaissant de manière spécifique la protéine XNP/ATR-X a permis d'analyser la distribution de cette protéine dans des lymphocytes et des fibroblastes humains, par immunocytochimie. Les résultats obtenus démontrent que cette protéine est nucléaire et qu'elle est concentrée au sein de structures spécialisées (figure 3), vraisemblablement associées à l'hétérochromatine péricentromérique [14]. Cette association est confirmée, au cours de la mitose, par une localisation de la protéine XNP/ATR-X au niveau des centromères des différents chromosomes et sur les bras courts des chromosomes acrocentriques, connus pour être hétérochromatiques [14]. Cette distribution nucléaire peut être modifiée selon l'état de phosphorylation de la protéine XNP/ATR-X au cours du cycle cellulaire [15].
L'étude de certaines formes mutantes du domaine en « doigt de zinc » de la protéine XNP/ATR-X identifiées chez des patients ATR-X révèle :
– d'une part, une perte in vitro de la capacité de la protéine à se fixer à l'ADN ;
– d'autre part, une altération in vivo de la distribution cellulaire de la protéine (figure 3) [16].
Par ailleurs, des anomalies de la méthylation de certaines régions du génome (ADN ribosomique, répétitions DYZ sur le chromosome Y, etc.) ont également été mises en évidence chez des patients ATR-X [17]. Ces observations apportent les premières données sur le mécanisme cellulaire et biochimique à l'origine des phénotypes observés chez les patients.
Enfin, une propriété commune à l'ensemble des protéines ADN-hélicases de type SNF2, qui sont décrites comme des régulateurs globaux de la transcription, est d'exercer leurs fonctions au sein de complexes multiprotéiques [18]. Il est donc raisonnable d'envisager que le rôle de la protéine XNP/ATR-X soit médié par son appartenance à un tel complexe. Des études in vitro et in vivo menées dans ce but ont permis de montrer qu'elle s'associe en complexe avec des protéines participant à l'organisation de la chromatine, notamment les protéines EZH2, HP1α, β et γ [15, 19].
Ces données suggèrent que la protéine XNP/ATR-X pourrait, en modifiant la structure de la chromatine, jouer un rôle sur l'expression de certains gènes cibles (peut-être sur le locus α-globine).

Modèles animaux

La création de modèles animaux constitue une approche indispensable pour étudier les mécanismes à l'origine d'une pathologie héréditaire humaine, notamment quand il s'agit d'anomalies du développement du système nerveux. Cette approche est justifiée par la difficulté d'accéder au matériel humain nécessaire à une étude fonctionnelle in vivo des cellules et/ou des tissus. Une telle approche permet également d'évaluer des alternatives thérapeutiques pour ces pathologies.
Deux modèles murins du syndrome ATR-X ont été réalisés à ce jour. Le premier modèle, créé par surexpression chez la souris de la protéine Xnp/Atrx, montre un retard sévère du développement de l'embryon accompagné d'anomalies du tube neural et d'une forte létalité embryonnaire [20]. Ces données semblent indiquer que l'activité de la protéine Xnp/Atrx au cours du développement est dépendante du dosage génique.
Le second modèle, réalisé par invalidation totale du gène Xnp, conduit malheureusement à une létalité embryonnaire précoce des souris mâles hémizygotes pour la mutation. Il est intéressant de noter que les souris femelles hétérozygotes pour la mutation du gène Xnp sont de plus petite taille, dysmorphiques et présentent des troubles du comportement [21].
La création d'autres modèles animaux de mutations du gène XNP chez le nématode (C. elegans) et la drosophile est actuellement en cours (travaux non publiés), avec pour objectif majeur d'étudier in vivo la fonction cellulaire de la protéine XNP/ATR-X. Contrairement à la souris, ces deux modèles bien caractérisés sont de bons outils pour réaliser des études in vivo, notamment sur le remodelage de la chromatine.

