Preclinical studies of oxaliplatin in combination chemotherapy

ARTICLE

L'oxaliplatine est un agent alkylant synthétisé dans les années soixante-dix [1-4] et dont la structure chimique se distingue de celle des dérivés classiques de première génération du platine par la présence d'un radical porteur cyclique « DACH » diaminocyclohexane (figure 1). Si son action est actuellement bien définie sur le plan clinique dans les cancers colorectaux [5-14], de nombreuses études récentes s'attachent encore à préciser les mécanismes spécifiques qui lui confèrent ses propriétés pharmacologiques [6, 7]. L'oxaliplatine interagit principalement au niveau de l'ADN, induisant des lésions primaires (adduits) qui bloquent la réplication de l'ADN et sa transcription en ARN [6]. Le type le plus fréquent d'adduits est représenté par les ponts intrabrins, qui établissent des liaisons covalentes irréversibles entre deux résidus guanines. Les autres types d'adduits sont les ponts interbrins et les liaisons aux protéines satellites de l'ADN [15-24]. Les types de liaisons primaires sus-décrites induites par l'oxaliplatine sont similaires à celles induites par le cisplatine, même si elles sont observées en nombre plus restreint pour une concentration molaire équivalente. Des lésions de cassure simple-brin sont également observées dans les cellules traitées par l'oxaliplatine, mais sont probablement des lésions secondaires. De manière intéressante, en dépit d'un nombre de lésions plus limité, l'oxaliplatine est aussi puissant que le cisplatine à induire in vitro l'inhibition de croissance et la survenue du processus d'apoptose cellulaire. Ce phénomène est incomplètement élucidé, et pourrait être expliqué par une structure tertiaire différente des adduits respectifs de l'oxaliplatine et du cisplatine : le caractère plus massif des adduits de l'oxaliplatine induit une distorsion conformationnelle plus importante de la double hélice d'ADN, à la fois plus efficace à bloquer sa synthèse et plus difficile à corriger par les systèmes de réparation comme celui de la réparation du mésappariement des bases. Les mécanismes impliqués dans la résistance au cisplatine et à l'oxaliplatine sont rappelés dans le tableau I.

Activité préclinique in vitro et in vivo de l'oxaliplatine

Activité antiproliférative de l'oxaliplatine in vitro

L'oxaliplatine possède in vitro un spectre d'activité particulier, qui a été individualisé par le programme informatisé Compare du National Cancer Institute [22] destiné à identifier des familles de composés sur la base de leur mécanisme d'action et de leur activité. Selon ce modèle, l'oxaliplatine s'individualise des composés classiques du platine (cisplatine et carboplatine), ce qui en fait potentiellement un agent efficace dans les tumeurs présentant une résistance primaire ou acquise au cisplatine ou au carboplatine.

L'oxaliplatine a démontré une activité cytotoxique sur de nombreuses lignées tumorales humaines, dont des lignées de cancers colique, ovarien, du sein, vésical, de mélanome malin, de gliome et de leucémies (tableau II). De façon intéressante, son activité est maintenue dans des lignées de cancers bronchique, ovarien et du col utérin résistantes au cisplatine (tableau III). De plus, alors que l'activité du cisplatine est faible dans les lignées cellulaires déficientes en système de réparation du mésappariement des bases (mismatch repair), celle de l'oxaliplatine se maintient indépendamment du statut de ce système de réparation de l'ADN [25-29]. L'activité de l'oxaliplatine in vitro est dépendante à la fois de la concentration et de la durée d'exposition, étant plus importante lorsque les cellules tumorales sont exposées pendant plus de 4 h.

Une étude récente [30] a utilisé la technique du « tumor cloning assay » qui présente l'avantage de tester l'activité d'un composé sur des colonies de cellules tumorales isolées directement à partir des patients et cultivées dans un milieu à base d'agar. Par cette technique, l'oxaliplatine est actif contre les colonies de cancers coliques, bronchique, gastrique et de mélanome malin. Enfin, il reste actif dans une proportion significative de tumeurs résistantes au carboplatine, à l'irinotecan, au paclitaxel et à la doxorubicine.

Activité antitumorale de l'oxaliplatine dans plusieurs modèles murins in vivo

Les résultats observés in vitro sont reproductibles in vivo puisque l'oxaliplatine reste efficace dans plusieurs tumeurs murines et humaines sensibles ou résistantes au cisplatine (tableau IV). Les modèles animaux ont également permis de définir le profil de toxicité lié au traitement par oxaliplatine [24, 31]. Contrairement au cisplatine qui induit une néphrotoxicité significative, l'oxaliplatine n'est néphrotoxique qu'à très fortes doses. Les toxicités habituellement observées sont hématologique et digestive (nausées et diarrhées), et ont une expression modérée. L'oxaliplatine seul a montré une activité importante dans de nombreux modèles de xénogreffes de tumeurs malignes murines et humaines [32-40].

