Oncogenes and thyroid tumors

ARTICLE

Auteur(s) :, Ludovic Lacroix^*, Jean Charles Soria, Jean Michel Bidart, Martin Schlumberger

Institut Gustave-Roussy, 94805 Villejuif Cedex

Article reçu le 2 Novembre 2004, accepté le 1 Decembre 2004

Altérations géniques dans les tumeurs thyroïdiennes

Voies de transduction du signal

De nombreux récepteurs à activité tyrosine kinase activent plusieurs voies de signalisation dont la voie des MAP kinases et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3 kinase). Ces voies régulent la croissance cellulaire, la progression dans le cycle cellulaire et la mort cellulaire.

Plusieurs récepteurs à activité tyrosine kinase sont surexprimés dans les cancers de la thyroïde, notamment le récepteur du fibroblast growth factor (FGF), de l’epidermal growth factor (EGF), de l’hepatocyte growth factor (c-Met), du vascular endothelial growth factor (VEGF), de l’insuline et de l’insulin-growth factor 1 (IGF1). Le récepteur de l’EGF est en général exprimé dans les tumeurs différenciées de la thyroïde et sa surexpression est associée à un pronostic péjoratif. La surexpression de Her2/neu dans certains cancers papillaires est associée à la survenue de métastases.

Les protéines/sérine/thréonine kinases intracellulaires sont appelées mitogen-activated protein kinases (MAPK) ou extracellular signal-regulated kinases (ERK). Schématiquement, la cascade intracellulaire comprend le récepteur à activité tyrosine kinase, la protéine ras, la protéine raf qui phosphoryle et active la MAPK kinase MEK1/2 qui, à son tour, active les MAPK ERK1 et 2. ERK1 et 2 phosphorylent et activent plusieurs protéines qui régulent les protéines du cytosquelette, le métabolisme, la structure de la chromatine et l’expression de nombreux facteurs de transcription.

Le PI3 kinase phosphoryle le phospho-inositol qui peut activer des protéines comme la sérine/thréonine kinase Akt. Akt activée phosphoryle de multiples protéines, dont mTOR (mammalian target of rapamycin) qui stimule la progression dans le cycle cellulaire et la croissance cellulaire. Le gène suppresseur de tumeur PTEN (phosphatase and tensin homolog) peut déphosphoryler les lipides phosphorylés par la PI3K kinase, ce qui inhibe Akt.

Oncogène RET/PTC

• – RET/PTC₁, formé par un réarrangement intrachromosomique qui fusionne le domaine tyrosine kinase de RET avec le gène H4 ;
• – RET/PTC_2, formé par un réarrangement interchromosomique avec un gène situé sur le chromosome 17 qui code pour la sous-unité RIα régulatrice de la protéine kinase A ;
• – RET/PTC₃, formé par un réarrangement intrachromosomique avec le gène RFG/ELE1.

Les points de fusion de ces réarrangements sont situés dans la même région intronique de RET, entre les exons 11 et 12. Des réarrangements plus rares ont été décrits qui diffèrent soit par leur point de fusion, soit par leur gène partenaire.

Dans les cancers papillaires de l’adulte, en l’absence d’irradiation cervicale pendant l’enfance, la fréquence des réarrangements RET/PTC est de 2,5 à 35 %, selon les études. Cette fréquence est plus élevée dans les cancers papillaires des enfants survenus en l’absence d’irradiation cervicale antérieure et chez les sujets, enfants ou adultes, ayant été exposés aux rayonnements ionisants pendant l’enfance, aussi bien lors d’une irradiation externe que lors de la contamination survenue après l’accident de Tchernobyl. Les réarrangements RET/PTC sont trouvés chez 55 à 85 % de ces sujets [3]. Les réarrangements intrachromosomiques RET/PTC₁ et RET/PTC₃ sont les plus fréquents ; après l’accident de Tchernobyl, le réarrangement RET/PTC₃ est le plus fréquent dans les cancers papillaires agressifs survenus précocement, le réarrangement RET/PTC₁ étant le plus fréquent dans les formes classiques de cancer papillaire survenues plus tardivement. De plus, ces réarrangements RET/PTC ont été mis en évidence dans 45 % des adénomes folliculaires survenus après irradiation cervicale pendant l’enfance.

