Diagnosis of inherited platelet disorders in 1998

ARTICLE

Les plaquettes sont impliquées dans les phénomènes d'hémostase, leur rôle étant d'assurer le maintien de l'intégrité vasculaire. Une diminution de leur nombre ou une anomalie de leur fonction va rompre cet équilibre avec le développement de syndromes hémorragiques. La formation d'une brèche vasculaire entraîne une succession d'événements auxquels participent les plaquettes. La première phase correspond aux phénomènes d'adhésivité impliquant des récepteurs plaquettaires qui reconnaissent des protéines présentes dans le sous-endothélium, telles que le facteur von Willebrand (vWF), le collagène, la laminine. Cette étape est suivie par une activation avec sécrétion du contenu granulaire. Enfin, l'interaction entre plaquettes adjacentes correspond à l'agrégation plaquettaire. Ces phénomènes mettent en jeu des récepteurs, qui sont des glycoprotéines, et des protéines qui représentent leurs ligands [1, 2].

Dans ce chapitre, nous décrivons les points les plus importants du diagnostic des thrombopathies et de la stratégie d'exploration des pathologies plaquettaires en insistant sur les nouveaux moyens à notre disposition. Il est à noter une grande hétérogénéité dans la connaissance des thrombopathies. Pour certaines d'entre elles, comme pour la thrombasthénie de Glanzmann ou le syndrome de Bernard-Soulier, la base moléculaire de l'anomalie est découverte. Pour ces pathologies, tous les moyens actuels de biologie moléculaire et cellulaire permettent de cibler l'anomalie. Pour de nombreuses autres pathologies, la base moléculaire du déficit reste mystérieuse et leurs descriptions dans la littérature permettent seulement une connaissance de leur phénotype. Enfin, les investigations biologiques plaquettaires actuelles permettent l'identification de nouvelles pathologies comme les anomalies de la transmission des signaux intraplaquettaires.

Contexte clinique

Il est à souligner que les explorations biologiques doivent s'accompagner d'une connaissance précise du contexte clinique qui permettra d'orienter les recherches. La précocité de la survenue du syndrome hémorragique au cours de la vie, sa localisation, les antécédents familiaux et l'origine ethnique du patient seront des éléments qui permettront de juger de la sévérité du syndrome et de le placer dans un contexte d'anomalie congénitale ou acquise. Les thrombopathies constitutionnelles sont soit isolées, soit associées à des pathologies plus générales accompagnées d'anomalies d'autres cellules sanguines, d'organes (rein, foie), ou de surdité, albinisme, eczéma, infections. Les thrombopathies sont souvent associées à des thrombopénies et parfois assimilées à des purpuras thrombopéniques idiopathiques (PTI) [3].

Anomalies de la fonction plaquettaire et déficit d'un récepteur effecteur

Thrombasthénie de Glanzmann

La thrombasthénie de Glanzmann est une pathologie plaquettaire hémorragique congénitale, rare, où des anomalies quantitatives ou qualitatives de l'intégrine alpha_IIbbeta₃ sont associées à une absence de l'agrégation plaquettaire et dont la transmission est autosomale récessive [3-6]. Des anticorps antiplaquettes dans le cadre d'un syndrome dysimmunitaire ou encore les traitements anti-agrégants de type anti-GP IIb-IIIa chez des malades avec un syndrome d'ischémie coronaire peuvent reproduire les anomalies fonctionnelles de cette thrombopathie.

• Circonstances de diagnostic

Le syndrome hémorragique se manifeste dès la naissance par du purpura, des gingivorragies, des épistaxis. Le diagnostic doit être évoqué chez le nouveau-né présentant un saignement au niveau du cordon ombilical ou des pétéchies. Une forte proportion des patients présentant cette pathologie appartient à des communautés où existe une forte consanguinité. Le diagnostic peut être évoqué plus tardivement chez l'enfant ou l'adulte jeune à l'occasion d'épistaxis ou d'autres saignements muqueux ou encore après des saignements postopératoires. Le diagnostic est plus rarement effectué à partir de la mise en évidence d'un temps de saignement allongé. Chez l'adulte plus âgé, ce sont des formes acquises de thrombasthénie de Glanzmann qui doivent être suspectées.

• Critères de diagnostic

- L'agrégation plaquettaire est nulle quel que soit l'inducteur utilisé (ADP, collagène, acide arachidonique, épinéphrine, thrombine) (figure 1). L'agglutination des plaquettes à la ristocétine est présente mais, souvent, elle est suivie de désagglutination rapide ou de séries de vagues d'agglutination et de désagglutination. Le nombre des plaquettes reste normal ainsi que leur morphologie.

- La cytométrie en flux (figure 2), avec utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre GP IIb-IIIa, soit directement conjugués, soit révélés par des d'anticorps secondaires marqués avec un fluorochrome, permet d'effectuer le diagnostic [7]. Un grand avantage de cette technique est qu'elle ne nécessite que des quantités minimes de sang. L'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre chacune des deux glycoprotéines, ou encore contre des épitopes dépendants du complexe et enfin dépendants de l'activation [8], permet la détection de variants correspondant à des anomalies qualitatives des complexes GP IIb-IIIa. L'étude de la fixation du fibrinogène conjugué au FITC est un complément très utile à l'étude de ce récepteur [9]. La cytométrie en flux est particulièrement utile pour le diagnostic chez le nouveau-né.

• Examens supplémentaires

- La recherche du type de thrombasthénie de Glanzmann (type I < 5 % de GP IIb-IIIa, type II entre 5 et 15 % et variant) nécessite de connaître la quantité de GP IIb-IIIa des plaquettes [4]. L'analyse des chaînes séparées de GP IIb et de GP IIIa est effectuée par électrophorèse en gel de polyacrylamide, en simple ou double dimension, à partir de protéines plaquettaires solubilisées dans le détergent ionique SDS (SDS-PAGE). La recherche de traces de GP IIb ou de GP IIIa est aussi effectuée par immuno-empreintes en utilisant des anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques de ces glycoprotéines. La présence ou l'absence de fibrinogène intraplaquettaire est souvent recherchée ainsi que le degré de rétraction du caillot [4, 5].