Activité de l'oxaliplatine en association à d'autres anticancéreux in vitro

Modèle mathématique d'études pharmacologiques d'interactions in vitro

L'oxaliplatine a été étudié in vitro en association à de nombreux agents anticancéreux. Pour évaluer ses interactions pharmacologiques avec ces agents, une modélisation mathématique a été nécessaire. Les interactions pharmacologiques entre deux médicaments (et plus) peuvent être regroupées en trois catégories :

- l'absence d'interaction, également dénommée selon les cas indifférence ou additivité ;

- l'interaction positive également nommée agonisme ou synergie ;

- l'interaction négative, également nommée antagonisme.

Il faut souligner que cette terminologie a souvent été utilisée de façon non appropriée ou peu précise qualifiant les effets biologiques par des adjectifs tels que « augmentés », « bénéfiques », et « supra-additifs ». De même, des termes imprécis de « potentialisation » et « sensibilisation » ont été utilisés lorsque l'un des deux partenaires de l'association était peu actif par lui-même. De plus, la confusion persiste souvent dans la littérature en raison de l'absence de concordance entre la définition mathématique de synergie utilisée en biologie et la notion de synergie utilisée en clinique pour traduire la meilleure réponse antitumorale obtenue par l'utilisation d'une polychimiothérapie, en comparaison avec une monochimiothérapie.

Une façon d'illustrer ce problème est de rechercher pour deux médicaments (A et B) les concentrations respectives donnant le même effet biologique (iso-effet ou isobol). Cette approche a été décrite initialement par les microbiologistes et se traduit par une courbe iso-effet ou isobologramme (figure 2). La forme de la courbe reflète le type d'interaction entre A et B. Une droite, une courbe concave ou convexe sont obtenues respectivement en l'absence d'interaction, en cas d'interaction positive ou en cas d'interaction négative. L'aire sous la courbe traduira également le type d'effet observé. Quand l'un ou les deux agents considérés ne présentent pas une courbe dose-effet linéaire, il devient nécessaire de prendre en considération et de superposer les relations dose-effet obtenues avec chacun des agents séparément. Se définit alors une surface appelée enveloppe d'additivité. Ainsi, l'approche par isobologramme est limitée à des agents agissant par le même mécanisme ou ayant une cible cellulaire identique (mutually exclusive), ce qui est rarement le cas pour des agents anticancéreux. L'interprétation des résultats se complique lorsque l'on évaluera une gamme de concentrations nécessitant une modélisation mathématique.

Dans les années 1970, Chou et Talalay ont donc proposé, sur les bases des analyses d'interactions enzymatiques, d'étudier les effets résultant de l'utilisation de plusieurs anticancéreux. Ils ont basé leur modélisation sur une approche plus large, non restreinte au cas de médicaments ayant le même mode d'action (mutually non-exclusive). De plus, cette méthode peut s'étendre à l'analyse de plus de deux agents, utilisés à de multiples niveaux de doses tout en permettant une analyse relativement simple des données.

Le choix des médicaments à associer va être orienté par la nature de la molécule, son mode d'action, les mécanismes de résistance déjà identifiés pour cet agent et, surtout, par les premiers résultats cliniques en termes d'activité et de toxicité observés lors des essais de phase I. Les études précliniques d'associations ne se feront donc pas au hasard des multiples choix de combinaisons possibles, mais se limiteront à un nombre raisonnable orienté par les données cliniques disponibles. Ainsi, dans notre expérience avec l'oxaliplatine, les associations avec le 5-fluoro-uracile, le SN38 et le CPT11 in vitro et in vivo ont été orientées par la constatation d'une activité clinique de l'oxaliplatine dans le traitement des cancers colorectaux. L'association gemcitabine-oxaliplatine a été guidée par l'analogie avec l'effet synergique du cisplatine et de l'aracytine dans les hémopathies malignes et par les premiers résultats cliniques prometteurs de l'association gemcitabine-cisplatine. L'étude des associations est donc, dans la plupart des cas, orientée par les objectifs cliniques et les résultats cliniques obtenus avec les analogues préexistants du médicament. Beaucoup plus rarement, le criblage aveugle va identifier une association non pressentie en clinique.

