Physiopathology of V(D)J recombination : from T-B-SCID to leukemia

Les lymphocytes T et B exercent leur fonction de surveillance immune au travers de molécules spécialisées, le récepteur T à l'antigène (TCR) pour les cellules T et les immunoglobulines de surface (sIg ou BCR) pour les lymphocytes B. La fonction principale de ces molécules est la reconnaissance des antigènes étrangers et la transmission, au travers de molécules associées, d'un signal d'activation de la réponse immune. Face à l'ensemble du spectre antigénique possible, les lymphocytes T et B doivent opposer un répertoire suffisamment diversifié. La recombinaison V(D)J est le mécanisme moléculaire sélectionné au cours de l'évolution pour générer cette nécessaire diversité. De nombreuses et très bonnes revues ont été écrites ces dernières années sur les mécanismes de la recombinaison V(D)J ([1-4] pour les plus récentes) et celle-ci est donc focalisée plus spécifiquement sur la physiopathologie de cette étape du développement lymphoïde.

Survol de la recombinaison V(D)J

Le récepteur T à l'antigène ainsi que les immunoglobulines sont composés (figure 1) d'un domaine constant, ancré à la membrane, prolongé d'un domaine variable, polymorphe, responsable de la reconnaissance antigénique, et qui peut être lui-même divisé en sous-régions variables (V) de diversité (D) et de joint (J). Au niveau génomique, ces sous-domaines sont codés par des segments géniques multiples, « clusterisés » et dispersés sur le chromosome. La première étape dans l'expression d'un gène d'Ig ou du TCR est l'élaboration d'une unité fonctionnelle V(D)J réarrangée (figure 2) dans laquelle un segment V est rapproché d'un segment D et d'un segment J. La recombinaison V(D)J rend compte de cette étape de réarrangement somatique [5, 6]. La combinatoire de ces associations engendre une variabilité importante. La recombinaison V(D)J peut être très schématiquement divisée en trois étapes (figure 3). Au cours de la première, les protéines RAG1 et RAG2 reconnaissent des séquences spécifiques de recombinaison (RSS), formées d'un nonamère et d'un héptamère séparés de 12 ou 23 paires de bases, qui bordent les gènes V, D, et J, et induisent une cassure double brin de l'ADN (dsb) au niveau de ces signaux, laissant les extrémités libres codantes sous forme d'épingle à cheveux (hairpins) et les extrémités signales franches et phosphorylées (revue en [2]). L'expression tissulaire restreinte des gènes codants pour RAG1 et RAG2 rend cette étape spécifique des lymphocytes T et B immatures. La suite du processus vise à identifier et à réparer ce dommage à l'ADN et met en jeu la machinerie cellulaire générale de réparation de l'ADN (revue en [7]). Le premier acteur en est le complexe Ku/ADN-PK qui se fixe au site de la lésion et dont l'un des rôles est probablement le recrutement et l'activation des enzymes qui interviendront dans l'étape de réparation proprement dite. Cette dernière étape est aujourd'hui encore mal comprise. C'est au cours de celle-ci qu'intervient également l'enzyme terminal deoxynucléotydil transférase (TdT) dont l'expression est également restreinte au tissu lymphoïde et dont l'action d'addition au hasard de nucléotides aux sites des jonctions VD et DJ augmente encore leur diversité [8, 9]. Trois données essentielles ont permis des avancées considérables dans la compréhension des mécanismes du réarrangement V(D)J. La première est le clonage des gènes de ce que l'on pensait à l'époque représenter des activateurs de la recombinase : les recombination activating genes RAG1 et RAG2. Ces gènes ont été identifiés selon une stratégie simple et brillante, à savoir la transmission dans une cellule non lymphoïde (un fibroblaste) d'une activité recombinase V(D)J spécifique d'une cellule lymphoïde et l'identification du matériel génétique ainsi introduit et porteur de cette activité [10, 11]. Le transfert d'activité recombinase V(D)J dans un fibroblaste demeure la base de tous les tests in vitro utilisés aujourd'hui aussi bien pour analyser les capacités de recombinaison/réparation d'une cellule donnée que pour valider d'éventuelles mutations dans les gènes RAG1 et RAG2 [12]. Le deuxième élément déterminant est l'établissement d'une relation entre défaut de recombinaison V(D)J et défaut de réparation de l'ADN. L'origine de cette association est l'identification de la souris scid, souris qui présente une absence de lymphocytes T et B occasionnée par un défaut de recombinaison V(D)J [13]. Secondairement, des cellules de hamster chinois (CHO) sélectionnées in vitro pour leur défaut de réparation de l'ADN ont également montré des anomalies de la recombinaison V(D)J [14]. Le lien était fait et conduisait à la description du complexe Ku/ADN-PK et du facteur XRCC4 dont nous reparlerons. Enfin, la dernière avancée fondamentale est l'obtention plus récente des différentes étapes de la recombinaison V(D)J « en tube » dans des systèmes acellulaires, préliminaire indispensable à l'analyse biochimique fine de cette machinerie complexe (revue en [4]). Selon ces travaux, il apparaît que les protéines RAG1 et RAG2 sont nécessaires et suffisantes pour l'établissement du clivage de l'ADN au niveau des séquences spécifiques de recombination et la formation des épingles à cheveux aux extrémités codantes libres. Les différentes phases de l'étape de clivage ont été récemment précisées par la description d'un complexe protéique contenant les protéines RAG1/2 et la protéine HMG1 (high mobility group 1, qui se fixe non spécifiquement à l'ADN et entraîne la courbure de l'ADN) associées aux séquences RSS12 et RSS23 (complexe synaptique) avant la coupure de l'ADN [15]. À la suite du clivage, les quatre extrémités de l'ADN (deux codantes et deux signales) restent un moment associées dans ce même complexe appelé alors complexe synaptique post-clivage [15, 16]. Un rôle possible du complexe post-clivage pourrait être la protection des extrémités libre de l'ADN ainsi générées vis-à-vis des exonucléases cellulaires. L'ajout d'extraits nucléaires partiellement purifiés permet, dans certains cas, de poursuivre la réaction jusqu'à l'établissement d'un joint codant et d'un joint signal, les deux produits du réarrangement V(D)J (revue en [3]).