- La recherche du défaut génétique des gènes codant pour GP IIb et GP IIIa est réservée aux laboratoires spécialisés dans ces domaines (voir [6]). Les anomalies trouvées à ce jour sont très variées, les mutations se répartissent sur les différents exons codant pour GP IIb ou GP IIIa [1, 7]. Pour les variants, qui sont moins nombreux, une mutation a été trouvée au niveau de l'acide aminé 214 de GP IIIa pour trois différentes familles. Un autre variant présente une mutation au niveau de la partie intracytoplasmique de GP IIIa (acide aminé 752), ce qui entraîne l'incapacité de GP IIb-IIIa à acquérir sa fonction de site récepteur pour le fibrinogène.

Syndrome de Bernard-Soulier

Cette pathologie plaquettaire congénitale résulte d'un déficit ou d'une anomalie qualitative du complexe GP Ib-IX-V qui se traduit par un syndrome hémorragique important [3, 4]. La transmission est habituellement autosomale récessive dans un cas, une transmission sur un mode dominant a été rapportée. L'anomalie fonctionnelle majeure concerne le défaut d'adhésivité des plaquettes au vWF. Cette pathologie très rare, initialement appelée "dystrophie thrombocytaire hémorragipare", a été décrite pour la première fois en 1948 [10].

• Circonstances de diagnostic

Le diagnostic doit être envisagé lors d'un syndrome hémorragique chez le nouveau-né (saignement au niveau du cordon, pétéchies). Chez l'enfant ou l'adulte jeune, il doit être évoqué à l'occasion d'épistaxis ou d'autres saignements muqueux, ou encore après des saignements post-chirurgicaux. Le diagnostic peut être également suspecté à la suite de la mise en évidence d'un temps de saignement allongé ou d'une thrombopénie avec plaquettes géantes. Toutefois, le plus souvent c'est le syndrome hémorragique qui motive les investigations [3].

• Critères de diagnostic

- Les plaquettes sont en nombre diminué, de taille géante, de forme arrondie.

- L'agglutination à la ristocétine est nulle, en revanche l'agrégation plaquettaire induite par les agonistes physiologiques, excepté la thrombine, est normale (figure 1).

- Une absence d'agglutination à la ristocétine pouvant résulter d'un déficit en vWF, situation beaucoup plus courante, le dosage du vWF RCo et vWF Ag s'impose.

- La cytométrie en flux est particulièrement intéressante pour cette pathologie alliant thrombopénie et plaquettes géantes (figure 2). Elle permet d'analyser en parallèle 1) la fixation d'anticorps monoclonaux dirigés contre les différents composants du complexe GP Ib-IX-V, 2) l'homogénéité de l'anomalie au sein de la population plaquettaire et 3) la taille des plaquettes. L'utilisation d'un panel d'anticorps est souhaitable : il doit comprendre des anticorps dirigés contre la partie N-terminale de
GP Ibalpha, où est localisé le site récepteur du vWF, d'autres anticorps dirigés contre la partie du macroglycopeptide de GP Ibalpha, des anticorps anti-GP IX et, lorsque cela est possible, des anticorps anti-GP V et GP Ibbeta [7]. Il est utile, pour ce type de pathologie où la taille des plaquettes avoisine celle des globules blancs, d'effectuer un double marquage avec un anti-GP IIb-IIIa. Le déficit peut être global mais, le plus souvent, on trouve une expression résiduelle de plusieurs sous-unités du complexe [4, 11].

- Cette pathologie est à différencier d'un PTI car, dans les deux cas, on note une thrombopénie. La recherche d'anticorps antiplaquettes s'avère donc nécessaire.

• Examens supplémentaires

- L'analyse des composants du complexe GP Ib-IX-V par immuno-empreinte montre la présence de quantités résiduelles de protéines. L'absence de toute trace de l'un des composants du complexe peut faciliter l'identification du gène muté. Les études en biologie moléculaire ont montré des mutations au niveau du gène codant pour GP Ibalpha, non seulement au niveau de la partie N-terminale, mais aussi dans des zones plus proches de la partie transmembranaire ; des mutations sur les gènes codant pour la GP IX et la GP Ibbeta ont également été rapportées [7, 11]. À ce jour, aucune mutation n'a été trouvée pour GP V.

- L'origine de la thrombopénie n'est toujours pas élucidée. Si dans les quelques cas où les mégacaryocytes ont été examinés, il a été montré des anomalies susceptibles d'expliquer une mégacaryocytopoïèse inefficace, cette explication n'est peut-être pas la seule pour justifier l'intensité de la thrombopénie.

- L'anomalie de la consommation de prothrombine est une caractéristique du syndrome de Bernard-Soulier [4].

Anomalies de la fonction plaquettaire et déficit d'un récepteur d'agoniste

Anomalie isolée de la réponse au collagène

Les plaquettes comportent plusieurs récepteurs impliqués dans l'interaction avec le collagène qui sont le complexe GP Ia-IIa, la GP IV (CD 36) et une protéine de 62 kDa, la GP VI. Le déficit en complexe GP Ia-IIa (intégrine alpha₂beta₁) est actuellement le mieux évalué. La présence de GP IV n'est pas constante sur les plaquettes de tous les individus, en particulier dans la population asiatique où une faible proportion de sujets sont déficients pour cette GP, individus appelés (Nak^a-) [12]. Ce déficit ne s'accompagne d'aucun syndrome hémorragique ou anomalie fonctionnelle plaquettaire significative. Enfin, il a été rapporté une absence d'agrégation spécifique au collagène chez un individu présentant un déficit sévère en GP VI [13]. Ce type d'observation demeure ponctuel, mais grâce à l'utilisation de la convulxine qui est une protéine dérivée du venin de serpent, l'étude de la voie de l'activation induite par la GP VI devient possible [14].

