ARTICLE
Auteur(s) : Jérôme Solassol1, Philippe
Marin2, Thierry Maudelonde1, Alain Mangé1
1Hôpital Arnaud de Villeneuve, Inserm U540, 191,
avenue du Doyen Giraud, 34295 Montpellier Cedex 5
2Institut de génomique fonctionnelle, CNRS UMR 5203,
Inserm U661, 141, rue de la Cardonille, 34094 Montpellier Cedex
5
Article reçu le 18 Février 2005, accepté le 24 Mai 2005
Durant les dernières décennies, les connaissances en biologie des
cancers ont considérablement évolué. Cependant, les retombées
pratiques de ces recherches dans le domaine du dépistage, du
diagnostic, du pronostic ou des traitements sont encore trop
limitées. Ainsi, il n’existe pas de marqueur possédant une
spécificité et une sensibilité suffisantes pour avoir une utilité
en clinique pour le diagnostic précoce des cancers. C’est pourquoi
la compréhension des différentes étapes permettant le passage d’une
lésion localisée vers une tumeur invasive est particulièrement
importante car elle conditionne la prévention et la prise en charge
des cancers invasifs dont la mortalité reste élevée. Il est donc
nécessaire d’élaborer de nouvelles stratégies pour identifier les
facteurs impliqués dans les mécanismes physiologiques ou
pathologiques à l’origine de l’initiation et/ou de la progression
tumorale.Parallèlement aux innovations technologiques, de nouvelles
définitions moléculaires et fonctionnelles des tumeurs solides sont
apparues, aboutissant au concept de signature moléculaire des
tumeurs. Ces signatures seraient le reflet direct ou indirect des
événements moléculaires survenant lors du processus tumoral. Parmi
ces événements, on peut noter les polymorphismes, les méthylations
de l’ADN, les remaniements chromosomiques ou les fluctuations du
niveau d’expression des ARNm ou des protéines. Ils peuvent devenir
les biomarqueurs qui, associés aux données cliniques et
anatomopathologiques, pourraient permettre un dépistage précoce des
cancers avant l’apparition des signes cliniques [1, 2].Dans le
domaine des altérations génétiques, les approches de génomique
utilisant des puces à ADN ont permis d’identifier un nombre très
élevé d’événements moléculaires et d’analyser les variations de
l’expression génique associée à la tumorogenèse. Cependant, le
niveau de l’expression des ARNm n’est pas forcément le reflet de la
nature de l’ensemble des protéines contenues dans la cellule
tumorale. La traduction des ARNm en protéines est en effet soumise
à un grand nombre de régulations post-transcriptionnelles et
post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation,
acétylation…) dont le rôle est déterminant pour le pouvoir
oncogénique. Ainsi, la mesure directe du niveau d’expression
protéique pourrait rendre compte, de manière plus efficace, d’un
dysfonctionnement cellulaire au cours du processus pathologique
[1].Le terme de protéome a été proposé en 1995 par M.R. Wilkins
comme étant l’ensemble des protéines exprimées par le génome à un
instant donné et dans un environnement donné. Ce concept a donné
naissance à un nouveau champ de recherche baptisé
« protéomique » qui vise à caractériser des mécanismes
biologiques en identifiant les différentes entités protéiques
impliquées. Cette analyse, au sens large, des protéines permet non
seulement l’étude dynamique de l’expression protéique et des
modifications post-traductionnelles mais également d’identifier les
différentes protéines de complexes multiprotéiques. En
cancérologie, ces approches sont essentielles pour la découverte,
l’identification et la validation de nouveaux biomarqueurs et donc
pour une meilleure compréhension des mécanismes biologiques du
développement tumoral (initiation, progression tumorale et
dissémination métastatique). L’analyse du protéome est fondée sur
le couplage de trois technologies : une méthode de séparation
résolutive des protéines en fonction de différents critères
physicochimiques (masse, pI, hydrophobicité…), la spectrométrie de
masse (MS) et des outils bio-informatiques. Ainsi peut-on disposer
simultanément de l’identification des protéines à partir des
données de la MS et de l’analyse quantitative de leur
expression.L’analyse en gel bidimensionnel, couplée à la
spectrométrie de masse Maldi-Tof, est une des techniques les plus
utilisées [3]. Elle reste à ce jour la méthode la plus résolutive
pour séparer un mélange complexe de protéines et comparer les
variations d’expression des protéines entre des tissus normaux et
cancéreux. L’identification des protéines d’intérêt est réalisée à
partir de leur empreinte peptidique massique obtenue après
digestion dans le gel par la trypsine. Cette approche a été
utilisée pour identifier des biomarqueurs potentiels dans les
cancers hépatiques, du sein, de l’ovaire, du poumon, de la
prostate, du côlon ou des glioblastomes dans plus de 200 études
depuis 1987. Bien que l’analyse en gel bidimensionnel ait fait ses
preuves dans de nombreux domaines, elle présente plusieurs
limitations, notamment pour son application en clinique. Récemment,
les progrès en nanotechnologies fondés sur des méthodes de
chromatographie liquide ou de surface ont permis l’émergence de
nouvelles techniques d’analyses protéomiques à haut débit
appliquées aux pathologies humaines [4-9].Dans cette revue, nous ne
détaillerons pas l’ensemble de ces technologies. En revanche, nous
nous focaliserons sur l’approche qui associe la chromatographie
d’affinité de surface et la spectrométrie de masse : elle nous
semble, à ce jour, la mieux adaptée aux contraintes liées à la
protéomique clinique.
