DNA repair and tumour radiosensitivity: focus on ATM gene

ARTICLE

bdc.2011.1324

Auteur(s) : Christophe Hennequin^1,,2 christophe.hennequin@sls.aphp.fr, Laurent Quero^1,2, Vincent Favaudon²

¹ Hôpital Saint-Louis, service de cancérologie-radiothérapie, 1, avenue Claude-Vellefeaux, 75010 Paris, France

² Institut Curie-Recherche, Inserm U612, Orsay, France

Tirés à part : C. Hennequin

Position du problème

La radiosensibilité des tissus sains et des tumeurs, c’est-à-dire la perte du potentiel clonogénique sous rayonnement, varie sur une échelle allant de 1 à plus de 10. Pour un même type histologique, à stade égal, telle tumeur sera guérie par la radiothérapie classique et telle autre progressera rapidement, alors que les caractéristiques initiales des tumeurs paraissaient identiques. On a donc cherché depuis longtemps à identifier les paramètres qui permettraient de prédire la réponse des tissus sains aussi bien que des tumeurs sur une base rationnelle et quantitative.

La radiocurabilité d’une tumeur dépend d’un grand nombre de facteurs. La radiosensibilité intrinsèque des cellules tumorales est essentiellement déterminée par les capacités de réparation des lésions de l’ADN et modulée par les propriétés du stroma environnant, en particulier par l’oxygénation tumorale [1]. Le nombre de cellules clonogéniques, qu’il est tentant d’assimiler aux cellules souches tumorales, et la réponse aux facteurs de croissance doivent également être pris en considération [2].

La radiosensibilité intrinsèque

La radiosensibilité des cellules humaines normales in vitro et in vivo, exprimée par la valeur de la SF2 ou des paramètres α et β dans le modèle linéaire-quadratique varie d’un type cellulaire à l’autre, les cellules souches pluripotentes de la lignée hématopoïétique et les cellules souches de la lignée germinale testiculaire étant les plus radiosensibles. Les paramètres caractérisant la radiosensibilité des cellules tumorales varient sur une échelle aussi étendue que celle des cellules normales. Cependant, les cellules tumorales établies à partir de tumeurs radiocurables présentent une radiosensibilité in vitro significativement plus élevée que celles dérivées de tumeurs radiorésistantes [3]. Weichselbaum et al. [4] avaient montré, par l’analyse de 20 lignées cellulaires issues de cancers ORL et de 13 autres issues de sarcomes, que le taux d’échec local en radiothérapie exclusive est statistiquement corrélé au groupe des tumeurs radiorésistantes. Cela suggère qu’une radiorésistance intrinsèque peut contribuer à l’échec d’une irradiation à visée curative. Les données montrent également que la récidive est fréquemment liée à la sélection de clones radiorésistants et qu’il y a une bonne corrélation entre la radiocurabilité et la valeur de la SF2.

Plusieurs études ont essayé de corréler, pour chaque patient, la valeur de la SF2 et la probabilité de guérison, en utilisant des cultures tumorales primaires sur matrice semi-solide (cell adhesive matrix [CAM]). West et al. [5] ont ainsi démontré chez 128 patientes atteintes d’un cancer du col utérin une excellente corrélation entre la SF2 et le contrôle local ainsi que la survie. Dans cette, étude la survie à 5 ans était de 81 % lorsque la valeur de la SF2 était plus basse que la médiane, 51 % dans le cas contraire. La même équipe a trouvé le même type de corrélation dans les tumeurs ORL [6].

En définitive, la radiosensibilité intrinsèque est corrélée à la radiocurabilité dans plusieurs situations cliniques. La méthode a permis d’identifier un grand nombre de gènes impliqués dans la réparation et dans le déroulement de la mort cellulaire radio-induite. Elle ne peut cependant être utilisée en routine clinique en raison du hasard des prélèvements, du taux d’échec important à la transplantation ou à la mise en culture, du taux également prohibitif de faux négatifs, et du temps – plusieurs semaines – nécessaire à la réalisation de l’essai.

