Evolution of Friend erythroleukemia : a highly integrated process ?

ARTICLE

L'évolution tumorale dépend de l'action additive ou coopérative des oncogènes et de l'inactivation des gènes suppresseurs de tumeur. L'érythroleucémie induite par le virus de Friend est un remarquable exemple d'un processus oncogénique multi-étape dans lequel plusieurs acteurs moléculaires ont été clairement identifiés. La compréhension des mécanismes mis en jeu dans un processus biologique aussi complexe requiert le développement de systèmes cellulaires permettant une étude génétique des composantes impliquées. Nous présentons ici une revue de certains aspects de l'érythroleucémie de Friend. Nous décrivons aussi l'adaptation d'un système biologique, initialement mis au point pour l'étude de la coopération entre les gènes codant les versions oncogéniques du récepteur à l'EGF/TGFalpha (v-erbB) et du récepteur nucléaire de l'hormone thyroïdienne (v-erbA), pour étudier l'action et la coopération éventuelle des altérations moléculaires caractéristiques des érythroleucémies de Friend.

Pathologie et aspects cellulaires de la leucémie de Friend

En 1957, C. Friend a décrit un isolat viral, maintenant appelé FV-A [1] capable d'induire une érythroleucémie chez la souris adulte. La maladie induite par cet isolat original est caractérisée par une hépato-splénomégalie résultant de l'hyperplasie du compartiment érythroïde, une anémie sévère et la présence d'érythroblastes (cellules de Friend) dans le sang. Un isolat dérivé de FV-A, appelé FV-P, induit aussi une splénomégalie rapide qui est associée à une polycythémie plutôt qu'une anémie [2]. Enfin, le RLV (Rauscher leukemia virus) induit une érythroleucémie très semblable à celle induite par FV-A [3].

En plus de leurs effets distincts sur la différenciation des érythroblastes spléniques, les maladies induites par FV-A et FV-P se distinguent par leur réponse à l'érythropoïétine (Epo). En effet, l'anémie induite par FV-A et la survie des animaux infectés sont sensibles à la présence d'Epo alors que la maladie induite par FV-P est largement insensible à cette cytokine (revue in [4-6]). La différence de sensibilité à l'Epo des érythroblastes FV-A et FV-P est également observée ex vivo. Les cellules spléniques des souris infectées depuis quelques jours par FV-P sont capables de former des colonies de 32-64 cellules différenciées en absence d'Epo. En revanche, les cellules spléniques des animaux infectés par FV-A ne forment des colonies érythroïdes qu'en présence d'Epo exogène. De même, les colonies érythroïdes obtenues in vitro après l'infection de cellules de moelle osseuse de souris adultes par FV-P ou FV-A montrent une réponse différente à l'Epo [7, 8]. L'infection par FV-P induit la formation de colonies de cellules différenciées en absence d'Epo exogène tandis que l'infection par FV-A génère des colonies composées de cellules partiellement immatures. L'addition d'Epo exogène n'induit qu'un doublement du nombre de colonies induites par FV-P alors qu'elle provoque une augmentation considérable du nombre des colonies formées par FV-A ainsi que leur différenciation en érythrocytes. Il apparaît donc que, in vivo et in vitro, les érythroblastes infectés par FV-P, contrairement aux érythroblastes FV-A, sont largement indépendants de la présence d'Epo pour leur différenciation terminale. Ces propriétés, associées au fait que les érythroblastes présents dans la rate des animaux au cours des trois premières semaines qui suivent l'infection par le virus de Friend sont incapables d'être transplantés chez un hôte syngénique, indiquent que ces cellules ont une capacité d'autorenouvellement limitée.

En revanche, les mêmes analyses, effectuées plus tardivement, révèlent l'émergence de clones de cellules leucémiques capables de former des colonies érythroblastiques de plus de 10⁵ cellules en absence d'Epo exogène, de s'établir en lignées cellulaires immortalisées (lignées de Friend) et d'être transplantées in vivo [9]. L'évolution des érythroleucémies induites par FV-A et FV-P paraît donc impliquer au moins deux étapes (tableau I) : une phase précoce (préleucémique), caractérisée par une hyperplasie du compartiment érythroïde, et une phase tardive, caractérisée par l'émergence d'érythroblastes dotés d'une capacité d'autorenouvellement importante et bloqués dans leur différenciation (revue in [4-6]).

