Prix Nobel 2007 : les souris gagnent par KO

ARTICLE

Auteur(s) : Philippe Jeanteur

Institut de génétique moléculaire de Montpellier
UMR 5535, IFR 122

La référence justifiée aux cellules-souches dans l’attendu du prix, « Principes pour l’introduction de modifications géniques spécifiques chez la souris par l’utilisation des cellules-souches embryonnaires », donne une touche de mode à des travaux déjà anciens puisqu’ils datent du milieu des années 1980 et qui ont très largement précédé l’engouement actuel dont jouissent ces cellules. On peut dire que ces travaux reposent sur la conjonction de deux avancées majeures : la capacité de cultiver des cellules-souches embryonnaires (cellules ES) et la maîtrise de la recombinaison homologue, le tout appuyé par une grande expérience de l’embryologie et de la génétique.

Dans les premiers stades du développement de l’embryon, celui-ci se présente comme une sphère creuse appelée blastocyste dont la périphérie va donner les annexes embryonnaires dont le placenta et une masse interne de cellules destinées à donner le fœtus. Ces cellules ES sont dites multipotentes car elles vont donner naissance à toute la variété des tissus de l’organisme adulte. On peut les prélever par une micropipette et les mettre en culture au laboratoire pour y effectuer l’étape de recombinaison homologue. Leur mise en culture et l’établissement de lignées ayant conservé leur multipotence représentent une avancée majeure qui a été le fondement de ce domaine de recherche en pleine expansion.

Qu’en est-il de la recombinaison homologue ? Comme son nom l’indique, la recombinaison homologue ne peut se faire qu’entre ADN homologues donc entre deux versions du même gène. Elle est donc limitée à recombiner des gènes de la même espèce mais, en revanche, elle peut s’appliquer à n’importe lequel d’entre eux, d’où le nom qu’on lui donne aussi de recombinaison générale et c’est ce qui en fait tout l’intérêt. La recombinaison homologue est un phénomène naturel très utilisé par la cellule pour réparer les altérations de l’ADN pouvant survenir au cours de la vie de la cellule en récupérant la séquence normale sur l’autre chromosome. Il se produit spontanément mais avec une fréquence très faible qui ne peut être exploitable expérimentalement que si l’on est capable de l’amplifier par sélection.

Voici le protocole en quelques mots. Une copie inactivée du gène ciblé est génétiquement manipulée de façon à lui intégrer des marqueurs de sélection (par exemple la résistance à un antibiotique) puis introduite dans la culture de cellules-souches (on dispose maintenant de lignées établies). La construction est alors transfectée par les moyens habituels (par exemple électroporation). Les cellules ayant effectué spontanément la recombinaison homologue conduisant au remplacement du gène normal par sa copie inactivée, l’agent de sélection est ajouté jusqu’à obtenir une culture ne contenant plus que des cellules mutées. Elles sont alors réintroduites par micro-injection dans le blastocyste où elles se mélangent aux cellules normales. L’embryon qui résulte de la réimplantation de ce blastocyste sera donc une chimère, c’est-à-dire un mélange de tissus provenant des cellules normales ou mutées. Ces chimères sont par elles-mêmes de peu d’intérêt. Mais certaines de ces souris porteront le gène muté dans leur lignée germinale. C’est le croisement entre elles de ces souris qui permettra de les sélectionner et donc d’obtenir une lignée de souris KO hétérozygotes pour le gène en question. On pourra alors tenter d’obtenir une souris homozygote en croisant deux hétérozygotes entre elles, selon les principes de la génétique mendélienne la plus classique. Cela ne sera possible que si le gène en question n’est pas indispensable au développement de la souris. Il arrive même que l’état hétérozygote soit déjà incompatible avec le développement auquel cas toute la procédure échouera dès la première étape. Pour élégante qu’elle soit, cette technologie est et restera extrêmement lourde, longue et aléatoire quant au résultat final. L’obtention d’une lignée de souris KO demande au moins un an de travail et souvent plus et peut très bien déboucher sur un animal sans phénotype. À déconseiller pour un thésard !