Le choix du (des) modèle(s) dans le(s)quel(s) les associations seront étudiées est également orienté par les objectifs de développement clinique. Ainsi, nos études de l'oxaliplatine avec de nouveaux agents inhibiteurs de la thymidilate syntase ont été réalisées dans des modèles de tumeurs digestives. Cela souligne l'importance de la connaissance des données cliniques et des orientations en termes de choix stratégique pour une molécule. C'est d'ailleurs souvent le(s) médecin(s) en charge de l'évaluation de la molécule qui va (vont) se tourner vers le laboratoire pour proposer l'étude des associations in vitro et in vivo en vue d'essais cliniques. Cette étape se place donc dans une dynamique de collaboration entre les laboratoires et les services cliniques.

Dans les études sur les associations de l'oxaliplatine dans les cancers colorectaux, nous avons initialement étudié les interactions dans un grand nombre de modèles de cancers coliques, ovariens et mammaires sensibles ou résistants respectivement au 5FU, au cisplatine et aux anthracyclines. De même, nous avons pu évaluer les effets de l'association oxaliplatine-gemcitabine sur des modèles présentant des mutations des systèmes de mésappariement de bases ou sur des modèles mutés pour p53. Dans tous les cas, les expériences doivent être répétées plusieurs fois ; elles peuvent parfois être automatisées ou semi-automatisées. La plupart des auteurs privilégient les études de survie cellulaire par comptage à 24, 48 et 72 h après coloration au bleu trypan. Certains préfèrent l'épreuve de consommation d'un substrat MMT-assay qui présente l'avantage d'être automatisée, alors que d'autres préfèrent les tests de clonogénicité. Dans tous les cas, l'analyse des résultats procède d'une démarche commune, décrite ci-dessous.

La méthode proposée par Chou et Talalay, bien que controversée, reste actuellement la plus fréquemment utilisée in vitro. Elle présente les avantages de ne pas préjuger du mode d'action des molécules, permet d'évaluer des courbes dose-effet non linéaires et d'analyser simultanément l'effet de plus de deux médicaments à de nombreuses concentrations. Ce modèle repose sur le principe de l'effet médian résumé par l'équation suivante :

ƒ_a/ƒ_u = (D/D_m)^m (équation 1)

où D est la concentration, ƒ_a la fraction de cellules affectée par cette concentration, ƒ_u la fraction de cellules non affectées par cette concentration (ƒ_u = 1 - ƒ_a), D_m la dose qui produit un effet de 50 %, et m un coefficient indiquant la forme de la courbe dose-effet (m = 1 si la courbe est hyperbolique, m < 1 si elle est sigmoïde et m > 1 si elle est sigmoïde négative).

Pour étudier l'effet de deux molécules, A et B, chaque molécule est tout d'abord analysée séparément sur une lignée cellulaire donnée. L'analyse du paramètre de jugement de l'effet biologique est laissée au choix de l'investigateur. Le plus souvent, il s'agit de la survie ou de la mort cellulaire évaluée par comptage et bleu trypan. L'effet de chaque molécule cytotoxique est quantifié expérimentalement à plusieurs concentrations croissantes. Les données séparées de chaque molécule sont ensuite analysées pour évaluer la dose médiane Dm et le coefficient m. Pour chaque molécule et l'association est représenté le log (ƒ_a/ƒ_u) en fonction du logarithme de la concentration. Normalement, les points expérimentaux doivent s'aligner sur une droite, qui permet de calculer la meilleure régression linéaire possible. La droite permet de calculer Dm (intersection avec la droite des X) et m est la pente de la droite de meilleure régression. Le coefficient r² permet de vérifier l'adéquation du modèle à une régression linéaire de la fonction log (ƒ_a/ƒ_u).

L'analyse se fait ensuite par comparaison entre les données expérimentales obtenues en combinant les deux molécules et les données théoriques attendues (données calculées obtenues par l'exposition à chacune des molécules prise séparément). Dans l'hypothèse d'une additivité, un isobologramme est tracé, intégrant les différentes combinaisons de concentrations des deux agents qui produisent les mêmes effets. La comparaison entre les résultats expérimentaux et les résultats générés par le modèle dans le cas d'une simple additivité permet de conclure quant à la nature réelle de l'interaction. Pour chaque niveau d'effet donné est alors calculé l'index de combinaison (figure 2) qui quantifie le degré d'interaction entre les médicaments en présence selon l'équation suivante :

IC = D_a/D_xa + D_b/D_xb (équation 2)

où D_a et D_b sont les concentrations de A et B qui, en association, produisent une inhibition de x % de la croissance ; D_xa et D_xb étant les concentrations des produits A et B produisant le même effet d'inhibition de x % de la croissance obtenue après calcul de l'équation 2. La valeur de l'index de combinaison ne précise pas la nature de l'interaction, mais seulement un certain niveau par rapport à l'effet observé.