Aspects moléculaires de la leucémie de Friend

Les isolats FV-A et FV-P sont composés d'un rétrovirus défectif pour sa réplication, le SFFV (spleen focus forming virus) et d'un virus auxiliaire, le F-MuLV (friend murine leukemia virus). Le pouvoir pathogène du complexe de Friend provient du SFFV, puisque ce dernier, en l'absence du virus auxiliaire F-MuLV, est capable à lui seul d'induire une érythroleucémie [10, 11]. Le génome des virus SFFV-A et SFFV-P ne possède pas de séquences apparentées aux proto-oncogènes cellulaires. Il contient cependant un gène codant pour une glycoprotéine d'enveloppe (env) de 55 kD (gp55) qui résulte de la fusion de la région 5' du gène env d'un virus endogène murin et de la région 3' d'une forme mutée du gène env du F-MuLV (revue in [12])

La phase préleucémique de la maladie de Friend est la conséquence directe de l'expression de la gp55. En effet, certaines mutations affectant le gène env des SFFV entraînent la perte de son pouvoir leucémogène [13]. D'une part, le potentiel mitogénique de gp55 a été directement montré par différentes approches expérimentales. Par exemple, l'expression d'un transgène codant gp55(P) chez la souris mime la phase précoce de la leucémie de Friend induite par FV-P [14]. D'autre part, l'expression de gp55(P) ou de gp55(A) dans des progéniteurs érythroïdes primaires murins modifie le contrôle normal de leur prolifération et de leur différenciation [7]. Enfin, dans des lignées hématopoïétiques non érythroïdes, la co-expression du récepteur à l'érythropoïétine murin (EpoR) et de gp55(P) induit leur prolifération alors que l'expression de l'une ou de l'autre de ces protéines est sans effet [15]. Certaines des bases moléculaires des propriétés des gp55 sont connues. La glycoprotéine gp55(P) ainsi que la gp55(A) codée par RLV se lient directement à EpoR. Des travaux récents indiquent que l'expression de gp55(A) ou gp55(P) induit la formation de CFU-E dans les cellules de foie fœtal provenant de souris EpoR^+/+ mais pas dans celles issues d'animaux présentant l'inactivation du gène codant EpoR [8]. Les effets des gp55 dérivent donc de leur interaction avec EpoR. Le complexe gp55(P)/EpoR active certaines des voies de signalisation normalement induites en réponse à la liaison de l'Epo à son récepteur mais présente aussi des différences qualitatives importantes dans la manière dont il se couple aux signaux situés en aval [16]. Bien que des différences aient été mises en évidence quant aux facteurs STAT activés dans les cellules préleucémiques FV-A et FV-P [16, 18], les mécanismes moléculaires précis sous-tendant les propriétés distinctes des différentes gp55 restent à identifier. Il est à noter aussi que la localisation subcellulaire des complexes gp55(P)/EpoR et gp55(A)/EpoR est distincte, ce qui pourrait expliquer les réponses biologiques différentes induites par les virus FV-P et FV-A/RLV [15, 17].

La phase tardive de la maladie de Friend est caractérisée, au niveau moléculaire, par au moins deux altérations génétiques récurrentes (tableau I). L'analyse des sites d'intégration du provirus SFFV dans les cellules leucémiques primaires et les lignées de Friend FV-A et FV-P a permis de montrer que le provirus SFFV s'intègre, dans 95 % des cas, au locus spi-1 (SFFV provirus integration site 1) et active l'expression de spi-1 [19, 20]. Ce gène code pour PU.1/Spi-1, un facteur de transcription de la famille ETS [21]. C'est la forme sauvage de ce facteur qui est exprimée dans les lignées de Friend [22]. Par ailleurs, l'analyse de ces lignées a montré la perte fréquente de la fonction du gène suppresseur de tumeur p53 soit par délétion, soit par mutation dans des domaines de la protéine p53 essentiels à son activité (revue in [5]). Les altérations du gène p53 ont été initialement caractérisées dans les lignées de Friend établies en culture. Il est clair cependant que ces altérations existent dans la rate et le foie des animaux infectés par le complexe viral de Friend et sont associées à l'émergence des clones leucémiques [23].

L'activation anormale de EpoR, la surexpression de Spi-1 et la perte de fonction de p53 sont des événements récurrents de la leucémie de Friend, ce qui suggère que chacun d'entre eux est important dans l'évolution de la maladie. Plusieurs approches expérimentales ont été utilisées pour tenter de définir le rôle de ces altérations dans la transformation érythroblastique. Ces expériences ont fait appel soit à des lignées cellulaires qui contiennent des altérations génétiques inconnues (notamment celles qui participent à leur immortalisation), soit à des systèmes biologiques plus complexes dans lesquels le rôle intrinsèque de l'altération étudiée ne peut être séparé de l'influence potentielle des cellules environnantes.