La présence de réarrangements RET/PTC dans les microcancers papillaires suggère qu’il s’agit d’un événement précoce de la tumorogenèse thyroïdienne. La transfection de RET/PTC provoque une dédifférenciation et permet une croissance tumorale indépendante de la TSH. Les souris transgéniques pour lesquelles l’expression de RET/PTC est ciblée dans la thyroïde développent des cancers papillaires. L’irradiation in vitro de cellules thyroïdiennes ou de thyroïdes fœtales provoque des réarrangements RET/PTC. La survenue fréquente de réarrangements RET/PTC lors d’une irradiation est favorisée par la proximité spatiale des gènes partenaires (RET et H4) pendant l’interphase, ce qui donne naissance au réarrangement RET/PTC₁. Les points de cassure des gènes RFG/ELE1 et RET qui résultent dans la formation de RET/PTC₃ sont compatibles avec une cassure double brin, suivie d’une recombinaison réciproque illégitime. Ces données suggèrent que les radiations ionisantes peuvent provoquer directement un réarrangement RET/PTC et ainsi provoquer le processus tumoral. Il est possible que des cassures double brin suivies de recombinaisons soient fréquentes dans les cellules folliculaires des jeunes enfants et que l’irradiation ne fasse qu’augmenter cette tendance.

Oncogènes TRK et MET

Le protooncogène MET code pour un récepteur membranaire à activité tyrosine kinase dont le ligand est l’hepatocyte growth factor (HGF) ou scatter factor (SF). HGF-SF est un puissant mitogène pour les cellules épithéliales qui favorise la motilité cellulaire et l’invasion tumorale. Le protooncogène MET est surexprimé dans 50 % des cancers papillaires, alors que son expression est diminuée dans les autres formes histologiques de cancers de la thyroïde.

Oncogènes RAS et B-RAF

Les mutations ponctuelles des gènes RAS ont été mises en évidence dans 30 à 40 % des cancers folliculaires et dans 20 % des adénomes folliculaires [2, 6]. Elles sont rares dans les cancers papillaires, hormis dans le variant folliculaire où elles sont fréquentes. Les trois gènes RAS (H, K et N) peuvent être activés. La mutation N-RAS dans le codon 61 est la plus fréquente. L’activation de l’oncogène RAS provoque une dédifférenciation des thyrocytes de manière dose-dépendante [7]. Les mutations RAS sont trouvées avec une fréquence identique dans les tumeurs spontanées et dans celles survenues après exposition aux radiations ionisantes pendant l’enfance.

Les mutations activatrices de B-RAF ont été mises en évidence dans environ 40 % (29 à 69 %) des cancers papillaires de l’adulte, mais n’ont pas été trouvées dans les autres types histologiques de tumeurs différenciées de la thyroïde (tableau 1( Tableau 1 )). Elles sont rares dans le variant folliculaire des cancers papillaires et dans les cancers papillaires de l’enfant survenus soit spontanément, soit après irradiation cervicale. Parmi la trentaine de mutations décrites dans le domaine kinase, la mutation V600E (valine → glutamine) est la plus fréquente dans la thyroïde. Elle correspond à la substitution d’une thymine par une adénine en position 1799 dans l’exon 15 de BRAF (anciennement T1796A ou V599E). Les mutations de l’exon 11 sont rares dans la thyroïde. Dans les cancers papillaires, la présence d’une mutation RAS, B-RAF ou d’un réarrangement RET/PTC est exclusive et une de ces mutations est présente dans environ 70 % de ces tumeurs. La mutation B-RAF est présente dans les microcancers papillaires de la thyroïde ; elle représente donc une étape précoce de la tumorogenèse. Elle est présente dans des cancers plus agressifs, dont le stade est avancé au diagnostic et dont la transformation en cancer anaplasique est possible. Les souris transgéniques pour lesquelles l’expression de B-RAF muté est ciblée dans la thyroïde développent des cancers papillaires agressifs qui peuvent se transformer en cancer anaplasique [8].
Tableau 1 Études de BRAF dans les tumeurs thyroïdiennes [12-27]

Réarrangement PAX8-PPARγ1

Mutation du récepteur pour la TSH (TSH-R) et de l’oncogène GSP

Des mutations activatrices de l’un des deux codons critiques de la sous-unité α de la protéine Gs (appelée gsp) sont présentes dans 7 à 38 % des adénomes hyperfonctionnels. Le rôle de ces mutations est confirmé par l’étude des souris transgéniques chez qui l’expression de gsp est ciblée dans la thyroïde et qui développent des nodules thyroïdiens hyperfonctionnels.