Déficit en GP Ia-IIa

• Clinique et biologie

Le seul cas de déficit congénital décrit dans la littérature concerne une patiente avec un syndrome hémorragique important [15]. Le temps de saignement est très allongé, le nombre de plaquettes est normal. Il n'existe pas d'agrégation avec le collagène et l'adhésion au sous-endothélium est réduite. L'agrégation est normale avec tous les autres inducteurs. L'anomalie semble concerner la GP Ia.

Grâce à des anticorps monoclonaux, l'évaluation de GP Ia-IIa peut être effectuée par cytométrie en flux ou par immuno-empreinte. Le nombre de copies par plaquette a été initialement évalué par des études de liaison d'anticorps monoclonaux radiomarqués. Il a été trouvé entre 800 et 1 800 sites de GP Ia-IIa par plaquette, selon l'anticorps monoclonal qui a servi à faire les tests de liaison. Les travaux de Kunicki et al. [16] indiquent que ce taux est très variable d'un individu à un autre, mais aussi que, chez les femmes, le nombre de sites récepteurs pour le collagène varie en fonction du cycle menstruel. Cette variation du nombre de sites est liée au polymorphisme du gène codant pour la GP Ia.

Dans ce contexte de très grande variabilité du nombre de copies de GP Ia-IIa, avec en plus un nombre faible de copies par plaquette chez les sujets normaux, le diagnostic n'est pas aisé et la plus grande prudence s'impose avant d'affirmer une anomalie congénitale.

Les études récentes semblent montrer que le collagène se fixe au niveau de la GP Ia-IIa et que la transmission du signal responsable de l'agrégation se fait par la GP VI.

Anomalie isolée de la réponse à l'ADP

• Clinique et biologie

Plusieurs observations sont rapportées : le syndrome hémorragique est modéré mais s'exprime essentiellement au cours d'une intervention ou lors d'un traumatisme. Les anomalies sont caractérisées par une agrégation réduite et réversible même aux fortes doses d'ADP [9, 17]. L'agrégation avec l'acide arachidonique ainsi qu'avec d'autres agonistes est normale, excepté aux faibles doses. La réponse au collagène est diminuée à cause du rôle synergique de l'ADP. Les granules denses sont normaux en nombre et en contenu. Ce profil d'agrégation rappelle celui qui est observé chez des patients recevant de la ticlopidine.

• Précision du diagnostic

Le nombre de sites récepteurs du (³H)-2-méthyl-thio ADP (un analogue stable de l'ADP) à la surface plaquettaire est très réduit : de l'ordre de 30 pour le patient étudié dans notre laboratoire par rapport à 836 ± 126 pour les témoins [9]. Il en résulte une anomalie d'activation du complexe GP IIb-IIIa par l'ADP (figure 2). Il reste à déterminer quel récepteur est génétiquement anormal (P2Y1, P2T_PLC ou P2T_AC selon les auteurs) ou si l'anomalie concerne une voie de transmission du signal.

Anomalies d'autres récepteurs

De nombreux récepteurs plaquettaires appartiennent à la classe des récepteurs à sept domaines transmembranaires. La détection d'anomalies de ces récepteurs commence à émerger : une mutation au niveau du récepteur du TxA2 a été identifiée (Arg⁶⁰ => Leu [18]) chez un patient présentant un syndrome hémorragique. Ce syndrome se caractérise par une absence d'agrégation au thromboxane A2 et à ses analogues malgré un changement de forme normal. Ce récepteur est lié à la phospholipase C (PLC) par une Gq protéine. L'activation de la phospholipase C a été trouvée anormale confirmant cette voie d'activation. Un autre exemple concernant ce type de récepteur est un déficit en récepteur alpha-2-adrénergique se caractérisant par une absence sélective de l'agrégation à l'adrénaline [19].

Anomalie de réponse à l'acide arachidonique

Les anomalies congénitales résultant soit d'un déficit en cyclooxygénase, soit d'un déficit en thromboxane synthétase sont excessivement rares [13]. Le premier déficit en cyclooxygénase a été rapporté par Malmsten et al. [20]. Les plaquettes n'agrègent pas à l'acide arachidonique et présentent, avec les autres inducteurs, un profil semblable à celui observé avec l'aspirine  : absence d'agrégation au collagène et agrégation réversible à l'ADP (figure 1). L'anomalie se situe au niveau de la cyclooxygénase qui est incapable de convertir l'acide arachidonique en prostaglandine PGG₂. Le syndrome hémorragique est le plus souvent modéré.

Les déficits en thromboxane synthétase présentent le même profil d'agrégation [21]. La démonstration directe d'un déficit en thromboxane synthétase peut être obtenue par l'étude du métabolisme d'(H³) acide arachidonique.

Il n'est pas toujours facile de différencier une anomalie congénitale d'une simple prise médicamenteuse. Étant donné la rareté de ces anomalies et la fréquence de la mise en évidence de ce profil d'agrégation à la suite de prises d'aspirine avouées ou pas, il est prudent, avant d'entreprendre des investigations très sophistiquées, d'effectuer un dosage d'acide salicylique dans le sang.

Anomalies de la transmission du signal

Les anomalies appartenant à ce groupe sont de description récente.

Un premier exemple concerne une anomalie de la transmission du signal induit par le thromboxane A2. Ce cas est caractérisé par la présence d'un syndrome hémorragique modéré. L'agrégation plaquettaire est anormale à l'acide arachidonique et au collagène, la réponse est réversible avec l'ADP et anormale avec un analogue de TxA2. L'agglutination avec la ristocétine est normale. La mobilisation du Ca⁺⁺ intracytoplasmique est réduite, en particulier pour des plaquettes stimulées par un analogue du TxA2. Les auteurs situent l'anomalie au niveau de l'activation de la phospholipase C à partir du récepteur du TxA2 [22].