Spi-1

L'utilisation de lignées de Friend établies in vitro a permis notamment de montrer que ces cellules expriment fortement Spi-1/PU.1 et que l'induction de leur différenciation partielle par le DMSO est accompagnée de la baisse d'expression de cette protéine. Ces expériences suggéraient donc un rôle de Spi-1 dans l'inhibition de la différenciation de ces cellules [24]. En outre, l'étude de la surexpression de Spi-1/PU.1 dans les cultures à long terme de cellules de moelle osseuse de souris - dont la prolifération est dépendante de la présence de cellules stromales - a suggéré un rôle de Spi-1 dans l'immortalisation des érythroblastes [25]. Enfin, l'analyse de souris portant un transgène Spi-1 sous le contrôle de la LTR du SFFV montre que les animaux dérivés d'une lignée exprimant de hauts taux de Spi-1 développent avec une fréquence de l'ordre de 50 % une érythroleucémie dépendante de l'Epo au bout de plusieurs mois [26]. Cette leucémie peut évoluer, après hypertransfusion des animaux, vers une leucémie indépendante de l'Epo.

p53

L'infection par FV-P de souris exprimant un transgène codant une protéine p53 mutée induit une érythroleucémie avec une cinétique accélérée par rapport à celle observée après infection de leurs congénères non transgéniques [27]. De plus, la surexpression d'une protéine p53 sauvage dans des lignées de Friend induit l'inhibition de leur prolifération associée à de l'apoptose et à leur différenciation partielle [28]. Ces expériences indiquent que l'absence de p53 contribue à la dérégulation du contrôle de la survie et de la prolifération de ces lignées et que la perte de fonction sauvage de p53 favorise l'évolution de l'érythroleucémie de Friend.

Les altérations moléculaires de la leucémie de Friend coopèrent pour déréguler la réponse des érythroblastes à l'Epo et au SCF

Les approches expérimentales décrites jusqu'ici ne tiennent généralement pas compte du fait que les altérations génétiques qui caractérisent la phase leucémique de la maladie de Friend sont toujours précédées par la dérégulation de la signalisation normale de EpoR par son interaction avec gp55. Cette situation suggère qu'une relation obligée pourrait exister entre l'activation anormale de EpoR et les événements intracellulaires affectés par la dérégulation de l'expression de Spi-1 et/ou la perte de la fonction normale de p53.

Afin d'analyser cette hypothèse, nous avons utilisé un système hétérologue d'érythroblastes primaires aviaires en culture [29]. Ce système permet une étude clonale des contributions intrinsèques de chacune de ces altérations moléculaires sur la survie, la prolifération et la différenciation des érythroblastes. Son caractère hétérologue permet, en outre, une étude de la coopération éventuelle entre Spi-1, une forme mutée de p53 et les signaux spécifiques émanant des formes activées de EpoR.

Le système biologique

Plusieurs types de progéniteurs érythroïdes ont été décrits chez la poule (revue in [30]). Des clones d'érythroblastes peuvent être spécifiquement obtenus par l'expression dans les cellules de moelle osseuse d'un transgène codant une version thermosensible de la protéine tyrosine kinase ts-Sea [29]. À la température permissive (37 °C), ces érythroblastes peuvent être amplifiés pendant 30 à 40 générations, période au-delà de laquelle ces cellules entrent invariablement en sénescence et meurent. Il n'existe donc pas, dans ce système, d'interférence avec les voies qui mènent à l'immortalisation. L'inactivation de la tyrosine kinase ts-Sea à 42 °C (température non permissive) induit la mort de ces érythroblastes par apoptose. En revanche, en présence de sérum de poule anémique comme source d'Epo aviaire, ces cellules se comportent comme des érythroblastes normaux : elles survivent et se différencient de façon synchrone en érythrocytes indistinguables des érythrocytes sanguins.

De la même manière, l'expression exogène du récepteur murin à l'érythropoïétine permet à ces cellules de survivre en réponse à de l'Epo recombinante humaine (hEpo) et de s'engager dans le programme normal de la différenciation érythroïde [31, 32]. L'exécution de ce programme dépend absolument de la présence d'Epo, la cytokine essentielle à cette voie de différenciation (figure 1 et [33]). De plus, l'Epo humaine étant sans effet sur les érythroblastes de poule, ce système est donc particulièrement intéressant car il permet d'analyser les conséquences de l'expression soit de EpoR, soit de versions mutées de ce récepteur, sans qu'il y ait d'interférence avec le récepteur à l'érythropoïétine endogène.