Dans 40 % des adénomes hyperfonctionnels, aucune mutation de l’un de ces deux gènes n’a été mise en évidence et il est possible qu’une mutation existe au niveau d’un autre gène intervenant dans la voie de l’AMPc.

Une mutation gsp ou du TSH-R est présente dans 10 % environ des cancers folliculaires hypofonctionnels, dont l’activité adénylate cyclase basale est élevée, suggérant leur participation à la tumorigenèse thyroïdienne.

Autres anomalies

Les mutations du gène APC (adenomatous polyposis colonic) contribuent au développement des cancers papillaires de la thyroïde en cas de polypose colique familiale, mais ont probablement un rôle restreint en cas de cancer papillaire sporadique. Le rôle des anomalies du gène PTEN est hypothétique.

De nombreuses anomalies de contrôle du cycle cellulaire ont été décrites dans les tumeurs thyroïdiennes. Elles impliquaient, entre autres, des hyperméthylations du promoteur de p16^ink4, des surexpressions de la cycline D1 ou des mutations de Rb [10, 11].

Plusieurs conclusions peuvent être déduites de ces études :

• – En l’absence d’irradiation cervicale pendant l’enfance, les altérations des récepteurs membranaires à activité tyrosine kinase (RET/PTC, TRK, MET) sont présentes uniquement dans les cancers papillaires ; après irradiation, les réarrangements RET/PTC sont plus fréquents dans les cancers papillaires et ont été mis en évidence dans des adénomes. La surexpression de MET pourrait être un événement secondaire. Les mutations de RAS et de BRAF interviennent dans la voie des MAP kinases qui transduit le signal à partir des récepteurs membranaires. Ces mutations sont exclusives et sont trouvées dans 70 % des cancers papillaires de la thyroïde.
• – Les mutations activatrices des gènes RAS sont présentes dans 20 à 40 % des tumeurs folliculaires bénignes et malignes et sont considérées comme un événement précoce de la tumorigenèse folliculaire. De plus, l’instabilité génétique induite par les mutations RAS pourrait faciliter la survenue d’autres anomalies qui sont nécessaires à la progression tumorale et à la détermination du type histologique.
• – Les translocations PPARγ/PAX8 sont présentes uniquement dans les tumeurs folliculaires bénignes et malignes et ont vraisemblablement un rôle important dans la tumorigenèse folliculaire.
• – Les mutations ponctuelles activatrices des gènes du TSH-R et de la protéine Gαs sont présentes dans 60 % des adénomes hyperfonctionnels ; leur rôle dans la survenue des nodules hypofonctionnels n’est pas établi.
• – Les mutations du gène de la p53 ne sont présentes que dans les cancers peu différenciés ou anaplasiques ; elles ont un rôle essentiel dans la transformation anaplasique.
• – Les altérations de plusieurs gènes sont observées dans moins de 5 % des tumeurs. Cette faible fréquence suggère un rôle alternatif de ces anomalies dans la tumorigenèse épithéliale.

D’autres anomalies peuvent avoir un rôle important dans la tumorigenèse. Des anomalies de la méthylation de l’ADN peuvent modifier l’expression de certains gènes. Le rôle de la télomérase est mal connu.

Ces anomalies s’accompagnent de modifications de l’expression des gènes fonctionnels de la thyroïde, notamment du symporteur de l’iode (le NIS) et de la peroxydase, en accord avec la diminution de la fixation d’iode observée dans ces tumeurs. Les mécanismes qui provoquent la diminution de l’expression de ces gènes sont encore mal connus et passent probablement par une inactivation des facteurs de transcription spécifiques de la thyroïde.