Lésions de l’ADN et radiosensibilité

Les radiations ionisantes, photons-X ou particules accélérées, déposent de l’énergie dans les cellules irradiées par effet Compton et effet photoélectrique. Cette étape physique, qui se produit en 10⁻¹⁶ à 10⁻¹⁴ s, est indépendante du type cellulaire considéré. Elle aboutit à la formation de radicaux libres dont les principaux sont les radicaux OH^• issus de la radiolyse de l’eau. Ceux-ci sont responsables de la majorité des lésions chimiques qui touchent l’ensemble des compartiments cellulaires. Par leurs conséquences, les lésions qui touchent les chromosomes sont les plus importantes.

On distingue classiquement plusieurs types de lésions de l’ADN, à savoir les dommages oxydatifs du désoxyribose et des bases puriques ou pyrimidiques, les pontages ADN-ADN ou ADN-protéines, et les cassures simple-brin (SSB) et double-brin (DSB) de la chaîne polynucléotidique. Une dose d’1 Gy produit dans chaque cellule environ 2 000 dommages de bases, 1 000 SSB, 150 pontages ADN-protéine, 40 DSB et 30 pontages ADN-ADN. Les DSB sont les plus difficiles à réparer, et une seule DSB non réparée suffit à induire la mort de la cellule. Cela explique qu’il y ait une bonne corrélation entre l’incidence des DSB et l’effet létal des radiations [7]. Par ailleurs, des considérations de microdosimétrie ont conduit à proposer l’existence de lésions dites complexes ou locally multiply damaged sites (LMDS) par accumulation dans un domaine de l’ordre d’un tour d’hélice de l’ADN de plusieurs lésions élémentaires (SSB, lésions des bases, pontages). Prises individuellement, ces lésions sont aisément réparées, mais leur accumulation rendrait leur réparation lente et infidèle, leur conférant un pouvoir létal élevé.

En dépit de ces observations, à ploïdie égale l’incidence des dommages radio-induits de l’ADN varie très peu d’un type cellulaire à l’autre et il n’a été possible de mettre en évidence une relation entre l’incidence des lésions et la radiosensibilité. On sait aujourd’hui que c’est dans la capacité des cellules à détecter (signalisation) et traiter (réparation) les lésions de l’ADN qu’il faut rechercher l’origine des variations de radiosensibilité [8]. Ce modèle est attesté par le fait que la radiosensibilité intrinsèque est assez bien corrélée au nombre de DSB non réparées 24 heures après irradiation [9].

Voies de signalisation et réparation

Les cellules eucaryotes répondent aux lésions de l’ADN par un système sophistiqué (DNA damage response [DDR]), impliquant de très nombreux acteurs et développé pour détecter, signaler et réparer ces lésions. Les interactions avec le cycle cellulaire (activation des « checkpoints ») font partie intégrante de ce système. Le but final étant de préserver l’intégrité génomique pour permettre les activités métaboliques essentielles comme l’expression génique, la réplication, la progression dans le cycle cellulaire et la survie ou la mort cellulaire. Les mutations de ces gènes sont responsables de « réparatoses » et peuvent affecter la radiosensibilité.

Les voies de réparation les plus importantes peuvent être classées sous deux rubriques :

• – la réparation par excision-resynthèse, comprenant (a) le base excision repair (BER) et le nucleotide excision repair (NER) qui prennent en charge BD et SSB, et (b) la réparation des mésappariements de bases ou mismatch repair, qui intervient sur les erreurs de réplication de l’ADN ;
• – les mécanismes de réparation des DSB [10] qui comprennent (a) la recombinaison homologue (HR), dans laquelle la DSB située sur un chromosome est réparée en utilisant l’ADN du chromosome homologue comme matrice et permet une réparation de la lésion sans générer d’erreurs génétiques, et (b) la suture non homologue ou non-homologous end-joining (NHEJ). Le NHEJ joue un rôle prédominant pendant la phase G1 tandis que la réparation par recombinaison homologue est utilisée préférentiellement dans les phases S et G2. Initié par fixation de l’hétérodimère Ku70-Ku86 sur la DSB et nécessitant DNA-PKcs, XRCC4, Artemis et Ligase IV, le NHEJ n’exige pas une homologie stricte et peut produire une perte d’information génétique. Le NHEJ apparaît cependant comme le principal mécanisme de réparation des DSB dans les cellules eucaryotes [11].

ATM et cassures double-brin

C’est en 1975 que la radiosensibilité des lignées cellulaires des patients atteints d’ataxie télangiectasie a été mise en évidence, avec pour conséquence des aberrations chromosomiques. Plus tard, le gène de cette maladie, appelé ataxia telangiectasia mutated (ATM) a été localisé sur le chromosome 11q23 et identifié comme une protéine kinase (350 kDa), avec une structure similaire à celle des PI-3 kinases [12].