Corrélations génotype-phénotype

Environ 70 mutations, pour la plupart des mutations ponctuelles, ont été décrites chez plus de 150 patients [22]. Ces mutations sont préférentiellement retrouvées dans les domaines fonctionnels, c'est-à-dire dans les motifs en « doigt de zinc » (60 %) et dans le domaine hélicase (20 %) (figure 2) [8]. Il ne semble pas exister de différence entre les phénotypes causés par des mutations non-sens, entraînant l'absence de la protéine, et ceux créés par des mutations faux-sens, entraînant la synthèse d'une protéine anormale. Il n'apparaît pas non plus de corrélation entre le domaine fonctionnel altéré et un phénotype particulier, à l'exception des mutations causant la perte du domaine C-terminal qui semblent être plus fréquemment associées à des anomalies sévères de la sphère uro-génitale. Une telle association suggère un rôle du domaine C-terminal dans le développement du système uro-génital [8]. Pour les autres domaines, aucun lien n'a été mis en évidence et il a même été décrit des phénotypes différents pour des mutations identiques.
Contrairement au modèle murin créé par invalidation totale du gène Xnp, les femmes porteuses d'une mutation ne présentent aucun des signes cliniques décrits chez les enfants atteints. La seule particularité décelable, qui peut orienter le diagnostic, est un biais d'inactivation du chromosome X avec une inactivation prédominante de l'X muté. De plus, il a été décrit un cas de mosaïque germinale chez une femme indemne de toute mutation et ayant donné naissance à plusieurs enfants porteurs de la même mutation dans le gène XNP [23].
À la suite de la découverte du gène, d'autres syndromes liés à la région Xq13-3 et présentant un retard mental sévère ainsi qu'une dysmorphie faciale caractéristique ont été testés. C'est ainsi que le phénotype a été élargi aux retards mentaux présentant les mêmes caractéristiques dysmorphiques mais sans α-thalassémie [24]. Cette variabilité des signes hématologiques peut s'expliquer soit par un retentissement variable des mutations sur la balance des chaînes de globine, soit par une compensation (ou une exacerbation) du discret déséquilibre entre les chaînes α et β globine par les autres gènes impliqués dans leurs régulations. Cette caractéristique de l'hémogramme, même inconstante, reste intéressante puisqu'elle concerne le seul gène désigné par le phénotype comme étant une cible, directe ou indirecte, de la protéine XNP/ATR-X.
Des mutations dans le gène XNP ont également été retrouvées dans un certain nombre d'autres syndromes : dans le syndrome de Juberg-Marsidi [25], dans le syndrome de Carpenter-Waziri [26], dans le syndrome de Holmes-Gang [27] et dans le syndrome de Smith-Fineman-Myers [28]. Dans tous ces syndromes, on retrouve un retard mental sévère et une microcéphalie, sauf dans le syndrome de Carpenter-Waziri où le retard mental reste modéré [26]. Dans tous, on retrouve la dysmorphie caractéristique associant un petit nez triangulaire, des narines antéversées, une lèvre supérieure en chapeau de gendarme et des incisives écartées (figure 1). Les patients atteints de syndrome de Juberg-Marsidi présentent une surdité neuro-endocrinienne [25], considérée au départ comme un signe caractéristique permettant de les différencier des patients ATR-X, mais plusieurs cas de surdité ont par la suite été décrits dans des syndromes ATR-X typiques (c'est-à-dire avec α-thalassémie). Enfin, chez les hétérozygotes, on retrouve, comme pour le syndrome ATR-X, un biais d'inactivation totale portant sur le chromosome X muté.
L'étude d'une famille atypique présentant un retard mental et une paralysie spastique a d'ailleurs permis d'établir un lien de cause à effet entre la mutation identifiée dans le gène XNP et le biais d'inactivation. Certains membres de cette famille étaient porteurs du même haplotype que celui du chromosome muté mais avaient une version intacte du gène XNP et ne présentaient pas de biais. En revanche, toutes les femmes porteuses de la mutation présentaient un biais total d'inactivation du chromosome muté [29]. Ce dernier peut résulter soit d'une sélection positive des cellules exprimant le gène intact pendant l'embryogenèse, soit d'une participation active du gène XNP au processus d'inactivation du chromosome X. Dans tous les cas, il est surprenant de constater qu'une sélection négative aussi complète chez la femme n'aboutit pas à la létalité chez les mâles atteints [29].
Plus récemment, la découverte, dans une même famille, de patients présentant un phénotype typique d'ATR-X et de patients portant la même mutation mais présentant un retard mental léger sans dysmorphie caractéristique a suggéré que le phénotype pouvait encore être élargi à d'autres retards mentaux liés au chromosome X, moins sévères et atypiques [30]. C'est ainsi que, par criblage systématique du gène XNP dans un groupe de patients modérément retardés, une mutation a été décrite dans une famille comprenant quatre membres atteints de retard mental modéré à léger et présentant une dysmorphie très discrète ou même absente [31].