L'expression de Spi-1 dérégule la réponse des érythroblastes à hEpo

Afin de mimer l'activation anormale de EpoR par la gp55 dans les progéniteurs ts-Sea, nous avons exprimé dans ces cellules un mutant de ce récepteur, EpoR(R129C). Ce mutant est caractérisé par la substitution du résidu arginine 129 dans son domaine extracellulaire par une cystéine, conduisant à sa dimérisation constitutive [34]. L'expression de EpoR(R129C), comme celle du complexe EpoR/gp55(P), induit l'indépendance de certaines lignées cellulaires non érythroïdes vis-à-vis des cytokines mitogéniques. Cette situation est souvent décrite comme reflétant une activation constitutive de EpoR. Il est à noter cependant que cette propriété ne concerne qu'une infime fraction des cellules exprimant ces protéines et dépend donc d'un processus de sélection non caractérisé [8]. En outre, la co-expression de EpoR et de gp55(A) dans ces lignées cellulaires n'induit pas leur indépendance vis-à-vis des cytokines. En absence d'informations plus précises quant à leur mode d'action moléculaire, nous considérons ces formes activées de EpoR comme des formes anormales plutôt que constitutives. Cette notion est en accord avec des résultats récents qui montrent l'activation constitutive de JAK1 dans les cellules préleucémiques FV-P, alors que la stimulation des érythroblastes normaux par l'Epo induit l'activation transitoire de JAK2 [16]. Les cellules préleucémiques FV-P restent sensibles à l'Epo puisqu'elles ne présentent une activation décelable de la liaison de STAT5 à l'ADN qu'en réponse à l'Epo. L'expression de EpoR(R129C), comme celle de gp55(A) ou de gp55(P), induit la prolifération transitoire et la différenciation de certains progéniteurs érythroïdes en absence de l'ajout d'Epo exogène [7, 8, 35]. Ces expériences étant réalisées en présence de fortes concentrations de sérum, il est impossible de conclure quant à la dépendance de ces réponses vis-à-vis de l'Epo endogène au sérum. En tout état de cause, l'expression de EpoR(R129C) chez la souris induit une érythrocytose semblable à celle induite par SFFV lors de la phase préleucémique de la maladie de Friend et mime donc les conséquences de la liaison de la gp55 à EpoR [34]. L'expression de EpoR(R129C) dans les érythroblastes ts-Sea, de façon relativement similaire à celle de EpoR, induit une différenciation terminale de ces cellules en réponse à hEpo. En effet, dans ces conditions, ces cellules sortent du cycle cellulaire, accumulent de hauts taux d'hémoglobine et acquièrent la morphologie d'érythrocytes (figure 2 et [32]).

Les altérations génétiques caractérisant les cellules leucémiques de Friend interviennent dans les érythroblastes dans lesquels EpoR est activé par la liaison de la gp55. Nous avons dès lors analysé les conséquences de la co-expression de EpoR(R129C) soit avec Spi-1, soit avec un mutant de p53, p53(V135A), sur la réponse des érythroblastes primaires à hEpo.

L'expression de p53(V135A) n'altère pas la capacité des érythroblastes EpoR(R129C) à se différencier en phase finale
(figure 2 et [32]). Comme les érythroblastes contrôles, ces cellules acquièrent la morphologie d'érythrocytes et accumulent de l'hémoglobine en réponse à hEpo, mais meurent par apoptose en absence de hEpo. L'expression d'un mutant de p53 n'altère donc pas la régulation normale de la survie et de la différenciation des érythroblastes primaires.

En revanche, l'expression de Spi-1 modifie profondément la réponse des érythroblastes EpoR(R129C) à hEpo. Premièrement, Spi-1 inhibe le programme de différenciation normalement induit dans ces cellules en réponse à hEpo. En effet, contrairement aux érythroblastes EpoR(R129C), les cellules EpoR(R129C)/Spi-1 conservent une morphologie immature et n'accumulent que peu d'hémoglobine en réponse à hEpo. Le deuxième phénotype induit par l'expression de Spi-1 est une forte inhibition de l'apoptose normalement induite dans ces cellules en réponse à la privation de hEpo
(figure 2 et [32]). Au niveau moléculaire, cette survie accrue apparaît liée à la dérégulation de l'expression du gène bcl2. En effet, contrairement aux érythroblastes EpoR(R129C) qui n'expriment bcl2 qu'en réponse à hEpo, les érythroblastes EpoR(R129C)/Spi-1 expriment bcl2 de façon constitutive (tableau II). Des résultats préliminaires indiquent que cette expression constitutive pourrait résulter de la dérégulation directe du gène bcl2 par Spi-1 ; Bcl2 étant une protéine essentiellement impliquée dans l'inhibition de l'apoptose cellulaire [36], l'inhibition de la différenciation imposée par Spi-1 dépend donc très vraisemblablement d'autres cibles moléculaires. Celles-ci pourraient être des gènes jouant un rôle central dans la différenciation érythroïde et dont l'expression serait dérégulée par Spi-1 soit au niveau transcriptionnel, soit au niveau post-transcriptionnel. Alternativement, Spi-1 paraît interagir avec d'autres régulateurs transcriptionnels dont certains ont un rôle connu dans la maturation des progéniteurs érythroïdes [37, 38]. Tout ou partie des propriétés oncogéniques de Spi-1 pourrait dépendre de ces interactions.