Méthode d’analyse protéomique par « puces » à
protéines (ProteinChip®) ou Seldi-Tof
Récemment, des avancées méthodologiques en spectrométrie de masse
ont ouvert des perspectives intéressantes pour l’identification de
nouveaux marqueurs tumoraux, notamment pour l’établissement d’un
simple profil protéique spécifique qui serait suffisant pour le
diagnostic précoce de pathologies cancéreuses. Parmi celles-ci, la
technologie Seldi-Tof (surface enhanced laser desorption
ionisation-time of flight), développée par la société Ciphergen
Biosystems Inc., permet la séparation, la détection et l’analyse
des protéines directement à partir d’échantillons biologiques
variés : cultures cellulaires, sérum, plasma, urine, liquides
d’aspiration ou extraits tissulaires. En pratique, quelques
microgrammes de protéines sont directement adsorbés sur une surface
de 2 mm2 (spot) présentant des propriétés
chromatographiques variées. Le mélange protéique subit alors un
fractionnement qui dépend de ses propriétés physicochimiques
(anionique, cationique, hydrophobe, hydrophile ou affinité pour les
métaux) ou biologiques (liaison à un anticorps, un peptide, un
récepteur, un ligand ou un acide nucléique) de la surface
chromatographique utilisée. Après une série d’étapes de lavage, la
« puce » à protéines est analysée en spectrométrie de
masse en temps de vol. Après ionisation et désorption des protéines
sous l’action d’un laser, on obtient un spectre de masse
représentant l’intensité des protéines fixées sur la puce en
fonction du rapport de la masse sur la charge (m/z) (( figure 1 )). Ces spectres
sont ensuite normalisés et calibrés afin de limiter les différents
biais dus à l’instrumentation ou à l’expérimentateur. La
combinaison des différentes surfaces chromatographiques disponibles
permet d’obtenir une vue d’ensemble des peptides et des protéines
présents dans un échantillon donné. Sur la base de ces profils, un
logiciel permet de repérer les pics protéiques, de comparer
simplement deux à trois groupes de spectres et d’isoler des
protéines dont l’expression est clairement différente d’un groupe à
l’autre. L’analyse différentielle et statistique plus poussée de
l’ensemble des données issues d’un groupe témoin et d’un groupe
pathologique est une des étapes les plus importantes de l’étude
protéomique. Le traitement de plusieurs centaines de spectres est
réalisé à partir d’algorithmes informatiques fondés sur des
analyses statistiques multivariées (analyse discriminante,
classification hiérarchique…). Ces algorithmes permettent
d’analyser des données complexes et d’extraire la meilleure
combinaison de marqueurs capables de différencier chacun des
groupes patient-témoin.
En résumé, cette plate-forme présente de nombreux avantages pour
une application en clinique en raison de sa simplicité
d’utilisation, de sa sensibilité de l’ordre du femtomole et de sa
capacité d’analyse à haut débit à partir de faibles quantités de
protéines et de mélanges complexes. Elle est toutefois limitée par
la gamme de masse protéique analysable et sa capacité
d’identification des marqueurs potentiels réduite. En effet, cette
identification nécessite des étapes de purification supplémentaires
par des méthodes chromatographiques et/ou électrophorétiques
classiques et une analyse par des techniques de MS plus résolutives
(Maldi-Tof ou MS/MS).