La recombinaison V(D)J représente également un point de contrôle (checkpoint) de la maturation des lymphocytes T et B. Pour ne prendre qu'un exemple illustratif, au cours de la différenciation des lymphocytes Ta/b, le réarrangement et l'expression de la chaîne b du TCR conditionnent la transition des thymocytes du stade double négatif (DN) au stade double positif (DP) ainsi que leur expansion [17]. Les expériences d'inactivation ciblée des gènes RAG1 et RAG2 ainsi que d'autres modèles chez l'homme et chez l'animal (tableau) dont je vais détailler maintenant certains aspects soulignent le rôle des protéines RAG dans le développement lymphoïde. L'intérêt de ces modèles, et plus particulièrement l'étude des déficits immunitaires sévères (SCID) chez l'homme, réside dans le fait qu'ils présentent d'emblée un phénotype fort et focalisent donc notre attention sur des composantes essentielles de la réaction de recombinaison.

Défaut de recombinaison V(D)J

Parmi l'ensemble des déficits immunitaires héréditaires chez l'homme, environ 20 % se présentent avec une absence de lymphocytes T et B matures (SCID T-B-) dans le sang périphérique (figure 4) mais l'existence de cellules natural killer (NK) normales [18]. Ces patients ressemblent donc à la situation de la souris scid évoquée plus haut, laissant entrevoir la possibilité d'un défaut de recombinaison V(D)J. Ces patients ne forment pas un groupe homogène et peuvent également être classés en fonction de l'existence ou non d'une hypersensibilité aux radiations ionisantes de leurs cellules, permettant de situer le défaut moléculaire dans les phases précoces ou tardives de la recombinaison [19].

La phase précoce (mutations de RAG1 ou RAG2)