L'expression d'une p53 mutée coopère avec Spi-1

L'expression d'une p53 mutée est insuffisante pour altérer de façon décelable la réponse des érythroblastes EpoR(R129C) à hEpo. Cependant, la fréquence des mutations du gène p53 dans les leucémies de Friend suggère un rôle de p53 dans l'évolution de cette maladie. Nous avons donc recherché si p53(V135A) pouvait coopérer avec Spi-1 pour modifier la réponse des érythroblastes EpoR(R129C) à hEpo. Des clones co-exprimant EpoR(R129C), Spi-1 et p53(V135A) ont été générés. L'analyse de la réponse de ces clones à la privation et à la stimulation par hEpo montre que l'expression de p53(V135A) renforce les phénotypes imposés par Spi-1 dans les érythroblastes EpoR(R129C). En effet, alors que les érythroblastes EpoR (R129C)/Spi-1 sont inhibés dans leur programme de différenciation, les clones EpoR(R129C)/Spi-1/p53(V135A) montrent un blocage de leur différenciation en présence de hEpo [32]. La totalité de la population cellulaire conserve une morphologie blastique et n'accumule plus d'hémoglobine en réponse à hEpo. En outre, l'expression de p53(V135A) renforce l'inhibition de l'apoptose induite par Spi-1 dans les érythroblastes EpoR(R129C) [32].

Ces expériences montrent donc que la co-expression de Spi-1 avec EpoR (R129C) dérégule les programmes de mort cellulaire par apoptose et de différenciation des érythroblastes primaires. Elles montrent aussi que l'altération du gène p53, en coopération avec la surexpression de Spi-1, contribue à la dérégulation de ces programmes. Elles suggèrent enfin que la perte de fonction de la protéine p53 sauvage observée au cours de la phase leucémique de la maladie de Friend n'est probablement pas limitée à un rôle dans l'immortalisation de ces cellules.

Spi-1 et l'activation de c-Kit par son ligand coopèrent pour induire la prolifération des érythroblastes

Le récepteur du SCF, la protéine tyrosine kinase c-Kit, est essentiel au développement des progéniteurs hématopoïétiques, notamment lors de la maturation des BFU-E en CFU-E [39]. Bien qu'ils expriment c-Kit, la différenciation et la prolifération de progéniteurs plus matures tels que les érythroblastes primaires ts-Sea exprimant EpoR ou EpoR(R129C) ne sont que marginalement affectées par la présence de SCF. Ceci résulte du fait que l'expression de c-Kit est rapidement perdue au cours de la différenciation de ces cellules [32]. En revanche, l'expression de Spi-1 dans les érythroblastes EpoR (R129C) induit leur prolifération rapide en réponse au SCF, indépendamment de la présence ou de l'absence d'hEpo, une réponse qui est associée avec le maintien de l'expression de c-Kit. Ceci suggère qu'une des composantes de la reprogrammation génétique induite par Spi-1 dans les érythroblastes EpoR(R129C) affecte directement ou indirectement les voies de signalisation intracellulaires contrôlées par c-Kit. Les souris présentant une mutation dans les gènes codant c-Kit (locus white spotting) ou son ligand (locus steel) ont une susceptibilité réduite à développer une érythroleucémie lorsqu'elles sont infectées par le complexe viral de Friend (revue in [4, 5]). Il serait intéressant d'analyser si l'émergence des clones leucémiques exprimant Spi-1 est affectée chez ces souris.

Les propriétés de Spi-1 dépendent de sa coopération avec une forme dérégulée de EpoR