Fonction d’ATM

ATM est une sérine/thréonine protéine kinase dotée d’un domaine catalytique de type phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K). Ce domaine présente une homologie marquée avec le site catalytique de cinq autres kinases impliquées dans la surveillance du génome (ATR, ATX/SMG-1, DNA-PKcs) ou de grandes voies métaboliques (FRAP^mTOR, TRRAP). ATM et DNA-PKcs sont essentielles à la réparation des DSB. ATR et ATX/SMG-1 sont nécessaires au contrôle de la réplication et à la réparation des dommages de l’ADN induits par les UV.

Une augmentation rapide de l’activité d’ATM est détectée après irradiation ou création de DSBs. L’activation d’ATM procède d’une réaction d’autophosphorylation sur le résidu Ser-1981, en réponse à la détection des DSB [13]. Il semble qu’une seule DSB soit insuffisante pour déclencher la réaction d’autophosphorylation, expliquant l’absence d’activation d’ATM aux faibles doses de rayonnement (≤ 100 mGy). En fait, l’analyse des cinétiques de réparation ont montré que ATM était nécessaire à la réparation d’un sous-groupe de DSB (environ 10 %) qui sont habituellement réparées avec une cinétique lente, alors que la plupart des DSB sont réparées très rapidement [14].

Lorsque le niveau de stimulation est suffisant, l’activation d’ATM se produit dans les minutes qui suivent l’irradiation. L’activation initiale d’ATM semble être médiée par le complexe MRN (MRE11-RAD50-NBS1), probablement via un changement de conformation dans le domaine kinase d’ATM. On peut donc prévoir qu’un défaut de ce complexe induise une forte instabilité chromosomique, un défaut de suture et une hyper-radiosensibilité. C’est effectivement le cas du syndrome de Nimègue, associé à une mutation de la protéine NBS.

En tout état de cause l’activation d’ATM permet la phosphorylation de ses substrats (figure 1), au nombre desquels on compte DNA-PKcs, sous-unité catalytique du complexe DNA-PK, la protéine p53, la protéine p53 binding protein (p53BP1), et l’histone H2AX. ATM contrôle ainsi, via p53, l’apoptose radio-induite ; via DNA-PKcs, mais aussi Artemis, la voie de réparation des DSB par le NHEJ [15] ; via H2AX, l’amplification du signal de réparation ; via BRCA1, la réparation par recombinaison homologue ; et via p53, Chk2 et p95/NBS1, l’arrêt de la progression du cycle cellulaire en phase G1, S et G2.

ATM et réparation de l’ADN

Les modifications des histones et le remodelage de la chromatine ont un rôle important dans la réponse cellulaire à l’irradiation. Suite à l’irradiation, survient l’accumulation de diverses protéines de la DDR sous forme de foci appelés ionizing radiation-induced foci (IRIF : foci induits par les radiations ionisantes) [16]. Parmi ces protéines, on retrouve MDC1, MRE11, BRCA1 ou H2AX.

La phosphorylation de l’histone H2AX sur le site Ser139 par ATM et/ou DNA-PK est indispensable à la réparation des DSB et est au cœur de la formation des IRIF [17]. Cette phosphorylation s’étend autour de la DSB sur une distance de 2 Mb. Survenant en quelques minutes après l’irradiation, cette réaction provoque l’agrégation de la protéine phosphorylée (γH2AX). La protéine MDC1 vient ensuite se fixer sur γ-H2AX (figure 2) et va favoriser l’accumulation des autres protéines de l’IRIF [18], et en particulier, le complexe MRN. Celui-ci va à nouveau fixer ATM, qui phosphoryle les protéines H2AX des nucléosomes adjacents et tend donc à amplifier le signal [19]. ATM va également phosphoryler MDC1, ce qui va lui permettre de recruter d’autres protéines, en particulier un complexe RNF8-UBC13 et la protéine 53BP1.