Cette méthodologie a priori complexe se traduit très simplement visuellement (figure 2) par une représentation graphique de l'index de combinaison en fonction de la fraction affectée. L'interprétation des résultats peut être résumée par les trois situations suivantes :

- si l'index de combinaison IC_{A + B} = 1, alors la combinaison A + B est additive ;

- si l'index de combinaison IC_{A + B} < 1, alors la combinaison A + B est synergique ;

- si l'index de combinaison IC_{A + B} > 1, alors la combinaison A + B est antagoniste.

Dans la plupart des cas, un minimum de trois expériences distinctes en duplicata ou en triplicata est nécessaire pour obtenir un intervalle de confiance suffisant pour affirmer la synergie entre deux molécules. Le plus souvent, l'effet maximal est observé après 48 h d'exposition aux cytotoxiques.

Une fois identifiés le meilleur modèle et la combinaison des meilleurs médicaments en administration simultanée, nous proposons d'évaluer l'effet des différentes séquences en administrant successivement l'un des médicaments puis l'autre. Cela permet parfois d'augmenter l'effet de synergie ou de rendre synergique des associations jusqu'alors antagonistes ou simplement additives. Cela est résumé dans l'exemple présenté dans la figure 3 et le tableau V qui montre que l'effet de l'association de la gemcitabine et de l'oxaliplatine dépend de l'ordre d'administration et des lignées de cancers colorectaux [41].

Principales associations médicamenteuses

Les résultats des principales associations réalisées in vitro et in vivo avec l'oxaliplatine sont résumés dans les tableaux VI et VII [42-59].

* Oxaliplatine-antimétabolites

Plusieurs études in vitro et in vivo ont étudié les associations de l'oxaliplatine avec différents inhibiteurs de la thymidilate synthase dont le 5FU [60], le raltitrexed (Tomudex^®), l'UFT (tegafur, 45), l'AG337, le ZD9331 et, plus récemment, le MTA [communications personnelles].

In vitro, l'association oxaliplatine-5FU reste la plus active avec un niveau de synergie supérieur à celui des autres associations incluant des inhibiteurs de la thymidylate synthase [60]. Dans les cas où la comparaison directe entre 5FU-cisplatine et 5FU-oxaliplatine a été faite, l'association 5FU-oxaliplatine a toujours été supérieure à celle 5FU-cisplatine dans de nombreux modèles de tumeurs humaines. Les mécanismes qui sous-tendent cette synergie entre oxaliplatine et 5FU restent à ce jour imparfaitement compris. Cette synergie in vivo est retrouvée dans des lignées humaines de cancers colorectaux, de cancers de l'ovaire et, dans une moindre mesure, dans des modèles humains de cancers du sein. La synergie entre oxaliplatine et 5FU est maintenue dans les cellules résistantes au 5FU (résistance primaire et secondaire) et dans celles résistantes au cisplatine, et n'est pas altérée par l'expression de mdr dans des lignées de cancers du sein. La synergie entre oxaliplatine et 5FU observée in vitro est retrouvée in vivo dans deux modèles de souris : dans le modèle de xénogreffes humaines de cellules de cancers coliques HT29 réputé pour sa faible chimiosensibilité ; dans le modèle murin GR1 de carcinome mammaire caractérisé par une hormonosensibilité initiale puis par l'évolution progressive vers l'hormonorésistance.

Plusieurs études in vivo ont confirmé la synergie entre 5FU et oxaliplatine, montrant également que la séquence d'exposition ne modifiait pas significativement le résultat et qu'une administration de courte durée du 5FU permettait dans certains modèles une meilleure activité antitumorale sous réserve de la coadministration d'acide folinique.

Dans la plupart des cas, les autres inhibiteurs de la thymidilate synthase ont une activité additive ou synergique réelle mais inférieure à celle du 5FU. C'est le cas de l'AG337 et du MTA qui, selon les cas, ont un effet synergique ou additif. In vivo, l'UFT a un effet potentialisateur de l'oxaliplatine sur des xénogreffes de cancers coliques humains HT29 [44]. Le raltitrexed et le ZD9331 ont des effets respectivement antagonistes et faiblement additifs in vitro. La plupart de ces associations ont été étudiées dans des essais cliniques de phases I et II permettant de confirmer leur effet potentialisateur sur la réponse antitumorale. Cela est particulièrement vrai avec le 5FU pour lequel les études cliniques ont nettement démontré l'effet bénéfique de l'adjonction d'oxaliplatine. Le cas du raltitrexed est également intéressant car il représente un des rares cas où l'étude in vitro n'a pas permis de prédire l'efficacité de l'association lors des essais cliniques chez l'homme. En effet, bien que clairement antagoniste in vitro avec l'oxaliplatine, l'association oxaliplatine-raltitrexed a montré un excellent taux de réponses en phase II dans les cancers colorectaux et les mésothéliomes. Cela illustre les limites de ce type de modèle et l'importance de la composante pharmacocinétique et pharmacodynamique lors de l'administration d'associations de chimiothérapie chez l'homme.