Dans un deuxième cas, l'agrégation plaquettaire est réduite avec l'ADP, le collagène, l'acide arachidonique, le PAF, l'ionophore A23187. Le complexe GP IIb-IIIa est de taux normal. En revanche, les modifications conformationnelles induites par l'ADP et détectées avec des anticorps anti-LIBS ou le PAC-1 sont diminuées. Un défaut de phosphorylation de la pleckstrine par la protéine kinase C a été mis en évidence [23].

Un troisième cas concerne un patient avec des saignements modérés. L'agrégation plaquettaire est diminuée pour plusieurs agonistes. La fixation sur GP IIb-IIIa d'anticorps activation-dépendants est anormale après stimulation des plaquettes. L'analyse des protéines G a montré une diminution de la sous-unité Galphaq [24]. Ces types de syndromes deviennent désormais possibles à identifier par l'utilisation en immuno-empreintes d'anticorps monoclonaux dirigés contre les différentes sous-unités des protéines G, ainsi que des anticorps spécifiques des tyrosines phosphorylées.

Déficits de l'agrégation plaquettaire avec anomalies des granules

Les pathologies liées à des anomalies des granules alpha ou denses des plaquettes donnent lieu à des syndromes hémorragiques le plus souvent modérés. Très variées, ces anomalies sont souvent regroupées sous le terme storage pool disease (SPD). Leurs principales caractéristiques sont résumées dans le tableau.

Pathologies plaquettaires avec anomalies des granules alpha

Syndrome des plaquettes grises ou alphaSPD

En l'absence de connaissances plus précises des bases moléculaires conduisant à cette anomalie, le diagnostic repose sur des arguments essentiellement morphologiques [3, 4].

• Circonstances et critères de diagnostic

- La présence d'une thrombopénie et d'un syndrome hémorragique modéré se manifestant spontanément ou au cours d'intervention. La pathologie se complique progressivement d'une myélofibrose.

- L'examen morphologique des plaquettes : en absence des granules alpha, les colorations classiques de cytologie font apparaître les plaquettes grises et, de ce fait, difficiles à identifier. La plupart des plaquettes sont de grande taille.

- L'agrégation plaquettaire est le plus souvent normale mais parfois la réponse au collagène ou à la thrombine est anormale [25].

- La cytométrie en flux permet de mettre en évidence de grandes plaquettes avec une composition en GP Ib-IX normale. L'étude des cellules fixées par le paraformaldéhyde et perméabilisées montre que le fibrinogène intraplaquettaire est très diminué ainsi que les autres protéines de granules alpha.

- Un critère important permettant de différencier cette pathologie d'un PTI est l'absence d'anticorps antiplaquettes.

• Examens spécialisés

- Le déficit du pool intraplaquettaire en fibrinogène, vWF, thrombospondine et autres protéines des granules alpha est majeur. Il peut être évalué quantitativement par ELISA ou en SDS-PAGE avec ou sans immuno-empreinte.

- La microscopie électronique permet de visualiser le compartiment intracytoplasmique et les immunomarquages évaluent la présence d'éventuels granules alpha résiduels.

- L'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-P-sélectine a permis de montrer que ce constituant des membranes des granules alpha était présent mais localisé dans les membranes du SCCS des plaquettes d'un malade présentant le syndrome de plaquettes grises. Pour un autre patient la P-sélectine était abaissée.

Syndrome de Paris-Trousseau

• Clinique et biologie

Cette anomalie plaquettaire est associée à un contexte clinique plus général qui se manifeste par des anomalies du squelette et un retard mental. Il s'agit d'une thrombopénie avec très grande richesse en mégacaryocytes et granules alpha plaquettaires géants. Cette pathologie nouvellement décrite est associée à une délétion du bras long du chromosome 11 [26].

Anomalie Québec

Pathologie hémorragique congénitale à transmission autosomale dominante de découverte récente, d'abord décrite comme une anomalie du facteur V intraplaquettaire, elle est maintenant considérée comme une anomalie plus globale des granules alpha [27, 28].

• Circonstances de diagnostic et critères biologiques

- Syndrome hémorragique important essentiellement muqueux.

- Thrombopénie modérée, 100 000 plaquettes/mul environ.

- Agrégation plaquettaire anormale avec l'épinéphrine, avec toutefois, chez certains patients, des anomalies modérées observées avec d'autres agonistes.

- Déficit du contenu en granules alpha avec mise en évidence d'une protéolyse des protéines intragranulaires par SDS-PAGE et immuno-empreinte.

Une caractéristique importante de ce syndrome est l'inefficacité des transfusions plaquettaires. Les auteurs suggèrent que, en diminuant la formation du complexe prothrombinase à la surface plaquettaire, les propriétés procoagulantes produites à la surface plaquettaire y sont diminuées, ce qui aurait pour conséquence une réduction des capacités de formation de thrombus aux sites de lésions des vaisseaux [27, 28]. Toutefois ces hypothèses n'expliquent pas l'inefficacité transfusionnelle.

Pathologies plaquettaires avec déficits en granules denses ou delta-SPD

Des anomalies congénitales des granules denses appelées delta-SPD ont été décrites [3, 4]. Dans ce groupe, il faut distinguer les formes associées à un albinisme, comme c'est le cas pour le syndrome d'Hermansky-Pudlak ou encore le syndrome de Chediak-Higashi [29], et les formes isolées plus fréquentes. C'est également dans ce groupe que l'on classe les anomalies plaquettaires liées au syndrome de Wiskott-Aldrich ou la thrombopénie liée au chromosome X qui correspond à une forme incomplète de Wiskott-Aldrich [30, 31].

• Circonstances de diagnostic pour l'ensemble des delta-SPD

Bilan plaquettaire chez un patient dont le diagnostic de syndrome d'Hermansky-Pudlak, de Chediak-Higashi ou de Wiskott-Aldrich a déjà été posé. En dehors de ce contexte très particulier et peu fréquent, les examens sont entrepris pour syndrome hémorragique modéré, saignements post-chirurgicaux, allongement du temps de saignement.