Contrairement aux souris exprimant la forme sauvage de EpoR, les souris exprimant EpoR(R129C) développent une érythroleucémie [34]. Par ailleurs, dans la leucémie de Friend la surexpression de Spi-1 et la perte de fonction de p53 sont des altérations qui apparaissent dans des érythroblastes dans lesquels EpoR est activé par la gp55, suggérant que la fonction d'au moins une de ces protéines requiert l'activation anormale de EpoR. De façon à analyser cette question, nous avons comparé la réponse à hEpo des érythroblastes EpoR(R129C)/Spi-1 avec celle des érythroblastes co-exprimant Spi-1 et la forme sauvage de EpoR. Cette analyse montre que, contrairement aux érythroblastes EpoR(R129C)/Spi-1, les érythroblastes EpoR/Spi-1 présentent une réponse à hEpo similaire à celle des érythroblastes contrôles exprimant EpoR. En effet, en présence de hEpo, ces cellules se différencient en érythrocytes et accumulent de hauts taux d'hémoglobine (figure 3 et [32]). En absence de hEpo, elles meurent par apoptose. Enfin, comme les érythroblastes contrôles, ces cellules ne prolifèrent pas en réponse au SCF. Les phénotypes induits par Spi-1 sont donc spécifiques de sa co-expression avec EpoR(R129C). Nous avons récemment montré que Spi-1 coopère aussi avec le complexe gp55(P)/EpoR pour déréguler le contrôle de la survie et de la différenciation terminale de ces érythroblastes par hEpo et leur réponse au SCF. Ces observations indiquent donc que le potentiel oncogénique de Spi-1 dépend de l'activation anormale de certaines des voies de signalisation situées en aval des formes activées de EpoR observées dans les leucémies de Friend. Cette conclusion paraît être superficiellement en désaccord avec celle des expériences faisant appel à un modèle de souris transgénique pour Spi-1 qui montrent l'émergence d'érythroblastes immortalisés qui restent dépendants de l'Epo pour leur prolifération [26]. Il est à noter cependant que l'érythroleucémie induite dans ces conditions n'apparaît qu'après plusieurs mois. Cette longue période de latence pourrait refléter la nécessité de l'activation d'une voie intracellulaire - éventuellement différente de celle(s) induite(s) par les formes activées de EpoR - capable de coopérer avec Spi-1 pour induire ses propriétés oncogéniques. Alternativement, il est possible que cette exigence puisse être levée par la surexpression de Spi-1 aux niveaux très élevés observés dans le modèle transgénique. Enfin, il est vraisemblable que les cibles cellulaires de Spi-1 dans la maladie de Friend et celles étudiées dans les différents systèmes expérimentaux ne se superposent que partiellement. Cet argument est particulièrement important à considérer dans la mesure où Spi-1/PU.1 paraît être un gène essentiel à l'érythropoïèse adulte mais qui ne semble pas être requis dans l'érythropoïèse fœtale [40].

Le caractère hétérologue de notre système permet maintenant d'étudier la capacité de mutants de EpoR(R129C) ou de EpoR (sous forme du complexe gp55/EpoR) pour leur capacité à coopérer avec Spi-1. En particulier, l'analyse de mutants dans les tyrosines phospho-acceptrices du domaine intracellulaire [41] amenant au découplage spécifique de certaines voies de signalisation permettra de déterminer si la coopération avec Spi-1 dépend de signaux quantitativement ou qualitativement différents de ceux normalement activés en aval de EpoR.

En outre, l'étude de mutants de Spi-1 permettra de déterminer si les voies de signalisation spécifiques aux formes activées de EpoR affectent directement l'activité de Spi-1. En effet, l'activité transcriptionnelle de Spi-1 est régulée par sa phosphorylation et par son association avec d'autres co-facteurs (revue in [42]). Ces voies de signalisation pourraient donc directement réguler la phosphorylation de Spi-1 ou celle d'un de ces co-facteurs (figure 4). Alternativement, des mécanismes plus indirects peuvent être mis en œuvre tels que la modification des régulateurs transcriptionnels liés au promoteur des gènes cibles de Spi-1 ou celle des produits de ces gènes (figure 4).

Outre son intérêt intrinsèque menant à l'étude de la régulation de l'activité d'un régulateur transcriptionnel par des signaux intracellulaires, le modèle développé ici suggère que l'évolution de la leucémie de Friend est un processus hautement intégré impliquant des coopérations multiples et synergistiques entre les événements qui caractérisent la phase préleucémique et ceux qui sont spécifiques de la phase leucémique proprement dite. Il amène à plusieurs hypothèses qui sont directement testables à la fois dans notre modèle cellulaire et dans le modèle animal original.

CONCLUSION

Remerciements

Les auteurs remercient Françoise Moreau-Gachelin pour sa lecture critique du manuscrit. Les travaux décrits ici ont été réalisés grâce à l'aide financière du Centre National de la Recherche Scientifique, de l'Institut Curie, de l'Association pour la Recherche sur le Cancer, de la Ligue Contre le Cancer (Comité National et Comité de l'Essonne), de l'Association Contre la Leucémie et du Programme Biomed2 de l'Union européenne.

REFERENCES

1. Friend C. Cell free transmission in adult Swiss mice of a disease having the character of a leukemia. J Exp Med 1957 ; 105 : 307-18.