Des mutations dans les gènes RAG1 ou RAG2, qui inactivent la fonction de ces protéines, ont été identifiées chez des patients SCIDT-B- « radiorésistants » qui ne présentent donc pas une sensibilité augmentée de leurs cellules aux radiations ionisantes ([20] et nos résultats non publiés). Comment l'identification de ces mutations nous renseigne-t-elle sur les domaines fonctionnels des protéines RAG1/2 ? Les rôles respectifs de RAG1 et RAG2 dans l'étape de clivage ne sont pas encore clairement définis. Des études de mutagenèse dirigée ont localisé des régions « core » minimales pour ces deux protéines et indispensables à l'activité recombinase. Deux études basées l'une, sur un système fonctionnel in vivo et l'autre, sur l'analyse physique des interactions protéiques suggèrent un contact de RAG1 avec les séquences RSS alors que RAG2 n'aurait pas d'affinité particulière pour l'ADN [21, 22]. Dans les deux cas on a une démonstration de l'interaction de RAG2 avec RAG1. La présence de RAG2 dans le complexe synaptique stabilise et augmente l'affinité de fixation de RAG1 sur le nonamère et étend cette interaction à l'heptamère [23, 24]. En l'absence de cristallisation de ces deux protéines, une représentation dans l'espace de ces interactions et la vision globale d'un complexe RAG1-RAG2-ADN n'est pas évidente. Une simulation de la structure tridimensionnelle de RAG2 a récemment été proposée à la suite d'une analyse fine de la séquence primaire, à la recherche d'îlots de motifs hydrophobes (hydrophobic clusters analysis ou HCA) [25]. Le principe de cette analyse repose sur le fait que les motifs globulaires des protéines ont une structure tertiaire dictée en partie par la présence de groupes hydrophobes dans leur noyau. L'agencement de ces résidus, plus que la séquence en acides aminés proprement dite, est généralement conservé entre domaines qui présentent des configurations spatiales voisines. Les résidus externes sont, eux, peu conservés et participent aux sites actifs de la protéine. L'analyse HCA appliquée à RAG2 [26] a permis d'identifier deux domaines globulaires particuliers. Le premier domaine est situé dans la région « core » (aa 1-355) et présente une structure en hélice-b (b-propeller) à six pales dont le prototype cristallisé est la galactose oxydase de dactylium dendroïdes (figure 5). Les motifs en b-hélice sont considérés comme des châssis à la surface desquels les interactions protéines-protéines interviennent. Il est dès lors tentant de proposer que ce motif de RAG2 puisse être impliqué dans les interactions avec RAG1. Les mutations décrites dans RAG2 à ce jour chez les patients SCID corroborent cette hypothèse. Elles sont en effet toutes localisées sur la même face du propeller, dans les différentes boucles qui séparent les pales de l'hélice et qui sont donc exposées aux solvants (figure 5). Deux de ces mutations (C41W et M285R) diminuent effectivement l'interaction avec RAG1 in vitro [27]. Le deuxième motif est situé dans la région C terminale de RAG2 (aa 410-530) à l'extérieur de la région « core » mais n'en présente pas moins une importante conservation au cours de l'évolution. L'analyse HCA de ce motif riche en cystéines et histidines prédit son appartenance à un groupe de motifs « doigts de zinc » particuliers de type C4HC3 appelés motifs PHD/TTC/LAP [28,29]. Cette région, différente des autres domaines qui fixent le zinc comme les motifs RING ou les domaines LIM, semble être plus spécifique des interactions protéines-protéines avec des facteurs associés à la chromatine. L'implication dans la recombinaison V(D)J de cette région de RAG2 qui n'est pas incluse dans les protéines produites in vitro et utilisées dans les systèmes acellulaires est de fait moins bien étudiée. Des expériences de complémentation du défaut de recombinaison V(D)J in vitro dans des lignées pré-B issues de souris RAG2^-/- suggèrent un rôle régulateur de ce domaine par son association à la chromatine [30]. Alors que ce motif ne semble pas nécessaire aux réarrangements intermédiaires DJ des gènes codant pour la chaîne lourde des Ig, il est en revanche absolument requis pour la formation de l'unité réarrangée productive VDJ finale. Trois des mutations que nous avons identifiées dans RAG2 chez des patients SCID T-B- sont localisées dans ce domaine particulier et deux d'entre elles interviennent sur des résidus déterminants (résultats non publiés). L'analyse des patients SCID T-B- confirme donc la vraisemblance de ces modèles théoriques de structure tridimensionnelle de RAG2.

Un cas particulier : le syndrome d'Omenn

Le syndrome d'Omenn est un déficit immunitaire héréditaire sévère caractérisé cette fois par une importante éosinophilie et l'absence de lymphocyte B circulant mais la présence de lymphocytes T activés, oligoclonaux dans le sang et infiltrant les tissus (figure 4). L'extrême restriction du répertoire de ces lymphocytes T [31, 32] laissait envisager qu'ils puissent résulter de l'échappement d'une mutation dans le système de recombinaison V(D)J, hypothèse renforcée par l'existence au sein d'une même fratrie d'un syndrome d'Omenn et d'un SCID T-B- classique. Des mutations, principalement localisées dans RAG1, sont responsables de ce déficit immunitaire ([27] et nos résultats non publiés). Un antigène particulier, qui reste à définir, est probablement responsable de l'expansion massive d'un petit nombre de clones T autoréactifs apparus dans ce contexte de recombinase V(D)J déficiente. La plupart des mutations identifiées chez ces patients sont situées dans la région core de RAG1 (aa 389-1009), dans l'homéodomaine impliqué dans l'interaction avec l'ADN. Ces mutants (R396H, R396C, D429G) maintiennent une interaction avec RAG2 mais leur activité dans le test de clivage in vitro est profondément réduite ainsi que leur activité recombinase in vitro [27]. Un autre mutant (R561H) ne peut plus s'associer efficacement à RAG2 diminuant d'autant la fixation du complexe RAG1-RAG2 à l'ADN [27]. L'étude de ces patients permet d'établir clairement que l'activité du complexe RAG1/2 est directement corrélée à la capacité de RAG1 à fixer l'ADN et à interagir avec RAG2. De même que pour RAG2, l'arrangement tridimensionnel de RAG1 n'est pas connu mais on peut penser que l'ensemble de ces mutants affectent des structures particulières de la protéine, structures qui devraient pouvoir être identifiées par une l'analyse fine de RAG1 par HCA comme cela a été fait pour RAG2.