• Critères de diagnostic

- Le profil d'agrégation plaquettaire est particulier avec une agrégation réversible à l'ADP même pour de fortes doses de cet agoniste, une agrégation très réduite même absente au collagène et une agrégation normale avec l'acide arachidonique (figure 1).

- Le diagnostic de delta-SPD repose sur la mise en évidence d'un déficit en granules denses ou de leur contenu, ou encore d'une anomalie de la voie de la sécrétion. Plusieurs techniques de microscopie permettent de visualiser les granules denses.

- En marquant les plaquettes avec de la mépacrine, un dérivé de la quinacrine (substance antimalarique), les granules denses peuvent être visualisés en microscopie de fluorescence. Une plaquette normale contient environ 6 à 8 granules denses. Une évaluation par cytométrie en flux de l'incorporation de mépacrine est possible. Une étude du contenu des granules denses en sérotonine et en nucléotides permet d'identifier des déficits partiels.

- Plus sophistiquée, la microscopie électronique permet de comptabiliser les granules denses. Leur opacité permet de les différencier de l'ensemble des autres constituants plaquettaires. Ils peuvent également être identifiés par leur forte affinité pour les ions d'uranyl [32].

- Quand l'anomalie concerne la sécrétion plaquettaire et non le contenu des granules, le défaut d'agrégation se manifeste uniquement aux faibles doses d'ADP, de collagène, d'épinéphrine : le syndrome hémorragique associé est alors modéré. La sécrétion plaquettaire peut être testée avec la (C¹⁴)-5-hydroxytryptamine que l'on incorpore préalablement aux plaquettes et dont on mesure la sécrétion après stimulation par différents inducteurs.

• Examens complémentaires

- Dans le syndrome d'Hermansky-Pudlak, l'identification du gène muté a été récemment effectuée [33]. Il s'agit d'un gène codant pour un polypeptide transmembranaire HPS entrant dans la composition des membranes d'organelles des mélanosomes, des granules denses et des lysosomes plaquettaires. Plusieurs mutations ont été mises en évidence dans des populations portoricaines où l'anomalie est plus fréquente qu'ailleurs. Il semblerait que, suivant le site de la mutation, il y ait des différences dans le phénotype.

- L'anomalie génétique à l'origine du syndrome de Chediak-Higashi a également été identifiée [34]. Pour que la pathologie s'exprime, le sujet doit être homozygote pour la mutation. Le gène code pour un polypeptide présentant des homologies avec une phosphoprotéine impliquée dans la régulation de la polymérisation des microtubules et également avec une protéine impliquée dans la transduction du signal régulant le trafficking intracellulaire des protéines [29].

- Dans le syndrome de Wiskott-Aldrich, l'anomalie plaquettaire caractérisée par des plaquettes de petite taille et un profil d'agrégation de type SPD est associée à un tableau clinique d'infections importantes, d'eczéma et de déficit immunitaire. La mutation se situe au niveau du gène WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein) qui code pour une protéine intracellulaire présentant des homologies de séquence avec des protéines impliquées dans la transduction de signal et dans le contrôle de l'organisation du cytosquelette. Des mutations du même gène sont trouvées dans les thrombopénies liées au chromosome X pour lesquelles seul le versant plaquettaire est anormal [30, 31].

Pathologies plaquettaires avec déficits en granules denses et alpha ou alphadelta-SPD

L'association d'anomalies des deux types de granules doit être recherchée en systématique car elle est relativement fréquente. Les granules sont généralement présents mais leurs contenus sont réduits. Le profil plaquettaire ressemble essentiellement aux delta-SPD [3].

Thrombopénies et plaquettes géantes

Dans ce groupe de pathologies, la confusion de diagnostic avec les purpuras thrombopéniques idiopathiques est très fréquente. Le diagnostic est souvent évoqué à la suite de l'inefficacité de la perfusion d'IgG polyspécifiques ou d'une splénectomie. Une des clés du diagnostic repose sur la mise en évidence de plaquettes géantes, qui ne présentent pas de déficit en GP Ib, comme c'est le cas dans le syndrome de Bernard-Soulier [35].

May-Hegglin

C'est une pathologie de transmission héréditaire autosomale dominante. Les patients atteints de cette pathologie ne présentent qu'exceptionnellement un syndrome hémorragique.

• Circonstances et critères de diagnostic

- Découverte d'une thrombopénie dans le cadre d'une enquête familiale, ou plus rarement au cours de syndromes hémorragiques qui apparaissent surtout en postopératoire.

- La thrombopénie est franche, on trouve des plaquettes géantes et des inclusions au niveau des leucocytes qui présentent un aspect morphologique après coloration classique en cytologie proche de celui des corps de Döhle. Les fonctions plaquettaires sont normales et la recherche d'anticorps antiplaquettes, importante dans ce contexte, est négative.

• Examens supplémentaires

La durée de vie des plaquettes et la richesse médullaire en mégacaryocytes sont normales.

Syndrome d'Epstein

L'anomalie plaquettaire correspondant à cette dénomination est associée à une néphropathie (syndrome d'Alport) et à une surdité de transmission [36]. Les plaquettes sont géantes, la thrombopénie est franche, souvent moins de 50 000/mul et atteignant parfois des valeurs plus basses que 20 000/mul. La transmission est autosomale dominante. Plusieurs cas de familles présentant ces associations ont été rapportés. La difficulté de diagnostic résulte dans le fait que la triade néphropathie, thrombopathie, surdité n'est pas toujours complète. En particulier, la pathologie rénale est souvent d'apparition retardée par rapport aux autres éléments.

• Circonstance de diagnostic

Il peut s'agir de la découverte d'une thrombopénie, avec mise en évidence de plaquettes géantes ou d'un bilan plaquettaire sur diagnostic de PTI réfractaire aux traitements ; il n'est pas rare que le diagnostic ne soit envisagé qu'après splénectomie. Le diagnostic peut être effectué dans le cadre d'une enquête familiale.