2. Mirand E. Murine viral-induced polycythemia. Ann NY Acad Sci 1968 ; 149 : 186-496.

3. Rauscher F. Virus-induced disease of mice characterized by erythrocytopoiesis and lymphoid leukemia. J Natl Canc Inst 1962 ; 29 : 515-43.

4. Teich N, Wyke J, Mak T, Bernstein A, Hardy W. In : RNA tumor viruses. New York : Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 : 785-998.

5. Ben-David Y, Bernstein A. Friend virus-induced erythroleukemia and the multistage nature of cancer. Cell 1991 ; 66 : 831-4.

6. Tambourin P, Wendling F, Jasmin C, Smadja-Joffe F. The physiopathology of Friend leukemia. Leuk Res 1979 ; 3 : 117-29.

7. Hankins W. Polycythemia- and anemia-inducing erythroleukemia viruses exhibit differential erythroid transforming effects in vitro. Cell 1980 ; 22 : 693-9.

8. Constantinescu S, Wu H, Liu X, Beyer W, Fallon A, Lodish H. The anemic Friend virus gp55 envelope glycoprotein induced erythroid differentiation in fetal liver colony-forming units-erythroid. Blood 1998 ; 91 : 1163-72.

9. Mager D, Mak A, Bernstein A. Quantitative colony method for tumorigenic cells transformed by two distinct strains of Friend leukemia virus. Proc Natl Acad Sci USA 1981 ; 78 : 1703-7.

10. Spiro C, Gliniak B, Kabat D. A tagged helper-free Friend virus causes clonal erythroblast immortality by specific proviral integration in the cellular genome. J Virol 1988 ; 62 : 4129-35.

11. Wolff L, Ruscetti S. The spleen focus-forming virus (SFFV) envelope gene, when introduced into mice in the absence of other SFFV genes, induces acute erythroleukemia. J Virol 1988 ; 62 : 2158-63.

12. Kabat D. Molecular biology of Friend viral erythroleukemia. Curr Top Microbiol Immunol 1989  ; 148 : 1-42.

13. Li JP, Bestwick RK, Spiro C, Kabat D. The membrane glycoprotein of Friend spleen focus-forming virus  : evidence that the cell surface component is required for pathogenesis and that it binds to a receptor. J Virol 1987 ; 61 : 2782-92.

14. Aizawa S, Suda Y, Furuta Y, Yagi T, Takeda N, Watanabe N, Nagayoshi M, Ikawa Y. Env-derived gp55 gene of Friend spleen focus-forming virus specifically induces neoplastic proliferation of erythroid progenitor cells. EMBO J 1990 ; 9 : 2107-16.

15. Li JP, D'Andrea AD, Lodish HF, Baltimore D. Activation of cell growth by binding of Friend spleen focus-forming virus gp55 glycoprotein to the erythropoietin receptor. Nature 1990 ; 343 : 762-4.

16. Yamamura Y, Senda H, Kageyama Y, Matsuzaki T, Noda M, Ikawa Y. Erythropoietin and Friend virus gp55 activate different JAK/STAT pathways through the erythropoietin receptor in erythroid cells. Mol Cell Biol 1998 ; 18 : 1172-80.

17. Tarr K, Watowich SS, Longmore GD. Cell surface organization of the erythropoietin receptor complex differs depending on its mode of activation. J Biological Chemistry 1997 ; 272 : 9099-107.

18. Penta K, Sawyer ST. Erythropoietin induces the tyrosine phosphorylation, nuclear translocation, and DNA binding of STAT1 and STAT5 in erythroid cells. J Biological Chemistry 1995  ; 270 : 31282-7.

19. Moreau-Gachelin F, Tavitian A, Tambourin P. Spi-1 is a putative oncogene in virally induced murine erythroleukaemias. Nature 1988 ; 331 : 277-80.

20. Moreau-Gachelin F, Ray D, de Both NJ, van der Feltz MJ, Tambourin P, Tavitian A. Spi-1 oncogene activation in Rauscher and Friend murine virus-induced acute erythroleukemias. Leukemia 1990 ; 4 : 20-3.

21. Klemsz MJ, McKercher SR, Celada A, Van Beveren C, Maki RA. The macrophage and B cell-specific transcription factor PU.1 is related to the ets oncogene. Cell 1990 ; 61 : 113-24.

22. Paul R, Schuetze S, Kozak SL, Kozak CA, Kabat D. The Sfpi-1 proviral integration site of Friend erythroleukemia encodes the ets-related transcription factor Pu.1. J Virol 1991 ; 65 : 464-7.