Stratégie diagnostique

Certains tests, non spécifiques, permettent une orientation du diagnostic. Ce sont les études hématologiques ou la recherche d'un biais d'inactivation du chromosome X chez les mères des patients.
L'hémogramme peut révéler l'existence d'une microcytose modérée. Dans tous les cas, une coloration au bleu de crésyl devra être réalisée et permettra éventuellement d'objectiver sur le frottis sanguin la présence de corps de Heinz correspondant à des précipités de chaînes β-globine. Ces précipités sont difficiles à mettre en évidence et le test doit être répété à différents intervalles. Le pourcentage de corps de Heinz décrits chez les patients ATR-X varie entre 0 et 27 %. Il est sans corrélation avec les signes hématologiques (microcytose et pseudopolyglobulie) qui restent toujours très discrets, voire absents. Le seul examen qui permet d'objectiver de manière fiable un déséquilibre dans la production des chaînes de globine est la synthèse de chaînes in vitro mais cet examen est peu pratiqué en routine.
La recherche d'un biais d'inactivation du chromosome X chez la mère d'un sujet atteint se fait classiquement par l'étude de la méthylation du site polymorphe du récepteur aux androgènes. Jusqu'à présent, un biais a été retrouvé chez toutes les femmes porteuses obligatoires.
Concernant le diagnostic moléculaire, la taille importante de la séquence codante (plus de 7 kb), la structure complexe du gène XNP (35 exons) et la diversité des mutations rendent très coûteuse la recherche systématique de mutations chez les patients. Jusqu'à présent, le diagnostic moléculaire se limitait donc au séquençage des exons 7, 8 et 9 du gène XNP, codant pour les motifs en « doigt de zinc » dans lesquels ont été retrouvées 60 % des mutations. Néanmoins, l'augmentation du nombre de demandes de diagnostic ainsi que l'élargissement des phénotypes décrits ont conduit à mettre en place une stratégie diagnostique associant la recherche de la protéine XNP/ATR-X par immunocytochimie et le criblage exhaustif du gène XNP par DHPLC et séquençage.
La recherche de la protéine est réalisée par immunocytochimie avec des anticorps anti-XNP/ATR-X sur des lymphocytes de patients ATR-X. Les premiers résultats obtenus en combinant des expériences d'immunoblot et d'immunocytochimie sur des cellules de patients ATR-X avaient en effet montré soit une altération de la distribution cellulaire de la protéine XNP/ATR-X, soit l'absence totale de la protéine (figure 3) [16].
Le criblage de la totalité des exons du gène XNP est réalisé par chromatographie liquide haute performance en condition dénaturante (DHPLC) à partir de l'ADN génomique des patients. Dans le protocole établi, le gène a été découpé en 42 fragments qui couvrent tous les exons ainsi que les jonctions intron-exon. Ce criblage a confirmé, dans 100 % des cas, les mutations préalablement identifiées par séquençage.

Conclusion

Les mutations dans le gène XNP sont responsables de plusieurs syndromes de retard mental liés au chromosome X : α-thalassémie associée à un retard mental sévère (ATR-X) [7], Juberg-Marsidi [25], Carpenter-Waziri [26], Holmes-Gang [27] et Smith-Fineman-Myers [28]. Ces patients sont tous caractérisés par un retard mental sévère, une microcéphalie, une dysmorphie faciale caractéristique, des anomalies du tractus uro-génital et, parfois, une α-thalassémie.
Les premiers travaux réalisés sur la protéine XNP/ATR-X ont montré qu'elle exerçait sa fonction au sein de complexes multiprotéiques susceptibles de modifier la structure de la chromatine. Cependant, les conséquences de son dysfonctionnement restent encore difficiles à comprendre. Une meilleure connaissance de la fonction de la protéine XNP/ATR-X devrait permettre de préciser son rôle au cours du développement chez l'homme et de mieux comprendre l'origine des phénotypes observés chez les patients.
Certains traits du syndrome ATR-X devraient nous permettre d'orienter l'étude de la fonction de la protéine XNP/ATR-X. Un trait intéressant concerne l'α-thalassémie. Bien qu'il s'agisse d'une anomalie peu sévère, et inconstante, elle touche l'équilibre entre les chaînes α et β globine. Ce déséquilibre, provoqué par un dysfonctionnement de la protéine XNP/ATR-X, peut résulter soit d'une répression de la transcription du gène α-globine, soit d'une surexpression relative du gène β-globine. Dans les deux cas, on aboutit à un excès de chaîne β. Il est donc vraisemblable que le gène XNP joue un rôle dans le contrôle de l'expression d'un de ces deux loci. Les études fonctionnelles suggèrent fortement que la protéine XNP/ATR-X est capable, en s'associant en complexe, de modifier la structure de la chromatine et, donc, de modifier l'expression de certains gènes cibles. L'expression des gènes globines, dont la régulation est liée à la conformation globale de la chromatine, pourrait être modifiée de cette façon. Le rôle de la protéine XNP/ATR-X serait probablement, dans ce cas, de reconnaître de façon spécifique le locus α ou β globine et de maintenir un environnement chromatinien plus ou moins accessible à la machinerie transcriptionnelle n

Remerciements. Les travaux de laboratoire évoqués dans cette revue sont soutenus financièrement par le ministère de la Recherche : ACI : biologie du développement et physiologie intégrative (Coordinateur : M. Fontés), la Fondation pour la recherche médicale (FRM) et l'Association pour la recherche contre le cancer (ARC). Les auteurs remercient L. Villard pour sa contribution.

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