Applications cliniques de la technologie Seldi-Tof
Concept de signature tumorale
Très rapidement, les premiers résultats issus de la technologie
Seldi-Tof ont concerné les pathologies cancéreuses, en particulier
la recherche de marqueurs diagnostiques pour le développement de
tests non invasifs. Bien que de nombreux types d’échantillons
protéiques aient été testés, des progrès substantiels ont été faits
à partir du sérum qui représente une source potentiellement
importante de nouveaux marqueurs.
Dès le début, de nombreux auteurs ont suggéré qu’un simple
profil protéique spécifique pourrait être suffisant pour le
diagnostic précoce des cancers. Un des premiers groupes à suggérer
cette hypothèse a été l’équipe de Petricoin et Liotta qui, en 2002,
a réalisé une étude à partir du sérum de malades atteints de cancer
de l’ovaire [10]. Dans une première phase, les auteurs ont pu
identifier un profil protéique constitué d’une combinaison de 5
marqueurs à partir de 50 sérums de femmes atteintes de cancer de
l’ovaire à différents stades et 50 sérums de femmes témoins
analysés sur des surfaces hydrophiles. Dans une deuxième phase de
validation, l’analyse de 116 sérums en aveugle (66 sérums témoins
et 50 sérums pathologiques) a confirmé l’intérêt de ce profil qui
permet de dépister, à partir d’un simple échantillon sanguin, des
cancers de l’ovaire dès le stade I avec une sensibilité de
100 %, une spécificité de 95 % et une valeur prédictive
positive de 94 % pour la population étudiée. Bien que ces
résultats puissent être discutés dans le cadre d’un diagnostic de
masse de la population générale [11], ils ont été présentés, au
moment de leur parution, comme une avancée significative pour le
diagnostic du cancer de l’ovaire, souvent détecté à des stades
avancés du processus tumoral (stade métastatique). En utilisant un
spectromètre de masse à haute résolution, la même équipe a pu par
la suite reproduire ces résultats à partir de 43 sérums témoins et
68 sérums pathologiques (dont 18 stades I) avec une sensibilité et
une spécificité de 100 % [12]. De plus, l’utilisation de
surfaces chromatographiques différentes permet d’obtenir des
profils protéiques différents. Ainsi, l’analyse de 184 sérums (109
issus de femmes atteintes de cancer de l’ovaire à différents
stades) sur une surface anionique a permis d’établir trois profils
protéiques capables de différencier les sérums de stades I de
tumeurs bénignes et de témoins avec une sensibilité et une
spécificité comprises entre 72 et 95 % [13].
Le cancer de la prostate a été un des premiers cancers, avec
celui de l’ovaire, à avoir été étudié par des approches Seldi-Tof.
En effet, bien que l’antigène prostatique spécifique (PSA) soit un
des très rares marqueurs biologiques utilisés en routine pour le
dépistage et le diagnostic des cancers de la prostate, ce marqueur
génère un certain nombre de faux positifs entraînant des biopsies
inutiles. Comme pour le cancer de l’ovaire, l’analyse de 326 sérums
issus de 167 patients atteints de cancer de la prostate, 77
patients atteints d’hypertrophie bénigne et 82 témoins, a permis
d’établir un profil protéique spécifique capable de distinguer les
différents groupes avec une sensibilité de 83 %, une
spécificité de 97 % et une valeur prédictive positive de
96 % pour la population étudiée et de 91 % pour la
population générale [14]. Plusieurs groupes indépendants ont pu
obtenir des signatures protéiques avec une spécificité comprise
entre 85 et 100 %, supérieure à celle du 71 % de la PSA
(tableau 1( Tableau 1 )).
Les applications de la technologie Seldi-Tof ne sont évidemment
pas limitées à ces deux seuls cancers et beaucoup d’autres exemples
pourraient être donnés. En effet, des résultats similaires ont été
obtenus par la suite pour les cancers colorectaux, du sein, du
foie, de la vessie, du pancréas, du rein ou des mélanomes à partir
d’échantillons variés comme du sérum, des biopsies, des tissus
microdisséqués, de l’urine ou d’autres fluides biologiques (tableau
1).
