Author(s) : Cedric Matthews, Cyril Favard , CNRS, Université de Nice, PRISM, Institute of Signaling Developmental Biology and Cancer, UMR6543 Centre de Biochimie, Faculté des Sciences, 06108 Nice Cedex 2, CNRS, Biophysique cellulaire, Institut de pharmacologie et biologie structurale, UMR 5089, 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex 4.
Summary : Using fluorescent technologies under the microscope is becoming unavoidable in biology research laboratories. These technologies, stemming from instrumental developments of biophysics, raised with the use of fluorescent proteins derived from the GFP (green fluorescent protein) as well as the market development of commercial instruments. They allow studying the dynamics of molecules of interests (FRAP, FCS…) as well as their interactions (FRET, FLIM…) on cells, cellular extracts or tissues. Unfortunately, these are often used without detailed knowledge of their principles as well as their theories. These aspects are developed and illustrated here through means of literature example.
Keywords : fluorescent technology, biology research
Pictures
Figure 1 Diagramme simplifié de Perrin-
Jablonski. Les états électroniques singulets sont notés
S0, S1, S2 et l’état triplet T1.
Les flèches verticales pleines correspondent aux phénomènes
d’absorption ou d’émission de photons. Les flèches en pointillés
correspondent à des pertes énergétiques non radiatives. Chaque
émission ou absorption d’une quantité E d’énergie lumineuse par un
fluorophore est liée à la fréquence de cette lumière par la
relation E = h ν (h est la constante de Planck, ν la
fréquence de la lumière). Les énergies hνa,
hνF, hνp sont respectivement, dans l’ordre
décroissant, celles du photon absorbé, du photon émis par
fluorescence, du photon émis par phosphorescence.
Figure 2 Recouvrement de fluorescence
schématique après photoblanchiment (FRAP). Suite au
photoblanchiment d’une région fluorescente au temps t0,
la fluorescence décroît de l’intensité initiale Fi à
l’intensité F0. Il y a ensuite une récupération de
fluorescence jusqu’à son maximum (F∞). Le demi-temps de
résidence τ donne le temps pour lequel la moitié de
l’intensité de fluorescence initiale est retrouvée. En illustration
cdc42 Δ/PMETCDC42, cellules mutantes de levure exprimant
GFP-Cdc42 (PY196) qui ont été utilisées pour des études de FRAP,
les images ont été généreusement fournies par M. Bassilana et
R. Arkowitz [54])
Figure 3 Exemple de changement de spectre
d’absorbance (A) et de fluorescence (B) d’une molécule
photo-activée. Le λmax indique la valeur maximale
du pic d’excitation ou d’émission après photo-activation.
Figure 4 Après photo-activation des
fluorophores d’une cellule, les cellules filles apparaissant au
cours des divisions sont fluorescentes. Mais il y a diminution de
la fluorescence au cours des divisions.
Figure 5 Les variations d’intensité de signal
de fluorescence suite à l’action d’une excitation lumineuse sur un
compartiment cellulaire entier, notée hν, sont montrées ici pour
les techniques de FRAP, iFRAP, FLIP, FPA. Les variations
d’intensité de fluorescence portées sur les graphes sont mesurées
dans les zones circulaires rouges en pointillés, respectivement sur
les graphes du haut pour les figures du haut et pour les graphes du
bas pour les figures du bas. Les flèches pleines indiquent le
mouvement des molécules entrant ou sortant ou une continuité entre
les compartiments représentés en couleur pleine ou en
pointillés.
Figure 6 Fluctuations de signal mesurées lors
du passage de molécules passant dans le volume d’observation, à
l’aide d’un microscope spécifique durant une expérience de FCS.
Figure 7 Variation d’intensité de fluorescence
mesurée lors du passage d’une molécule dans le champ de détection
(A). Quand deux molécules se suivent en traversant le
champ d’observation, les variations successives sont utilisées pour
construire la courbe de corrélation (B). Tracé de la
fonction d’autocorrélation, la détermination du temps de diffusion
et du nombre de molécules présentes dans le volume d’observation
(C).
Figure 8 Principe du FRET : A) Le
spectre d’émission du fluorophore « donneur » doit
recouvrir le spectre d’absorption du fluorophore
« accepteur ». L’efficacité du FRET est proportionnelle à
l’intégrale de recouvrement J des deux spectres. B) Les
moments d’émission du donneur et d’absorption de l’accepteur ne
doivent pas être orientés de façon perpendiculaire dans l’espace
afin que le FRET se produise. C) Les deux fluorophores
(donneur et accepteur) portés par les molécules d’intérêt doivent
être proches dans l’espace (r < 10 nm), l’efficacité du
transfert se fait en 1/r6, elle est proportionnelle au
rayon de Förster R0 définit pour chacun des couples.
Figure 9 Mesure de durées de vie de
fluorescence. Les durées de vie de fluorescence peuvent être
mesurées de deux façons distinctes, soit en comptage de photon ou
TCSPC (A), soit par modulation d’intensité et déphasage ou
FDPM (B). Dans le premier cas, les photons sont comptés et
ordonnés dans un histogramme suivant la différence de temps entre
l’excitation et l’émission de fluorescence. Dans le second cas,
tous les photons sont enregistrés simultanément, le déphasage et la
modulation sont mesurés en enregistrant l’intensité avant et après
le passage dans l’échantillon.
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