La détection de la cassure : le complexe Ku/ADN-PK

À la suite de l'étape de clivage de l'ADN par les protéines RAG1 et RAG2, les extrémités libres (extrémités codantes et extrémités signales) générées restent associées au sein d'un même complexe synaptique post-clivage [15, 16]. Ici s'arrête la spécificité lymphoïde de la recombinaison V(D)J. Ce dommage à l'ADN doit maintenant être détecté et réparé. La première manifestation d'un défaut moléculaire affectant cette étape est venue de la caractérisation de la souris scid (revue en [13]). Dans ces souris la recombinaison V(D)J est initiée et bloquée au stade du clivage, avec accumulation des extrémités codantes en épingle à cheveux. Le gène muté chez ces animaux, ainsi que dans un modèle de scid chez le cheval [33, 34], est celui codant pour la sous-unité catalytique de l'ADN-PK. L'ADN-PK est une sérine/thréonine protéine kinase dépendante de l'ADN qui, bien qu'appartenant à la famille des phosphatidylinositol (PI) kinases, est dépourvue de cette activité [35]. Cette famille de protéines intervient dans la réponse aux dommages à l'ADN. Pour ne prendre qu'un exemple, ATM, la protéine dont le gène est muté dans l'ataxie télangectasie, appartient également à cette famille [36]. Ces protéines sont considérées comme des suppresseurs de tumeur. L'ADN-PK est recrutée aux sites des lésions à l'ADN par son association avec l'hétérodimère Ku70-Ku80, identifié initialement comme un auto-antigène humain, qui se fixe aux extrémités libres de l'ADN. Le rôle général du complexe Ku/ADN-PK serait la reconnaissance du dommage à l'ADN causé par RAG1/2, le recrutement et l'activation par phosphorylation des facteurs nécessaires à sa réparation, à commencer par l'endonucléase qui va ouvrir les épingles à cheveux formées par les extrémités codantes libres. Ces trois protéines agissent de concert et un manquement de l'une ou l'autre entraîne un défaut de la réparation des cassures double brin de l'ADN in vitro. Cela s'exprime par une hypersensibilité aux agents ionisants et une absence de formation des joints codants et/ou signaux au cours de la recombinaison V(D)J dans des cellules de hamster chinois (CHO) arborant de tels défauts. Ceci se traduit, in vivo, par un blocage de la maturation B et T [37, 38] à une exception près ; les souris dans lesquelles le gène codant pour Ku70 a été inactivé possèdent quelques lymphocytes T sans que l'on comprenne aujourd'hui la signification de ce résultat [39, 40]. Aucune situation comparable d'un défaut du complexe Ku-ADN-PK n'existe en pathologie humaine. Ces modèles animaux ont révélé une autre caractéristique intéressante du complexe Ku/ADN-PK. À partir de thymus ou de moelle osseuse de souris dans lesquelles le gène Ku80 a été inactivé, quelques rares joints codants sont identifiables par la technique d'amplification génique (PCR). Ces jonctions sont cependant dépourvues de nucléotide N, habituellement ajoutés par l'enzyme TdT au cours du processus de réarrangement [41]. Il semble donc que la TdT est spécifiquement recrutée soit par le complexe Ku/ADN-PK lui-même, soit par l'une des enzymes de réparation de l'ADN préalablement mobilisées par ce même complexe. Dans cette optique, il est intéressant de noter que l'enzyme TdT possède un motif BRCT identifié par analyse HCA [42]. Le motif BRCT a initialement été décrit dans la région C terminale de la molécule BRCA1 impliquée dans le cancer du sein. Ce motif est présent dans un grand nombre de protéines engagées dans la réponse aux dommages à l'ADN. Pour ne citer qu'un exemple, ce motif est retrouvé dans l'ADN-ligase IV [43], protéine dont la participation dans les phases finales de la recombinaison V(D)J est vraisemblable (voir plus loin). Il est dès lors tentant d'imaginer que la TdT est incorporée au complexe de réparation de l'ADN au travers de son motif BRCT. N'en serait-il pas de même pour d'autres facteurs ?