Tableau 1 Principales études utilisant la technologie
Seldi-Tof pour la détection de marqueurs tumoraux
|
Type de cancer
|
Échantillon
|
Référence
|
|
Ovaire
|
Sérum
|
[10, 12, 13, 15, 16, 38]
|
|
Prostate
|
Sérum
|
[14, 20, 39-42]
|
|
Tissu
|
[43, 44]
|
|
Sein
|
Sérum
|
[45-48]
|
|
Liquide d’aspiration mammelonaire
|
[49-51]
|
|
Pancréas
|
Sérum
|
[52]
|
|
Sécrétion pancréatique
|
[17]
|
|
Poumon
|
Tissu
|
[53, 54]
|
|
Rein
|
Urine
|
[18, 55]
|
|
Sérum
|
[56]
|
|
Sphère ORL
|
Sérum
|
[57, 58]
|
|
Tissu
|
[59]
|
|
Foie
|
Tissu
|
[60]
|
|
Sérum
|
[19]
|
|
Mélanome
|
Sérum
|
[61]
|
|
Vessie
|
Urine
|
[18]
|
|
Colorectal
|
Tissu
|
[62]
|
|
Culture cellulaire
|
[63]
|
|
Sérum
|
[64]
|
|
Col de l’utérus
|
Tissu
|
[65]
|
Marqueurs biologiques identifiés par Seldi-Tof
Jusqu’à présent, peu d’efforts ont été faits pour l’identification
précise des protéines spécifiques constituant les signatures
tumorales obtenues par Seldi-Tof. Cette identification présente
plusieurs intérêts, notamment lors de la phase de découverte des
biomarqueurs, en permettant une étape de validation supplémentaire
par des méthodes indépendantes de type immunologique (Elisa) et en
augmentant la valeur prédictive de la signature moléculaire [15].
De façon étonnante, dans les quelques cas où la caractérisation des
marqueurs a été effectuée, les protéines identifiées correspondent
à des protéines majoritaires du sérum. Il s’agit par exemple de
l’apolipoprotéine A1, de la transthyrétine, de l’α-antitrypsine
dans le cancer de l’ovaire [15], de l’α-haptoglobine dans une autre
étude sur le cancer de l’ovaire [16], de l’hepatocarcinoma
intestine-pancreas/pancreatitis-associated protein-1 dans le cancer
du pancréas [17], des α1 et α2-défensines dans le cancer de la
vessie [18], d’un fragment de la vitronectine dans le cancer du
foie [19] ou encore d’une protéine de liaison à la vitamine D dans
le cancer de la prostate [20]. Une des questions posées est de
savoir si ces marqueurs ont leur expression altérée spécifiquement
en réponse à la prolifération tumorale ou de manière non spécifique
en réponse à des épiphénomènes tels que l’état général du patient
ou d’un processus inflammatoire [21-23]. Pour certains de ces
marqueurs, comme l’apolipoprotéine A1 et la transthyrétine dans le
cancer de l’ovaire, l’altération de leur expression semble
spécifique au cancer étudié et ne se retrouve pas dans d’autres
cancers [15]. De façon intéressante, certains des marqueurs
identifiés par Seldi-Tof sont des formes clivées de protéines
sériques de plus haut poids moléculaire [15]. Ces résultats, déjà
observés par l’équipe de Liotta, avaient conduit ce dernier à
suggérer que l’abondance de ces marqueurs clivés était le reflet
direct d’événements pathologiques [24, 25]. Dans cette hypothèse,
le microenvironnement tumoral serait capable de générer une
signature protéique unique détectable dans le sang une fois les
fragments passés dans la circulation générale. Des études récentes
supportent cette hypothèse en montrant que l’équilibre entre des
protéases et leurs inhibiteurs cellulaires est modifié dans le
sérum et le tissu des patients en réponse à la prolifération
tumorale. Ainsi, différentes familles de protéases comme les
métalloprotéases ou les kallikréines plasmatiques et tissulaires
voient leur expression augmenter ou diminuer dans certains cancers
[26-29]. Ces modifications de l’expression auraient alors un
retentissement direct sur la capacité des protéases à cliver des
protéines sériques et à générer ainsi une signature moléculaire
spécifique.