L’agrégation de γH2AX se fait sous forme de « foci » qu’il est aisé de visualiser et quantifier par immunofluorescence. L’intensité de la réaction est proportionnelle à la dose déposée si celle-ci n’excède pas 2 Gy, ce qui en fait un bon moyen de mesure des DSB aux faibles doses de rayonnement [20]. Avec des exceptions, la persistance de foci résiduels est corrélée à la radiosensibilité in vitro [21, 22], même en cas de traitement fractionné. Les souris déficientes en H2AX sont radiosensibles et accumulent de nombreuses aberrations chromosomiques.

La phosphorylation de H2AX et la formation de foci γ-H2AX sont actuellement généralement acceptées comme des marqueurs quantitatifs fiables des DSB, utilisables même si le nombre de lésions est faible. Toutefois, le test n’est pas aisément applicable aux cellules en croissance, au motif que les cellules en phase S développent spontanément un taux élevé de foci de γH2AX. L’utilisation d’anticorps dirigés contre ATM phosphoryle est une voie de recherche potentielle et pourrait remplacer la détection des foci γ-H2AX.

BRCA-1 est également présent dans les IRIF. Il fait alors partie d’un complexe comprenant également la protéine Abraxas, receptor-associated protein 80 (RAP80) et BRCA1-BRCA2-containing complex subunit 36 (BRCC36). Ce complexe se lie à l’ADN par des chaînes d’ubiquitines : celles-ci sont issues des histones H2A et H2B, et se sont formées sous l’action des protéines ring-finger-containing nuclear factor 8 (RNF8), fixée sur MDC1 et RNF168. Ces chaines d’ubiquitine permettent la fixation de BRCA1 mais aussi de 53BP1. Il a récemment été décrit que la mutation de RNF168 était impliqué dans le syndrome de RIDDLE, caractérisé par une immunodépression et une radiosensibilité [23]. RNF8 et RNF168 ont pour co-facteur ubiquitin-conjugating enzyme (UBC13).

Mutations d’ATM et radiosensibilité : données cliniques

Le syndrome d’ataxie-télangiectasie

Les mutations homozygotes du gène ATM sont responsables du syndrome d’ataxie télangiectasie (AT). Le gène AT consiste en 66 exons et plus de 100 mutations de ce gène, conduisant pour la plupart à la perte totale de l’activité, ont été recensées. La plupart des patients ont deux mutations distinctes, chacune héritée d’un des parents. Identifiée dès 1926, AT se manifeste par une ataxie cérébelleuse de pronostic sévère et précoce, des télangiectasies oculo-cutanées, une immunodéficience majeure, des remaniements chromosomiques spontanés et une prédisposition à de nombreux cancers (essentiellement leucémies et lymphomes). Une hypersensibilité aux radiations ionisantes est constante [24]. L’incidence d’AT est estimée à 10^-5. Les porteurs hétérozygotes (ATH), qui constituent environ 1 % de l’ensemble de la population, présentent un risque accru de cancer. Un taux élevé d’alpha-fœto-protéine est retrouvé chez 95 % des patients [25].

Les lignées AT présentent la plus forte radiosensibilité connue chez l’homme. Cet effet s’explique par l’altération des voies de signalisation liées à la réponse au stress oxydatif (AP1, JNK, IκB, SAPK), à la régulation du cycle cellulaire (Mdm2, p53, RPA, Chk1, Chk2, CDK1) et à la réparation des lésions de l’ADN par HR ou NHEJ (c-Abl, BRCA1, DNA-PKcs, RAD51). L’effet sur le NHEJ est probablement le facteur le plus important. En effet, même en l’absence de mutation d’ATM, la mutation ou la perte de l’un des gènes codant les protéines du complexe hétérotrimère DNA-PK (Ku70, Ku86, DNA-PKcs) ou des autres partenaires du NHEJ (XRCC4, Ligase IV), confère une hyper-radiosensibilité du même ordre de grandeur que celle provoquée par la mutation d’ATM [26]. De plus, on note une absence d’arrêt en G2, favorisant ainsi l’instabilité génomique. Le raccourcissement accéléré des télomères est un facteur de vieillissement prématuré de ces patients [27].

Hétérozygotie et radiosensibilité

Les mutations des gènes de réparation sont très rares, et ne peuvent donc expliquer les différences de radiosensibilité interindividuelle qui sont le lot commun du radiothérapeute. L’hétérozygotie est par contre plus fréquente : elle toucherait par exemple 5 % des patientes porteuses d’un cancer du sein. Les polymorphismes (SNP) des gènes de réparation de l’ADN, qui ont des conséquences fonctionnelles plus discrètes pourraient être plus fréquemment en cause. Les SNP portent sur la substitution d’une seule base dans la séquence de l’ADN et sont observés entre différents individus au sein d’une population. Un polymorphisme est défini comme la présence d’un allèle chez plus de 1 % de la population alors que la mutation ne survient que dans moins de 1 % des cas.