23. Munroe DG, Peacock JW, Benchimol S. Inactivation of the cellular p53 gene is a common feature of Friend virus-induced erythroleukemia : relationship of inactivation to dominant transforming alleles. Mol Cell Biol 1990 ; 10 : 3307-13.

24. Schuetze S, Paul R, Gliniak BC, Kabat D. Role of the PU.1 transcription factor in controlling differentiation of Friend erythroleukemia cells. Mol Cell Biol 1992 ; 12 : 2967-75.

25. Schuetze S, Stenberg PE, Kabat D. The Ets-related transcription factor PU.1 immortalizes erythroblasts. Mol Cell Biol 1993 ; 13 : 5670-8.

26. Moreau-Gachelin F, Wendling F, Molina T, Denis N, Titeux M, Grimber G, Briand P, Vainchenker W, Tavitian A. Spi-1/PU.1 transgenic mice develop multistep erythroleukemias. Molecular & Cellular Biology 1996 ; 16 : 2453-63.

27. Lavigueur A, Bernstein A. p53 transgenic mice : accelerated erythroleukemia induction by Friend virus. Oncogene 1991 ; 6 : 2197-201.

28. Johnson P, Chung S, Benchimol S. Growth suppression of Friend virus-transformed erythroleukemia cells by p53 protein is accompanied by hemoglobin production and is sensitive to erythropoietin. Mol Cell Biol 1993 ; 13 : 1456-63.

29. Knight J, Zenke M, Disela C, Kowenz E, Vogt P, Engel JD, Hayman MJ, Beug H. Temperature-sensitive v-sea transformed erythroblasts : a model system to study gene expression during erythroid differentiation. Genes Dev 1988 ; 2 : 247-58.

30. Beug H, Metz T, Mullner EW, Hayman MJ. Self renewal and differentiation in primary avian hematopoietic cells : an alternative to mammalian in vitro models ? (Review). Current Topics in Microbiology & Immunology 1996 ; 211 : 29-39.

31. Steinlein P, Deiner E, Leutz A, Beug H. Recombinant murine erythropoietin receptor expressed in avian erythroid progenitors mediates terminal erythroid differentiation in vitro. Growth Factors 1994 ; 10 : 1-16.

32. Tran Quang C, Wessely O, Pironin M, Beug H, Ghysdael J. Cooperation of Spi-1/Pu.1 with an activated erythropoietin receptor inhibits apoptosis and Epo-dependent differentiation in primary erythroblasts and induces their Kit ligand-dependent proliferation. EMBO J 1997 ; 16 : 5639-53.

33. Wu H, Liu X, Jaenisch R, Lodish HF. Generation of committed erythroid BFU-E and CFU-E progenitors does not require erythropoietin or the erythropoietin receptor. Cell 1995 ; 83 : 59-67.

34. Longmore GD, Lodish HF. An activating mutation in the murine erythropoietin receptor induces erythroleukemia in mice : a cytokine receptor superfamily oncogene. Cell 1991 ; 67 : 1089-102.

35. Longmore G, You Y, Molden J, Liu K, Mikami A, Lai S, Pharr P, Goldsmith M. Redundant and selective roles for erythropoietin receptor tyrosines in erythropoiesis in vivo. Blood 1998 ; 91 : 870-8.

36. Yang E, Korsmeyer S. Molecular thanatopsis : a discourse on the BCL2 family and cell death. Blood 1996 ; 88 : 386-401.

37. Gauthier JM, Bourachot B, Doucas V, Yaniv M, Moreau-Gachelin F. Functional interference between the Spi-1/PU.1 oncoprotein and steroid hormone or vitamin receptors. EMBO J 1993 ; 12 : 5089-96.

38. Weintraub SJ, Chow KN, Luo RX, Zhang SH, He S, Dean DC. Mechanism of active transcriptional repression by the retinoblastoma protein. Nature 1995 ; 375 : 812-5.

39. Nocka K, Majumder S, Chabot B, Ray P, Cervone M, Bernstein A, Besmer P. Expression of c-kit gene products in known cellular targets of W mutations in normal and W mutant mice-evidence for an impaired c-kit kinase in mutant mice. Genes & Dev 1989 ; 3 : 816-26.

40. Scott EW, Fisher RC, Olson MC, Kehrli EW, Simon MC, Singh H. PU.1 functions in a cell-autonomous manner to control the differentiation of multipotential lymphoid-myeloid progenitors. Immunity 1997 ; 6 : 437-47.

41. Ihle JN. Cytokine receptor signalling [Review]. Nature 1995 ; 377 : 591-4.

42. Ghysdael J, Boureux A. In : Yaniv M, Ghysdael J, eds. Oncogenes as Transcriptional Regulators. Basel : Birkhauser Verlag, 1997 ; 1 : 29-89.