Défis futurs et développement de la technologie Seldi-Tof
Comme toute technologie émergente, l’approche Seldi-Tof doit faire
face à un certain nombre de critiques, notamment concernant ses
limitations réelles ou supposées. Parmi ces critiques, des
méta-analyses réalisées à partir des données issues de plusieurs
études indépendantes sur une même pathologie suggèrent que
l’approche Seldi-Tof est peu reproductible d’un laboratoire à
l’autre [30, 31]. Plusieurs paramètres peuvent affecter la
reproductibilité, notamment le recueil, le traitement et la
conservation des échantillons, la classification des groupes de
patients, leur statut hormonal, leurs habitudes alimentaires, les
traitements médicamenteux, sans parler des biais dus à
l’expérimentation. [21]. Cependant, il est apparu que
l’établissement des profils protéiques était très dépendant des
algorithmes informatiques utilisés dans les différentes études. Il
est clair que des étapes de validation et surtout de
standardisation seront nécessaires pour les rendre utilisables en
clinique à l’instar de ce qui se fait pour les tests
immunologiques. Une étude récente sur le cancer de l’ovaire prend
en compte ces paramètres de validation et de standardisation [15].
Cette étude multicentrique implique cinq laboratoires indépendants
avec des protocoles standardisés permettant une validation croisée
et indépendante des résultats. Près de 500 sérums ont ainsi été
analysés lors des différentes phases de découverte et de validation
des profils protéiques. Les résultats montrent que des profils
fiables et reproductibles peuvent être obtenus si les protocoles
pour le recueil des échantillons, leur analyse et leur
interprétation sont bien définis. La deuxième critique majeure de
l’approche Seldi-Tof, qui a fait l’objet d’une controverse récente,
concerne sa capacité à détecter des protéines très faiblement
exprimées dans le sérum [32, 33]. Dans les cas où les marqueurs
découverts par Seldi-Tof ont été identifiés, les concentrations
sériques des marqueurs sont rarement inférieures à un microgramme
par millilitre alors que les marqueurs tumoraux usuels sont à des
concentrations 100 à 1 000 fois plus faibles. C’est le cas, par
exemple de la PSA qui fait partie des protéases dont l’expression
augmente dans les cancers de la prostate [34] et qui n’a cependant
jamais été identifiée dans les différentes études par Seldi-Tof de
ce cancer. Cette limitation ne remet cependant pas en cause
l’intérêt du Seldi comme plate-forme de protéomique clinique. En
effet, il s’agit moins d’une limitation de cette technologie que
d’une limitation des techniques de préparation de l’échantillon
avant toute analyse protéomique quelle qu’elle soit. Dans le sérum,
l’albumine et les immunoglobulines représentent à elles seules près
de 90 % des protéines totales du sérum. Le rapport entre ces
protéines majoritaires et les protéines les plus faiblement
représentées peut alors atteindre 106 à 109,
rendant la détection de ces dernières très difficile malgré une
bonne sensibilité de la technique Seldi-Tof (( figure 2 )). Il existe
plusieurs méthodes qui permettent d’augmenter la concentration
relative des protéines faiblement représentées dans le sérum. Elles
requièrent des étapes de fractionnement, de chromatographie, de
précipitation sélective ou de déplétion des protéines majoritaires
[8, 35-37]. Ces techniques « d’enrichissement » doivent,
pour être efficaces, éviter d’introduire des biais supplémentaires
dans l’analyse protéomique ultérieure. La détection de cette
fraction inexplorée du sérum, véritable face cachée de l’iceberg,
est un des défis technologiques qu’il faudra relever pour le
développement de tests diagnostiques des formes précoces des
cancers.
Conclusion
Les nouvelles technologies d’analyse protéomique prennent leur
place dans l’ère post-génomique. Ces approches appliquées à la
cancérologie ont suscité des espoirs et des polémiques mais les
concepts biologiques qui les sous-tendent devraient permettre une
meilleure compréhension des systèmes biologiques complexes que sont
les processus cancéreux. Les premiers résultats issus de la
technologie Seldi-Tof laissent présager de nombreux développements
au niveau fondamental, clinique et pharmacologique, en particulier
pour l’identification de profils protéiques diagnostiques ou
pronostiques des cancers ou permettant de mieux caractériser des
groupes à risques évolutifs ou de réponse aux traitements. À
l’instar du programme visant à établir la carte d’identité des
tumeurs humaines par l’analyse du transcriptome, l’approche
protéomique devrait faire l’objet de programmes nationaux concertés
pour concrétiser dans les meilleurs délais la caractérisation de
nouveaux marqueurs et le développement de tests non invasifs
prédictifs et diagnostiques des formes précoces de cancer.
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