La réparation de la cassure

La dernière étape de la recombinaison V(D)J désigne la réparation proprement dite de la cassure double brin de l'ADN et doit, on s'en doute, faire intervenir une ou plusieurs ADN-ligases. Il existe chez l'homme trois ADN-ligases (I, II/III, et IV) [44]. Un défaut d'ADN-ligase I entraîne un déficit immunitaire moins sévère que le SCID [45], avec en particulier l'existence de lymphocytes T et B. D'autre part, la recombinaison V(D)J est normale dans les cellules issues d'un tel patient [46, 47]. Ces résultats ne sont pas en faveur de l'implication de l'ADN-ligase I dans la recombinaison V(D)J. À l'inverse, un faisceau d'arguments plaide en faveur du rôle probable de l'ADN-ligase IV dans ce processus. Cette ADN-ligase interagit avec la protéine XRCC4 et cette association renforce son pouvoir catalytique [43, 48-50]. XRCC4, qui est le facteur absent dans la lignée CHO-XR1 [51] caractérisée par un défaut de recombinaison V(D)J/réparation de l'ADN, est recruté et phosphorylé par l'ADN-PK [52]. Enfin, des protéines XRCC4 renfermant des mutations qui abolissent l'interaction avec l'ADN-ligase IV ne complémentent plus le défaut de recombinaison V(D)J dans la lignée CHO-XR1 [48]. Des homologues de ces deux protéines existent chez la levure Saccharomyces cerevisiae (LIG4 et LIF1) [53-56]. Des mutations de LIG4 entraînent une incapacité à réparer les cassures double brin de l'ADN par le mécanisme de ligation des extrémités non homologues (NHEJ, non homologous end joining). Le NHEJ et la recombinaison homologue sont les deux mécanismes de réparation de l'ADN chez la levure. Chez les mammifères, le NHEJ est le mécanisme principal de réparation en particulier au cours de la recombinaison V(D)J. Des arguments directs d'une implication d'ADN-ligase IV au cours de la recombinaison V(D)J attendront les résultats des expériences d'inactivation ciblée chez la souris.

Il existe chez l'homme un groupe de patients SCID T-B- (figure 4) chez qui les gènes RAG1/2 ne sont pas affectés et qui présentent une hypersensibilité de leurs cellules aux radiations ionisantes [19]. Nous avons démontré chez ces patients un défaut majeur de la recombinaison V(D)J se traduisant par l'incapacité à former des joints codants bien que la formation de joints signaux ne soit pas affectée [12]. Cette situation est donc très proche de la souris scid mais plusieurs arguments indiquent qu'il s'agit néanmoins d'un déficit distinct. Contrairement à la souris scid, l'activité kinase du complexe Ku/ADN-PK in vitro est normale d'une part, et l'implication du gène ADN-PKcs dans ce déficit a formellement été exclu par analyse génétique dans plusieurs familles consanguines [12, 57]. Il en est de même d'une série de gènes participant peu ou prou à la réparation de l'ADN et la recombinaison V(D)J (Ku70, Ku80, XRCC4, ADN-ligase I, ADN-ligase IV, topo-isomérases, etc.) [12]. Nous sommes donc dans une situation d'un défaut complet de réarrangement des gènes d'Ig et du TCR chez l'homme dont le gène reste à identifier.

Déficits immunitaires et « maladies cassantes »