• Critères de diagnostic

- Même si pour le syndrome d'Alport une mutation a été décrite au niveau du collagène IV (chaîne alpha5) [37], l'anomalie génétique à l'origine de cette triade n'est pas encore identifiée. En l'absence de ce critère, le diagnostic repose sur la description phénotypique.

- L'agrégation peut être normale ou diminuée, dans ce cas souvent avec tous les inducteurs.

- Parfois on note la présence d'inclusions dans le cytoplasme des leucocytes de morphologie proche de celle des corps de Döhle.

Syndrome de Montréal et syndrome des plaquettes Swiss-cheese

Ce sont deux autres exemples de pathologies héréditaires caractérisées par une thrombopénie sévère et des plaquettes géantes. La transmission se fait sur un mode autosomal dominant. Pour le syndrome de Montréal, une agrégation spontanée est visible sur les frottis sanguins. Une anomalie au niveau de la calpaïne, protéase calcium-dépendante, a été mise en évidence [38]. Le diagnostic de ces anomalies repose en premier lieu sur les études de microscopie électronique avec, pour le syndrome Swiss-cheese, la présence de grosses vacuoles.

L'absence d'anticorps antiplaquettes est un élément important du diagnostic.

Thrombopénies et hyperagglutination des plaquettes avec la ristocétine

Pseudo von Willebrand

Les multimères de plus haut poids moléculaires de vWF interagissent de manière spontanée avec GP Ibalpha, qui présente une mutation au niveau de sa partie N-terminale. De ce fait, les multimères sont déficients dans le plasma car ils se fixent sur les plaquettes [39]. Cette pathologie est à différencier de la maladie de Willebrand type 2B où le vWF est anormal. La thrombopénie associée est liée à l'élimination de plaquettes ayant fixé le vWF.

• Circonstances de découverte

Le syndrome hémorragique est fréquent, parfois important. C'est la découverte d'une thrombopénie qui peut représenter le signe d'appel. L'anomalie peut aussi être découverte dans le cadre d'une enquête familiale.

• Critères de diagnostic

- Il existe une diminution du co-facteur de la ristocétine (vWF RCo) plus importante que celle trouvée par dosage immunologique (vWF Ag).

- Le test de RIPA (ristocetin-induced platelet agglutination) est anormal, des concentrations aussi faibles que 0,3 mg/ml de ristocétine induisant l'agglutination de plaquettes en PRP.

- La maladie de Willebrand 2B a une fréquence plus importante que le pseudo von Willebrand. Le diagnostic différentiel entre ces deux pathologies nécessite des épreuves croisées de mélange de plasma et de plaquettes. Les résultats ne sont pas toujours concluants.

- Les études par cytométrie en flux du complexe GP Ib-V-IX sont à mettre en œuvre. La biologie moléculaire avec mise en évidence de mutations au niveau de GP Ibalpha permet d'affirmer le diagnostic.

Aucune anomalie de l'agrégation plaquettaire Consommation de prothrombine anormale

Syndrome de Scott

Cette pathologie est excessivement rare. Seulement deux familles ont été décrites [40]. Ce type d'anomalie de transmission autosomale récessive constitue une liaison entre les désordres plaquettaires et ceux de la coagulation. Elle se caractérise par une anomalie d'exposition des phospholipides à la surface plaquettaire, conduisant à un défaut d'activation de la coagulation plasmatique. Plus récemment, il a été montré que ces plaquettes ne pouvaient pas générer de microparticules. L'anomalie moléculaire à l'origine de ce phénotype n'est toujours pas identifiée, mais un défaut de l'activation de la scramblase, enzyme impliquée dans le transport de la phosphatidylsérine vers la surface plaquettaire, est suggéré. L'anomalie n'est pas spécifique aux plaquettes : il a été montré qu'elle touche aussi la vésiculation des autres cellules dont les globules rouges. Le test le plus simple permettant d'orienter les investigations dans le sens de cette anomalie est la mesure de la consommation de prothombine qui est toujours diminuée. Les fonctions d'agrégation des plaquettes sont normales ainsi que leur morphologie. Le temps de saignement est normal. La cytométrie en flux permet une évaluation des capacités des plaquettes à former des microvésicules et à changer de taille après stimulation par le ionophore A23187 ou un mélange collagène-thrombine. Par ailleurs, l'utilisation de l'annexine V conjuguée au FITC, sonde des aminophospholipides, permet une évaluation de l'expression d'une surface procoagulante en cytométrie en flux.

Stratégie d'exploration plaquettaire

Nouveaux appareils d'exploration des fonctions plaquettaires

Actuellement, on assiste au développement de nouveaux appareils qui sont proposés pour la détection d'anomalies des fonctions plaquettaires à partir de sang total. Le PFA-100 (Dade-Behring) utilise des cartouches contenant des membranes revêtues de collagène, imprégnées d'ADP ou d'épinéphrine. Ces membranes comportent une ouverture qui va être obstruée par des agrégats plaquettaires au cours de l'aspiration du sang. Le temps d'occlusion est mesuré et renseigne sur la fonction plaquettaire. Ce système est particulièrement sensible aux déficits en facteur von Willebrand et en GP IIb-IIIa  : en effet, l'agrégat est formé en présence de forces de cisaillement élevées, conditions qui favorisent la fixation de vWF à cette intégrine. L'expertise progressive multicentrique de cet appareil permettra d'apprécier les avantages et les limites de ce nouveau système d'investigation de l'hémostase primaire très intéressant.

Un autre test est proposé par Medtronic : il s'agit de l'hémoSTATUS. Dans ce cas, les cartouches testent la formation d'un caillot de fibrine : c'est l'ACT (activated clotting time) qui est mesuré. Les cartouches contiennent du kaolin et, pour certaines d'entre elles, du PAF en concentration croissante. Ce test a été proposé pour le suivi des fonctions plaquettaires au cours des circulations extracorporelles. Il est encore peu utilisé. Les anomalies de fibrinogène et du récepteur GP IIb-IIIa sont détectées, mais l'appareil est peu sensible aux déficits en facteur von Willebrand.