Plusieurs auteurs proposent, à partir des différentes anomalies décrites dans les tumeurs thyroïdiennes, des modèles de tumorigenèse (( figure 1 )). Les événements précoces sont associés à la présence de mutations RAS, BRAF ou de translocations RET/PTC, NTRK, PAX8-PPARγ en fonction du type histologique. L’évolution vers le cancer est associée à l’accumulation d’événements secondaires complémentaires à ces anomalies. Les candidats sont nombreux, entre autres : p16^ink4 cycline D1, Rb, MET, PTEN, Akt, BCL2. L’ultime étape de la progression serait le cancer anaplasique fortement lié à la présence de mutations du gène suppresseur de tumeur p53.

D’autres anomalies génétiques, suggérées par des anomalies chromosomiques, peuvent également exister. Les études actuelles du transcriptome et du protéome vont rapidement accroître les connaissances dans ce domaine.

Applications diagnostiques et thérapeutiques

Applications diagnostiques

Applications thérapeutiques

Certains agents non spécifiques (analogues de l’acide rétinoïque, agents déméthylants tels que la 5-azacytidine et la 5-aza-2’-deoxycytidine, inhibiteurs de l’histone déacétylase tels que l’acide superoylanilide hydroxamique) visent à réexprimer les gènes impliqués dans le métabolisme de l’iode dans la thyroïde. C’est le cas du symporteur de l’iode, dont l’expression est fortement diminuée dans la plupart des cancers. Cette approche fonctionnelle devrait permettre de mieux traiter ces patients par l’iode 131.

Les nouvelles approches thérapeutiques visent à développer des composés capables de bloquer des cibles moléculaires identifiées comme jouant un rôle clé dans le processus oncogénique. Cela est le cas des inhibiteurs des récepteurs membranaires à activité tyrosine kinase, incluant les anticorps monoclonaux dirigés contre l’EGF-R ou contre Her2/neu et des petites molécules dirigées contre le domaine tyrosine kinase de EGF-R. De la même manière, des inhibiteurs des protéines de la voie des MAP kinases, incluant des inhibiteurs de l’activité tyrosine kinase de RET, des inhibiteurs de la farnésyltransférase (FTI) — qui prévient la translocation de la protéine ras activée à la membrane cytoplasmique — de B-RAF ou de MEK sont en cours d’étude dans les cancers papillaires de la thyroïde. Enfin, d’autres agents sont également en cours de développement : analogues de la rapamycine qui inhibent mTOR et ainsi la voie PI3K-Akt, inhibiteurs de Hsp 90, la heat shock protein de 90 kD, molécule chaperon impliquée dans l’activation et la stabilisation de raf1 et de Akt (geldanamycine et son dérivé le 17-N-allyl-amino-17-deméthoxy-geldanamycin ou 17-AAG). Finalement, l’intérêt se porte aussi sur les molécules destinées à interférer avec certains processus tels que l’angiogenèse ou l’apoptose.

Références

2 Fagin JA. Challenging dogma in thyroid cancer molecular genetics. Role of RET/PTC and BRAF in tumor initiation. J Clin Endocrinol Metab 2004 ; 89 : 4264-6.

3 Williams ED. Cancer after nuclear fallout : lessons from the Chernobyl accident. Nature Rev 2002 ; 2 : 543-9.

4 Pierotti MA, Bongarzone I, Borrello MG, Greco A, Pilotti S, Sozzi G. Cytogenetics and molecular genetics of carcinomas arising from thyroid epithelial follicular cells. Genes Chromosom Cancer 1996 ; 16 : 1-14.

5 Kroll TG, Sarraf P, Pecciarini L, Chen CJ, Mueller E, Spiegelman BM, et al. PAX8-PPARγ1 fusion oncogene in human thyroid carcinoma. Science 2000 ; 289 : 1357-60.

6 Vasko V, Ferrand M, Di Cristofaro J, Carayon P, Henry JF, De Micco C. Specific pattern of RAS oncogene mutations in follicular thyroid tumors. J Clin Endocrinol Metab 2003 ; 88 : 2745-52.

7 De Vita G, Bauer L, Correa Da Costa VM, De Felice M, Baratta MG, et al. Dose-dependent inhibition of thyroid differentiation by Ras oncogenes. Mol Endocrinol 2005 ; 19 : 76-89.

8 Knauf JA, Ma X, Smith EP, Zhang L, Mitsutake N, Nikiforov YE, et al. Targeted expression of BRAF-V600E in thyroid cells of trangenic mice results in papillary thyroid cancers that transition to undifferentiated carcinomas. Vancouver : ATA, 2004.