La radiosensibilité des lignées hétérozygotes est intermédiaire entre celle des lignées homozygotes et des lignées sauvages [28, 29]. Cependant, ces lignées maintiennent une activité de phosphorylation des substrats du gène ATM suffisante pour permettre la réalisation de ses principales fonctions. L’impact de la diminution de la concentration de la protéine sur la valeur de la SF2 reste discuté [30, 31].

L’hétérozygotie du gène ATM, de même que certains variants, serait des facteurs de risque de survenue d’un cancer du sein [32]. Cependant, une large étude prospective récente ne retrouve aucune association entre la présence des mutations ATM Ser49Cys ou Ser707Pro et la survenue de cancers [33]. Il est probable cependant, que certaines mutations du gène entrainent une diminution d’expression de la protéine avec pour corrollaire un certain degré d’instabilité génomique [34].

L’implication des SNP dans la survenue de complications de la radiothérapie, a été étudiée : certains variants de TGF-β1, XRCC1, SOD et ATM ont été corrélés à une augmentation de l’intensité ou de la fréquence des toxicités radio-induites aiguë ou tardive. C’est en particulier le cas du polymorphisme de TGF-β1 et de la fibrose radio-induite dans le cancer du sein [35] ou les tumeurs gynécologiques [36].

Concernant le gène ATM, les quelques études cliniques rapportant les complications tardives des patientes hétérozygotes ou avec un variant sont discordantes, la plupart ne mentionnant pas cependant une toxicité majorée [37]. Il semble que le polymorphisme 5557 G A soit corrélé à la survenue de fibrose tardive [38]. En définitive, la survenue de complications tardives est multifactorielle et ne peut probablement pas être expliquée par un seul facteur. Des tests globaux sont probablement plus performants pour apprécier le risque de séquelles après irradiation [39].

Peu de gènes ont jusqu’à présent été corrélé à la manifestation de toxicités aiguës, mais les variants d’ATM paraissent délétères [40].

L’impact des mutations du gène ATM sur la radiocurabilité est également sujet de controverse : il ne semble pas que le taux de récidive locale soit majoré, mais il est possible que l’agressivité tumorale et le risque de développer des métastases soient accrus [41, 42]. On notera également que la radiocurabilité dépend de l’intégrité du complexe MRN. En effet, chez 224 patientes traitées par mastectomie suivie d’une radiothérapie, le taux de récidive locale était de 24 % (c’est-à-dire identique à celui obtenu après mastectomie seule) en cas de défaut du complexe MRN, alors qu’il n’est que de 8 % lorsque le complexe est fonctionnel [43]. Notons aussi que l’expression de Ku70 et Ku86 est corrélée à la radiocurabilité des tumeurs rectales [44], ainsi que des cancers du col utérin quoique d’une manière moins significative [45]. Cependant, l’expression de Ku70 et Ku86 n’est pas significativement corrélée à la radiosensibilité intrinséque (mesurée par la SF2) dans les tumeurs ORL [46] ou les glioblastomes [47].

Conclusion

L’ensemble des données obtenues tant in vitro qu’in vivo montre que la radiosensibilité dépend d’une multitude de paramètres au nombre desquels la signalisation et la réparation des lésions radio-induites de l’ADN constituent le facteur déterminant. Une modification de l’état du gène ATM est probablement un des paramètres importants dans la radiosensibilité, mais de nombreux autres facteurs entrent en jeu dans la survenue de complications post-radiques ou sur le contrôle local.

L’étude des polymorphismes des gènes de signalisation et de réparation est à ce jour une voie prometteuse pour l’établissement de tests prédictifs individuels. Leur éventuel développement permettrait de sélectionner les patients pour leur proposer, soit une radiothérapie exclusive mais modulée (accélérée, IMRT…), soit une association avec la chirurgie et la chimiothérapie. Mais aucun test prédictif de la radiosensibilité tumorale satisfaisant n’est disponible à ce jour.

Conflits d’intérêts

non renseigné.

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