Progressivement, le temps de saignement devrait laisser la place à des tests plus conformes aux capacités technologiques de notre époque.

Bilan d'exploration des thrombopathies de première intention

La notion de saignements muqueux dans un contexte de bilan de coagulation normal entraîne la mise en route d'un bilan plaquettaire. La numération des plaquettes associée à l'étude de l'agrégation plaquettaire et de leur taille, au dosage du vWF plasmatique et, dans le cas de thrombopénie, à la recherche d'anticorps antiplaquettes constitue la première démarche vers l'identification de la majorité des thrombopathies. La facilité d'associer à ce bilan un test en consommation de prothrombine permet de ne pas ignorer une anomalie de l'expression de l'activité coagulante.

Cytométrie en flux et biologie moléculaire

Le développement des explorations en cytométrie en flux permet des diagnostics précis pour un grand nombre de pathologies détectées avec les examens précédents. Les premiers anticorps à utiliser pour le screening sont ceux reconnaissant les principales glycoprotéines (GP IIb-IIIa, GP Ib-IX-V et GP Ia-IIa par exemple) [8, 41]. Après activation par l'ADP, les capacités fonctionnelles de GP IIb-IIIa sont examinées en utilisant des anticorps activation-dépendants [41]. La sécrétion plaquettaire peut être évaluée par des anticorps anti-P-sélectine, anti-granu-
lophysine ou anti-TSP par exemple. Les granules denses sont évalués par la mépacrine. La perméabilisation des cellules permet l'accès des anticorps aux structures intraplaquettaires. L'utilisation de l'annexine V permet d'évaluer les capacités de formation des microvésicules. Ces études simples et rapides permettent de cerner la plupart des thrombopathies rencontrées. La biologie moléculaire est maintenant accessible pour les principales glycoprotéines où un screening rapide du gène est possible grâce au développement des techniques comme la PCR-SCCP [6]. La mise en évidence de la mutation permet les études de transmission familiale.

REFERENCES

1. Nurden AT, Ruan J, Nurden P. L'intégrine alpha_IIbbeta₃ : de la biologie cellulaire aux médicaments antithrombotiques. Hématologie 1997; 3 : 407-15.

2. Nurden AT, Nurden P. A review of the role of platelet membrane glycoproteins in the platelet-vessel wall interaction. Ballières Clin Haematol 1993 ; 6 : 653-90.

3. Bellucci S, Tobelem G, Caen J. Inherited platelet disorders. Prog Hematol 1983 ; 13 : 223-63.

4. George JN, Nurden AT, Phillips DR. Molecular defects in interaction of platelets with the vessel wall. N Engl J Med 1984 ; 311 : 1084-98.

5. George JN, Caen JP, Nurden AT. Glanzmann's thrombasthenia : the spectrum of clinical disease. Blood 1990 ; 75 : 1383-95.

6. Bray P. Inherited diseases of platelet glycoproteins : considerations for rapid molecular characterization. Thromb Haemost 1994 ; 72 : 492-502.

7. Michelson AD. Flow cytometry  : a clinical test of platelet function. Blood 1996 ; 87 : 4925-36.

8. Nurden P. Bidirectional trafficking of membrane glycoproteins following platelet activation in suspension. Thromb Haemost 1997 ; 78 : 1305-15.

9. Nurden P, Savi P, Heilmann E, Bihour C, Herbert JM, Maffrand JP, Nurden AT. An inherited bleeding disorder linked to a defective interaction between ADP and its receptor on platelets. Its influence on glycoprotein IIb-IIIa complex function. J Clin Invest 1995 ; 95 : 1612-22.

10. Bernard J, Soulier JP. Sur une nouvelle variété de dystrophie thrombocytaire hémorragipare congénitale. Sem Hop Paris 1948 ; 24 : 3217-23.

11. De la Salle C, Lanza F, Cazenave JP. Biochemical and molecular basis of Bernard-Soulier syndrome  : a review. Nouv Rev Fr Hematol 1995 ; 37 : 215-22.

12. Yamamoto N, Ikeda H, Tandon NN, Herman J, Tomiyama Y, Mitani T, Sekiguchi S, Lipsky R, Kralisz U, Jamieson GA. A platelet membrane glycoprotein (GP) deficiency in healthy blood donors : Nak^a- platelets lack detectable GP IV (CD 36). Blood 1990 ; 76 : 1698-703.

13. Moroi M, Jung SM, Okuma M, Shinmyozu K. A patient with platelets deficient in glycoprotein VI that lack both collagen-induced aggregation and adhesion. J Clin Invest 1989 ; 84 : 1440-5.

14. Jandrot-Perrus M, Lagrue AH, Okuma M, Bon C. Adhesion and activation of human platelets induced by convulxin involve glycoprotein VI and integrin alpha2beta1. J Biol Chem 1997 ; 272 : 27035-41.

15. Nieuwenhuis HK, Akkerman JWN, Houdijk WPM, Sixma JJ. Human blood platelets showing no response to collagen fail to express surface glycoprotein Ia. Nature 1985  ; 318 : 470-2.

16. Kunicki TJ, Kritzik M, Annis DS, Nugent DJ. Hereditary variation in platelet integrin alpha 2 beta 1 density is associated with two silent polymorphisms in the alpha 2 gene coding sequence. Blood 1997 ; 89 : 1939-43.

17. Cattaneo M, Lecchi A, Randi M, McGregor JL, Mannuci PM. Identification of a new congenital defect of platelet function characterized by severe impairment of platelet responses to adenosine diphosphate. Blood 1992 ; 80 : 2787-96.

18. Hirata T, Ushikubi F, Kakizuka A, Okuma M, Narumiya S. Two thromboxane A2 receptor isoforms in human platelets. Opposite coupling to adenylyl cyclase with different sensitivity to Arg⁶⁰ to Leu mutation. J Clin Invest 1996 ; 97 : 949-56.