9 Van Sande J, Parma J, Tonacchera M, Swillens S, Dumont JE, Vassart G. Genetic basis of endocrine disease. Somatic and germline mutations of the TSH receptor gene in thyroid diseases. J Clin Endocrinol Metab 1995 ; 80 : 2577-85.

10 Boltze C, Zack S, Quednow C, Bettge S, Roessner A, Schneider-Stock R. Hypermethylation of the CDKN2/p16INK4A promotor in thyroid carcinogenesis. Pathol Res Pract 2003 ; 199 : 399-404.

11 Zou M, Shi Y, Farid NR, Al-Sedairy ST. Inverse association between cyclin D1 overexpression and retinoblastoma gene mutation in thyroid carcinomas. Endocrine 1998 ; 8 : 61-4.

12 Kimura ET, Nikiforova MN, Zhu Z, Knauf JA, Nikiforov YE, Fagin JA. High prevalence of BRAF mutations in thyroid cancer : genetic evidence for constitutive activation of the RET/PTC-RAS-BRAF signaling pathway in papillary thyroid carcinoma. Cancer Res 2003 ; 63 : 1454-7.

13 Cohen Y, Xing M, Mambo E, Guo Z, Wu G, Trink B, et al. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma. J Natl Cancer Inst 2003 ; 95 : 625-7.

14 Xu X, Quiros RM, Gattuso P, Ain KB, Prinz RA. High prevalence of BRAF gene mutation in papillary thyroid carcinomas and thyroid tumor cell lines. Cancer Res 2003 ; 63 : 4561-7.

15 Namba H, Nakashima M, Hayashi T, Hayashida N, Maeda S, Rogounovitch T, et al. Clinical implication of hot spot BRAF mutation, V599E, in papillary thyroid cancers. J Clin Endocrinol Metab 2003 ; 88 : 4393-7.

16 Fukushima T, Suzuki S, Mashiko M, Ohtake T, Endo Y, Takebayashi Y, et al. BRAF mutations in papillary carcinomas of the thyroid. Oncogene 2003 ; 22 : 6455-7.

17 Nikiforova MN, Kimura ET, Gandhi M, Biddinger PW, Knauf JA, Basolo F, et al. BRAF mutations in thyroid tumors are restricted to papillary carcinomas and anaplastic or poorly differentiated carcinomas arising from papillary carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 2003 ; 88 : 5399-404.

18 Xing M, Vasko V, Tallini G, Larin A, Wu G, Udelsman R, et al. BRAF T1796A transversion mutation in various thyroid neoplasms. J Clin Endocrinol Metab 2004 ; 89 : 1365-8.

19 Cohen Y, Rosenbaum E, Clark DP, Zeiger MA, Umbricht CB, Tufano RP, et al. Mutational analysis of BRAF in fine needle aspiration biopsies of the thyroid : a potential application for the preoperative assessment of thyroid nodules. Clin Cancer Res 2004 ; 10 : 2761-5.

20 Puxeddu E, Moretti S, Elisei R, Romei C, Pascucci R, Martinelli M, et al. BRAF (V599E) mutation is the leading genetic event in adult sporadic papillary thyroid carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 2004 ; 89 : 2414-20.

21 Begum S, Rosenbaum E, Henrique R, Cohen Y, Sidransky D, Westra WH. BRAF mutations in anaplastic thyroid carcinoma : implications for tumor origin, diagnosis and treatment. Mod Pathol 2004 ; 17 : 1359-63.

22 Fugazzola L, Mannavola D, Cirello V, Vannucchi G, Muzza M, Vicentini L, et al. BRAF mutations in an Italian cohort of thyroid cancers. Clin Endocrinol (Oxf) 2004 ; 61 : 239-43.

23 Frattini M, Ferrario C, Bressan P, Balestra D, De Cecco L, Mondellini P, et al. Alternative mutations of BRAF, RET and NTRK1 are associated with similar but distinct gene expression patterns in papillary thyroid cancer. Oncogene 2004 ; 23 : 7436-40.