Plusieurs pathologies associent un déficit immunitaire plus ou moins sévère à une instabilité chromosomique [58]. Il s'agit en particulier de l'ataxie télangiectasie, le syndrome de Nijmegen, le syndrome de Bloom, l'anémie de Fanconi ou encore un cas isolé de déficit en ADN-ligase I. Ces pathologies sont de transmission autosomique récessive et sont caractérisées d'un point de vue cellulaire par une radiosensibilité augmentée, parfois associée, à un défaut de contrôle du cycle cellulaire après irradiation. On retrouve chez ces patients une forte prédisposition à différentes hémopathies malignes associée à un syndrome de cassure chromosomique. Dans le cas de l'ataxie télangiectasie et du syndrome de Nijmegen, cette fragilité chromosomique s'accompagne souvent de translocations faisant intervenir les gènes du TCR. Le déficit peut être sévère et affecte en général les fonctions humorales (lymphocytes B) et cellulaires (lymphocytes T). Il est parfois plus marginal comme dans l'anémie de Fanconi. L'ataxie télangiectasie et le syndrome de Nijmegen sont des pathologies voisines mais dont les gènes en cause sont différents [59]. Le gène responsable de l'ataxie télangiectasie, ATM sur le chromosome 11, appartient à la famille des phosphatidylinositol-3 kinase au même titre que ADN-PKcs. Le produit du gène ATM serait impliqué dans la voie de signalisation du dommage à l'ADN vers la protéine p53 [36]. Dans cette optique ATM est considéré comme un gène suppresseur de tumeur, ce qui a récemment été proposé pour ADN-PKcs également [60]. Le gène NBS1 (ou nibrin) est localisé sur le chromosome 8 et code pour une protéine de 95 kDa [61-63]. Bien que la structure primaire de NBS1 ne révèle pas d'homologie frappante avec d'autres protéines, on peut cependant noter deux motifs structuraux dans sa région N-terminale, dont l'un est un motif BRCT (voir supra), ce qui rend un peu plus générale la présence de tel motif dans les protéines de la réponse aux dommages à l'ADN. La protéine NBS1 fait partie d'un complexe multiprotéique composé de hRad50, hMRE11 et d'autres facteurs non identifiés [61]. Chez la levure, Rad50p et Mre11p s'associent à une autre protéine Xrs2p dont le poids moléculaire (95 kDa) est identique à celui de NBS1 (revue en [64]). Du point de vue de leur séquence primaire, rien n'apparente cependant ces deux protéines. Le complexe Rad50p-MRE11p-Xrs2p joue un rôle fondamental, chez la levure, dans les mécanismes de réparation des cassures double brin de l'ADN par religation des extrémités non homologues (NHEJ) après radiations ionisantes. De même, l'inactivation de MRE11 dans des cellules ES de souris entraîne une hypersensibilité aux radiations ionisantes [65]. Dans les cellules de mammifères les rayons ionisants conduisent à une relocalisation du complexe hRad50-hMRE11-NBS1 en focus à l'intérieur du noyau, peut-être aux sites des lésions [66]. Dans le syndrome de Nijmegen, l'absence de NBS1 empêche la formation de ces focus [61]. Ce complexe protéique a-t-il la moindre relevance avec l'étape de réparation de l'ADN au cours de la recombinaison V(D)J ? Il est trop tôt pour en avoir une idée précise. Certains proposent que l'activité exonucléasique de MRE11 pourrait intervenir dans l'ouverture des hairpins présents aux extrémités codantes à la suite de l'étape de clivage [67]. Le syndrome de Bloom est caractérisé par une absence d'activité ADN-ligase I in vitro et le gène défectueux, BLM, code pour une ADN-hélicase homologue à la protéine RecQ des bactéries [68]. Ici encore, le rapport avec la recombinaison V(D)J semble lointain. En effet, les cellules de patients présentant un syndrome de Bloom, au même titre que celles d'un patient ayant un défaut du gène codant pour l'ADN-ligase I elle-même ou les cellules ataxie télangiectasie, ne présentent pas de défaut de l'activité recombinase in vitro [46, 47]. On ne peut pas exclure que ces protéines interviennent dans d'autres mécanismes de réarrangements du génome spécifiques au système immunitaire tels que la commutation isotypique de la chaîne lourde des Ig (Switch), mais ceci dépasse le cadre de cette revue. Finalement, l'anémie de Fanconi est également un défaut caractérisé par une grande instabilité chromosomique spontanée [69]. Cette pathologie est très hétérogène avec huit groupes de complémentation (A-H). Les gènes responsables sont identifiés pour les groupes A et C mais la fonction du produit de ces gènes reste inconnue. L'utilisation du test V(D)J in vitro dans des cellules de patients FA-C et FA-D a montré l'existence d'importantes imprécisions lors de l'étape de religation des extrémités codantes après clivage [70]. Ces imprécisions sont en général dues à une dégradation excessive des extrémités de l'ADN. Ce résultat contraste cependant avec l'absence de phénotype immunologique sévère chez les patients atteints d'une anémie de Fanconi.

Ce dernier exemple de l'anémie de Fanconi est assez représentatif de la situation, quelque peu paradoxale, dans laquelle nous nous trouvons. Aucune des pathologies susmentionnées ne conduit à un phénotype de SCID T-B- alors même qu'elles résultent de défauts majeurs de réparation de l'ADN, en particulier des cassures double brin, défaut qui se traduit souvent par des manifestations extrahématologiques (ataxie, télangiectasie, microcéphalie) et/ou hématologiques (hémopathies). À l'inverse, un défaut total, a priori plus sévère, de réparation de ces cassures au cours de la recombinaison V(D)J, ne semble pas avoir de manifestations autres que l'absence de lymphocytes T et B chez les patients SCID bien que le déficit moléculaire ne soit pas spécifique à la lignée lymphocytaire.