Dans cette première version historique, ces techniques ont été largement utilisées pour obtenir des centaines de lignées de souris contenant un gène inactivé à l’état hétéro ou homozygote (ce que l’on dénote par ⁺/^- ou ^-/^-, respectivement) et ont ainsi permis de mieux comprendre leurs rôles in vivo. Pour autant, il est souvent arrivé qu’aucune conséquence observable ne soit détectée, reflétant la surprenante redondance fonctionnelle de certains gènes appartenant à une même famille ou encore l’extraordinaire capacité d’adaptation permettant de contourner une altération génétique lorsque celle-ci est introduite dès les premiers stades du développement embryonnaire. Plus simplement, cette apparente normalité illustre également notre incapacité technique à analyser des défauts parfois subtils (tels que certains troubles du comportement) qui ne s’expriment jamais dans nos conditions d’élevage standardisées.

Comme c’est souvent le cas pour les découvertes les plus fécondes, celle-ci a connu au fil des ans plusieurs améliorations et sophistications. Afin de contourner la difficulté dans le cas où l’inactivation est létale au cours du développement embryonnaire, d’autres chercheurs ont mis au point une technique très élégante de recombinaison homologue dite conditionnelle ou inductible (technique Cre-Lox) car il est possible de ne la déclencher qu’au niveau de l’organisme adulte, et de plus dans un tissu particulier.

Au-delà des informations fondamentales sur le rôle in vivo de gènes individuels, il est vite apparu que cette technique pouvait ouvrir la voie à la construction de modèles animaux des pathologies humaines. Les mutations observées dans les pathologies étant la plupart du temps beaucoup plus discrètes que l’inactivation complète d’un gène (comme dans le cas des mutations ponctuelles), les chercheurs ont alors développé la technique de knock-in qui se démarque du knock-out par la possibilité d’introduire dans le contexte du gène endogène des mutations identiques à celles observées dans des pathologies. Ce type d’approche a été particulièrement utile dans le cas de la modélisation de la pathologie cancéreuse, comme par exemple la mutation V12 dans l’oncogène Ki-Ras ou des mutations affectant le gène suppresseur de tumeurs p53, des mutations très communément observées dans les tumeurs humaines.

Ce type de modèle knock-in peut également se faire dans les conditions d’inductibilité lorsque ces techniques sont combinées au système Cre-Lox. Raffinement suprême, on peut maintenant induire l’expression de ces mutants ponctuels, non seulement à volonté dans l’organe choisi mais le faire dans des conditions d’induction incomplète qui aboutit à des organes mosaïques juxtaposant des régions porteuses de la mutation avec des régions normales. On se trouve ainsi à mimer au mieux les événements oncogéniques tels qu’ils surviennent chez les patients, où un clone transformé émerge au milieu d’une région tissulaire saine, souvent à un âge déjà avancé.

Il est tentant de rapprocher les travaux de Capecchi, Evans et Smithies de ceux de Fire et Mello récompensés par ce même prix l’année dernière. Ces derniers avaient découvert le phénomène d’ARN-interférence qui permet à de petites molécules d’ARN (siARN) de cibler la dégradation sélective d’un messager particulier. Cette technique plus récente et infiniment plus rapide à mettre en œuvre est très largement utilisée pour réaliser facilement et en grand nombre des inactivations de gènes dans des cellules en culture. Avec les siARN et les souris knock-out obtenues par recombinaison homologue, on dispose donc de deux outils complémentaires pour l’inactivation des gènes, le premier permettant des expériences rapides et transitoires au niveau somatique, le second créant des animaux génétiquement modifiés au niveau germinal donc parfaitement stables et reproductibles. Remarquons cependant que l’on peut faire aux siARN les mêmes objections qu’aux premières souris KO, à savoir que l’effet obtenu est la suppression brutale de la synthèse d’une protéine alors que les dernières sophistications de la recombinaison homologue, et en particulier la technique du knock-in, permet des actions beaucoup plus subtiles et proches des situations pathologiques qui entraînent rarement l’inactivation complète d’un gène.

Il est intéressant de rappeler que Mario Capecchi s’était déjà illustré il y a plus de 40 ans (en 1966) par une découverte majeure en montrant que la synthèse des protéines était initiée par un méthionine-tARN spécifique (formyl-méthionine tARN chez les bactéries). La vie de M. Capecchi est en elle-même un roman qui mérite bien une petite digression. Son père disparu au combat et sa mère déportée à Dachau en 42 alors qu’il n’avait pas 5 ans, il vécut d’errances et de rapines dans une bande d’enfants avant de retrouver sa mère en 46 et d’émigrer aux Etats-Unis pour rentrer dans un cycle éducatif normal à l’âge de 10 ans.

Voilà donc un prix bien mérité et qui n’avait que trop tardé. L’année 2007 restera comme un très bon cru dans les annales du prix Nobel de physiologie et médecine.