24 Lima J, Trovisco V, Soares P, Maximo V, Magalhaes J, Salvatore G, et al. BRAF mutations are not a major event in post-Chernobyl childhood thyroid carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 2004 ; 89 : 4267-71.

25 Kumagai A, Namba H, Saenko VA, Ashizawa K, Ohtsuru A, Ito M, et al. Low frequency of BRAFT1796A mutations in childhood thyroid carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 2004 ; 89 : 4280-4.

26 Nikiforova MN, Biddinger PW, Caudill CM, Kroll TG, Nikiforov YE. PAX8-PPARgamma rearrangement in thyroid tumors : RT-PCR and immunohistochemical analyses. Am J Surg Pathol 2002 ; 26 : 1016-23.

27 Marques AR, Espadinha C, Catarino AL, Moniz S, Pereira T, Sobrinho LG, et al. Expression of PAX8-PPAR gamma 1 rearrangements in both follicular thyroid carcinomas and adenomas. J Clin Endocrinol Metab 2002 ; 87 : 3947-52.

28 Cheung L, Messina M, Gill A, Clarkson A, Learoyd D, Delbridge L, et al. Detection of the PAX8-PPAR gamma fusion oncogene in both follicular thyroid carcinomas and adenomas. J Clin Endocrinol Metab 2003 ; 88 : 354-7.

29 French CA, Alexander EK, Cibas ES, Nose V, Laguette J, Faquin W, et al. Genetic and biological subgroups of low-stage follicular thyroid cancer. Am J Pathol 2003 ; 162 : 1053-60.

30 Dwight T, Thoppe SR, Foukakis T, Lui WO, Wallin G, Hoog A, et al. Involvement of the PAX8/peroxisome proliferator-activated receptor gamma rearrangement in follicular thyroid tumors. J Clin Endocrinol Metab 2003 ; 88 : 4440-5.

31 Nikiforova MN, Lynch RA, Biddinger PW, Alexander EK, Dorn 2nd GW, Tallini G, et al. RAS point mutations and PAX8-PPAR gamma rearrangement in thyroid tumors : evidence for distinct molecular pathways in thyroid follicular carcinoma. J Clin Endocrinol Metab 2003 ; 88 : 2318-621.

32 Aldred MA, Morrison C, Gimm O, Hoang-Vu C, Krause U, Dralle H, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma is frequently downregulated in a diversity of sporadic nonmedullary thyroid carcinomas. Oncogene 2003 ; 22 : 3412-6.

33 Marques AR, Espadinha C, Frias MJ, Roque L, Catarino AL, Sobrinho LG, et al. Underexpression of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) gamma in PAX8/PPARgamma-negative thyroid tumours. Br J Cancer 2004 ; 91 : 732-8.

34 Cerutti JM, Delcelo R, Amadei MJ, Nakabashi C, Maciel RM, Peterson B, et al. A preoperative diagnostic test that distinguishes benign from malignant thyroid carcinoma based on gene expression. J Clin Invest 2004 ; 113 : 1234-42.

35 Hibi Y, Nagaya T, Kambe F, Imai T, Funahashi H, Nakao A, et al. Is thyroid follicular cancer in Japanese caused by a specific t (2 ; 3) (q13 ; p25) translocation generating Pax8-PPAR gamma fusion mRNA? Endocr J 2004 ; 51 : 361-6.

36 Nakabashi CC, Guimaraes GS, Michaluart P, Ward LS, Cerutti JM, Maciel RM. The expression of PAX8-PPARgamma rearrangements is not specific to follicular thyroid carcinoma. Clin Endocrinol (Oxf) 2004 ; 61 : 280-2.

37 Lacroix L, Mian C, Barrier T, et al. PAX8 and PPARγ1 Gene expression status in benign and malignant thyroid tissues. Eur J Endocrinol 2004 ; 15 : 367-74.

38 Soares P, Trovisco V, Rocha AS, Lima J, Castro P, Preto A, et al. BRAF mutations and RET/PTC rearrangements are alternative events in the etiopathogenesis of PTC. Oncogene 2003 ; 22 : 4578-80.

39 Trovisco V, Vieira de Castro I, Soares P, Maximo V, Silva P, Magalhaes J, et al. BRAF mutations are associated with some histological types of papillary thyroid carcinoma. J Pathol 2004 ; 202 : 247-51.