Recombinaison V(D)J illégitime

Pour terminer, la recombinaison V(D)J peut être envisagée sous l'angle de son implication possible dans les processus de leucémogenèse. Par essence, la recombinaison V(D)J doit être un processus moléculaire hautement contrôlé afin d'éviter des remaniements illicites du génome. Trois niveaux de régulation peuvent être évoqués.

1) La présence des deux protéines RAG1 et RAG2 est nécessaire pour l'initiation de la recombinaison et l'expression des gènes codant pour ces deux facteurs est spécifique des seules cellules lymphoïdes, éludant toute recombinaison V(D)J illégitime en dehors du système immunitaire.

2) Les séquences signales de recombinaison (RSS) sont formées d'heptamères et de nonamères et sont donc vraisemblablement largement représentées dans le génome. Cependant, ces deux éléments sont séparés de 12 ou 23 paires de bases et la recombinaison V(D)J ne s'effectue qu'entre segments bordés par des RSS-12 et RSS-23 (règle du 12/23), ce qui donne un degré supplémentaire de contrainte. Les protéines RAG1 et RAG2 elles-mêmes maintiennent cette règle.

3) Le troisième niveau de contrôle réside dans le degré d'accessibilité de l'ADN à la recombinase (revue en [71]). Selon ce principe, seuls les locus qui présentent leur chromatine dans une configuration ouverte peuvent réarranger. Ce dernier niveau de régulation est en particulier le garant des réarrangements concertés des gènes d'Ig et du TCR dans les lymphocytes B et T respectivement. L'ensemble des éléments génétiques (V, D, J, C) spécifiques de chaque locus d'Ig ou du TCR est localisé sur le même chromosome et ne nécessite pas un processus de trans-réarrangement entre chromosomes distincts. Néanmoins, de tels réarrangements, interlocus, existent à une fréquence faible dans les lymphocytes normaux. C'est le cas par exemple des deux locus de la chaîne légère des Ig (k et l) avec une fréquence mille fois inférieure à celles des réarrangements normaux [72]. Des réarrangements inter-locus ont également été décrits pour les gènes g et d, ou g et b du TCR chez l'homme [73, 74]. La fréquence de ces réarrangements augmente considérablement dans les pathologies telles que l'ataxie télangectasie [75] et donne une indication du risque de développement d'une hémopathie lymphoïde maligne [76]. Dans ce contexte, l'implication de la recombinaison V(D)J dans les translocations a été soulevée.

Translocations dans les hémopathies malignes

Les hémopathies malignes sont très généralement associées à des translocations chromosomiques mettant en jeu des gènes suppresseurs de tumeurs ou des oncogènes, événements moléculaires qui participent au processus de leucémogenèse. Dans les leucémies lymphoïdes, ces translocations font volontiers intervenir les locus des Ig et du TCR, suggérant assez fortement qu'elles procèdent d'une recombinaison V(D)J illégitime. Des arguments directs pour un tel mécanisme ont été apportés dans plusieurs systèmes (figure 6a). Dans le cas du lymphome folliculaire, la translocation de l'oncogène Bcl2 dans le locus de la chaîne lourde des Ig pourrait être le résultat d'une recombinaison illégitime au travers de séquences RSS cryptiques présentes dans la région mbr (major breakpoint région) du gène BCL2 [77]. Cette hypothèse est renforcée par l'existence de courtes délétions ainsi que par l'addition de nucléotides N aux points de cassure. Le même phénomène a été évoqué pour la translocation de cMyc dans le locus a/d du TCR dans la lignée leucémique MOLT-16 ainsi que dans d'autres leucémies T [78, 79]. Ces translocations médiées par la recombinase V(D)J semblent également intervenir à l'extérieur même de tout locus d'Ig ou du TCR. C'est probablement le cas de la modification du gène SCL retrouvée dans certaines T-ALL et qui entraîne la dérégulation de l'expression de ce facteur de transcription [80]. Enfin une recombinaison V(D)J illégitime est également responsable de la délétion du gène supresseur de tumeur MTS1/p16^INK4a/CDKN2 dans un nombre important de leucémies T caractérisées par des réarrangements du chromosome 9 ainsi que dans la lignée MOLT-4 [81]. Dans certains cas de translocations, l'existence de séquences RSS cryptiques pouvant participer au processus de recombinaison illégitime n'est pas évidente. Un autre mécanisme (revue en [82]) a été proposé sans arguments directs très convaincants selon lequel l'existence d'une cassure double brin dans un des locus des Ig ou du TCR pourrait s'accompagner d'une autre cassure aléatoire sur un autre chromosome devenant ainsi partenaire de la translocation. Une explication beaucoup plus rationnelle proposée tout récemment repose sur le fait que RAG1 et RAG2 ont une activité de transposition in vitro [83-85].