19. Tamponi G, Pannocchia A, Arduibo C, Bazzan M, Dora ND, Schinco P, Buraglio M, Eandi M. Congenital deficiency of alpha-2-adrenoceptors on human platelets : description of two cases. Thromb Haemost 1987 ; 58 : 1012-6.

20. Malmsten C, Hamberg M, Svensson J, Samuelsson B. Physiological role of an endoperoxide in human platelets : hemostatic defect due to platelet cyclo-oxygenase deficiency. Proc Natl Acad Sci USA 1975 ; 72 : 1446-50.

21. Defreyn G, Machin SJ, Carreras LO, Dauden MV, Chamone DAF, Vermylen J. Familial bleeding tendency with partial platelet thromboxane synthetase deficiency : reorientation of cyclic endoperoxide metabolism. Br J Haemat 1981 ; 49 : 29-41.

22. Fuse I, Mito M, Hattori A, Higuchi W, Shibata A, Ushikubi F, Okuma M, Yahata K. Defective signal transduction induced by thromboxane A2 in a patient with a mild bleeding disorder : impaired phospholipase C activation despite normal phospholipase A2 activation. Blood 1993 ; 81 : 994-1000.

23. Gabbeta J, Yang X, Sun L, McLane MA, Niewiarowski S, Rao AK. Abnormal inside-out signal transduction-dependant activation of glycoprotein IIb-IIIa in a patient with impaired plekstrin phosphorylation. Blood 1996 ; 87 : 1368-76.

24. Gabbeta J, Yang X, Kowalska MA, Sun L, Dhanasekaran N, Rao AK. Platelet signal transduction defect with Galpha subunit dysfunction and diminished Galphaq in a patient with abnormal platelet responses. Proc Natl Acad Sci USA 1997 ; 94 : 8750-5.

25. Levy-Toledano S, Caen JP, Breton-Gorius J, Rendu F, Cywiner-Golenzer C, Dupuy E, Legrand Y, Maclouf J. Gray platelet syndrome : alpha-granule deficiency. Its influence on platelet function. J Lab Clin Med 1981 ; 98 : 831-48.

26. Breton-Gorius J, Favier R, Guichard J, Cherif D, Berger R, Debili N, Vainchenker W, Douay L. A new congenital dysmegakaryopoietic thrombocytopenia (Paris-Trousseau) associated with giant platelet alpha-granules and chromosome 11 deletion at 11q23. Blood 1995 ; 85 : 1805-14.

27. Hayward CPM, Cramer EM, Kane WH, Zheng S, Bouchard M, Masse JM, Rivard GE. Studies of a second family with the Quebec platelet disorder : evidence that the degradation of the alpha-granule membrane and its soluble contents are not secondary to a defect in targeting proteins to alpha-granules. Blood 1997  ; 89 : 1243-53.

28. Hayward CPM. Inherited disorders of platelet alpha-granules. Platelets 1997 ; 8 : 197-209.

29. Ramsay M. Protein trafficking violations. Nature Genetics 1996 ; 14 : 242-5.

30. Zhu Q, Zhang M, Blaese RM, Derry JMJ, Junker A, Francke U, Chen SH, Ochs HD. The Wiskott-Aldrich syndrome and X-linked congenital thrombocytopenia are caused by mutations of the same gene. Blood 1995 ; 86 : 3797-804.

31. Gallego MD, Santamaria M, Pena J, Molina IJ. Defective actin reorganization and polymerization of Wiskott-Aldrich T cells in response to CD3-mediate stimulation. Blood 1997 ; 90 : 3089-97.

32. Richards JG, Da Prada M. Uranaffin reaction : a new cytochemical technique for the localization of adenine nucleotides in organelles storing biogenic amines. J Histochem Cytochem 1977 ; 25 : 1322-36.

33. Oh J, Bailin T, Fukai K, Feng GH, Ho L, Mao JI, Frenk E, Tamura N, Spritz RA. Positional cloning of a gene for Hermansky-Pudlak syndrome, a disorder of cytoplasmic organelles. Nature Genetics 1996 ; 14 : 300-6.

34. Nagle D, Karim MA, Woolf EA, Holmgren L, Bork P, Misumi DJ, McGrail SH, Dussault BJ, Perou CM, Boissy RE, Duyk GM, Spritz RA, Moore KJ. Identification and mutation analysis of the complete gene for Chediak-Higashi syndrome. Nature Genetics 1996 ; 14 : 307-11.

35. Nurden P. Nurden AT. Pathologies plaquettaire héréditaires. In : Sampol J, Arnoux D, Boutière B eds. Manuel d'hémostase. OPTION /BIO 1995 : 277-310.

36. Epstein CJ, Sahud MA, Piel CF, Goodman JR, Bernfield MR, Kushner JH, Ablin AR. Hereditary macrothrombocytopathia, nephritis and deafness. Am J Med 1972 ; 52 : 299-310.

37. Knebelmann B, Forestier L, Drouot L, Quinones S, Chuet C, Benessy F, Saus J, Antignac C. Slice-mediated insertion of an Alu sequence in the COLA4A3 mRNA causing autosomal recessive Alport syndrome. Hum Mol Genet 1995 ; 4 : 675-9.

38. Okita JR, Frojmovic MM, Kristopeit S, Wong T, Kunicki TJ. Montreal platelet syndrome : a defect in calcium-activated neutral proteinase (calpain). Blood 1989 ; 74 : 715-21.

39. Russel SD, Roth GJ. Pseudo-von Willebrand disease : a mutation in the platelet glycoprotein Ibalpha gene associated with a hyperactive surface receptor. Blood 1993 ; 81  : 1787-91.

40. Satta N, Toti F, Fressinaud E, Meyer D, Freyssinet JM. Scott syndrome : an inherited defect of the procoagulant activity of platelets. Platelets 1997 ; 8 : 117-24.

41. Nurden P, Durrieu-Jaïs C, Nurden A. Applications cliniques actuelles d'une activation plaquettaire par cytométrie en flux. Sang Thromb Vaiss 1997 ; 9 : 441-8.