RAG1/RAG2 : un transposon « éteint » ?

Les transposons sont des éléments génétiques mobiles autonomes qui peuvent se déplacer dans le génome. Ils sont, très schématiquement, composés d'un ou de plusieurs gènes codant pour une activité « transposase », bordés par des séquences signales au travers desquelles s'effectue la réaction de transposition. Des analogies entre recombinaison V(D)J et transposition sont apparues dès la mise au point de l'étape de clivage par les protéines RAG1/2 dans des systèmes acellulaires [86]. Ainsi, la recombinaison V(D)J, l'intégration rétrovirale et le processus de transposition font tous intervenir un groupement hydroxyl (3'-OH) responsable d'une réaction de transestérification dépendante d'ions magnésium sur le brin d'ADN cible. L'existence même des séquences RSS rappelle les séquences présentes de part et d'autre des transposons. Finalement, l'organisation des gènes RAG1 et RAG2 sous forme d'une unité compacte laissait penser, dès leur clonage, que ces deux éléments puissent appartenir à un élément transposable ancestral. Hiom et al. et Agrawal et al. ont apporté des preuves expérimentales directes selon lesquelles les protéines RAG1 et RAG2 sont capables, en tube, de transférer du matériel génétique entre deux molécules d'ADN par transposition [84, 85]. Les protéines RAG ont donc une activité transposase in vitro. Les implications de cette découverte sont doubles. D'un point de vue purement évolutif, ces résultats, suggèrent qu'un ou plusieurs événements de transposition médiés par RAG1 et RAG2 pourraient être à l'origine de la structure « éclatée » des gènes d'immunoglobulines et du TCR. À partir de ces résultats, on peut également envisager que les protéines RAG soient à l'origine de translocations chromosomiques non plus par recombinaison V(D)J illégitime mais par transposition (figure 6b). Deux types de transpositions peuvent être imaginées à partir du groupement hydroxyl présent sur les extrémités signales libres [83]. Dans le modèle de simple transposition, un groupement OH attaque un fragment d'ADN cible, entraînant l'apparition d'un nouveau groupe OH dans ce dernier et la formation d'une structure branchée. La résolution de cette structure par les protéines RAG entraîne une cassure double brin au niveau du gène cible et la formation des épingles à cheveux à son extrémité codante. La machinerie de réparation de l'ADN se charge de rabouter ce nouveau gène à l'autre extrémité codante générée initialement dans le gène d'Ig ou du TCR, générant ainsi la translocation du gène cible dans le gène d'Ig ou du TCR. Le même mécanisme est envisagé dans le cas d'une transposition double où cette fois les deux extrémités signales libres participent à la transposition. L'analyse future des translocations existantes dans les leucémies sera d'un grand intérêt pour apprécier si ce phénomène de transposition par les protéines RAG peut réellement intervenir in vivo.

* Franck KK, et al. Late embryonic lethality and impaired V(D)J recombination in mice lacking DNA-ligase IV. Nature 1998 ;
306 : 173-7.

* Gao Y, et al. A critical role for DNA end-joining proteins in both lymphogenesis and neurogenesis. Cell 1998 ; 95 : 891-902.

L'évolution a sélectionné un mécanisme complexe, peut-être à partir d'un élément transposable, permettant de générer un répertoire aux spécificités antigéniques diversifiées pour les lymphocytes T et B : la recombinaison V(D)J. Une faille dans le système peut entraîner tout aussi bien une alymphocytose par défaut qu'une leucémie par excès. Plusieurs questions restent en suspens. Quel est le facteur impliqué dans la recombinaison V(D)J et la réparation de l'ADN, défectueux chez les patients SCID T-B- radiosensibles ? Entre RAG1 et RAG2 finalement qui fait quoi et comment ? Le transposon RAG1/RAG2 peut-il se réveiller in vivo et participer aux translocations chromosomiques dans les hémopathies malignes ? Enfin, quelles sont les bases moléculaires de la régulation en cis de la recombinaison V(D)J ? Cette dernière question relative à l'accessibilité de l'ADN n'a pas été évoquée dans cette revue mais n'en demeure pas moins une composante clé de la recombinaison V(D)J.