L'association gemcitabine-oxaliplatine a récemment été évaluée sur plusieurs lignées cellulaires coliques ou leucémiques (figure 2 et tableau V). Elle démontre un effet synergique ou additif dans plusieurs modèles tumoraux [41]. Contrairement au 5FU, la séquence d'exposition des cellules aux médicaments est importante, avec un effet plus important lorsque la gemcitabine est administrée avant l'oxaliplatine dans les tumeurs coliques. Là encore, lorsque la comparaison directe entre gemcitabine-cisplatine et gemcitabine-oxaliplatine a été faite, l'avantage est revenu vers l'association contenant l'oxaliplatine. Cette association gemcitabine-oxaliplatine a fait l'objet d'essais cliniques de phases I et II avec un effet antitumoral et une faible toxicité dans les cancers bronchiques non à petites cellules, les cancers de l'ovaire et du pancréas avancés.

* Oxaliplatine-inhibiteurs de la topo-isomérase I

Plusieurs études récentes ont évalué les associations de l'oxaliplatine avec les agents inhibiteurs de topo-isomerase I in vitro et in vivo. Les études in vitro réalisées avec le topotécan [48] et le SN38, métabolite actif du CPT11 [49], dans une lignée de cancers humains montrent un effet synergique avec le cisplatine et l'oxaliplatine. Les effets des inhibiteurs de topo-isomérase I seraient de ralentir la réparation des lésions créées au niveau de l'ADN par l'oxaliplatine. Les études in vitro d'associations oxaliplatine-SN38 ont été complétées in vivo (oxaliplatine-CPT11) sur le modèle de souris GR1 à un stade d'hormonorésistance et sur d'autres modèles permettant de confirmer l'effet potentialisateur des deux médicaments [49, 50]. Des études cliniques de phases I et II ont été réalisées ou sont en cours évaluant la toxicité et le bénéfice des associations topotécan-oxaliplatine et oxaliplatine-CPT11.

* Oxaliplatine-autres sels de platine (cisplatine et carboplatine)

L'oxaliplatine a également été étudié en association avec le cisplatine et le carboplatine in vitro. La synergie entre l'oxaliplatine et les autres sels de platine semble conforter le fait que l'oxaliplatine possède un mécanisme d'action ou de résistance différent de celui des platines de première génération [22].

* Oxaliplatine-taxanes

Comme indiqué dans le tableau VI, l'oxaliplatine a été étudié en association avec le paclitaxel (Taxol^®) dans un modèle de xénogreffes de tumeurs bronchiques humaines non à petites cellules. Un effet supra-additif a été observé [52, 53].

CONCLUSION

L'efficacité antitumorale de l'oxaliplatine est maintenant clairement établie, tant sur le plan fondamental que sur le plan clinique, compte tenu des nombreuses études disponibles à l'heure actuelle. Chez les patients présentant un cancer colorectal métastatique, l'activité synergique de l'oxaliplatine et du 5FU a permis de développer de nouveaux schémas thérapeutiques qui se sont révélés très efficaces et bien tolérés. De plus, grâce à sa faible toxicité hématologique, l'oxaliplatine se prête particulièrement à d'autres associations prometteuses en cours d'étude, que ce soit dans les tumeurs digestives ou dans d'autres localisations.

L'association à base d'oxaliplatine ayant le mieux démontré ses propriétés synergiques est celle utilisant le 5FU. L'association oxaliplatine-5FU est synergique dans les lignées cellulaires coliques, ovariennes (y compris celles résistantes au cisplatine), de cancer du sein, et, in vivo, contre des xénogreffes coliques et mammaires. D'autres antimétabolites sont synergiques in vitro avec l'oxaliplatine, tels que la gemcitabine. Les premiers résultats cliniques de l'association gemcitabine-oxaliplatine sont particulièrement prometteurs par la faible toxicité et la forte activité antitumorale dans plusieurs indications dont les cancers bronchiques non à petites cellules, les cancers de l'ovaire et du pancréas avancés. Parmi les autres composés, l'inhibiteur de la topo-isomérase I CPT11 (SN38) et le paclitaxel ont un effet additif ou synergique avec l'oxaliplatine en contexte préclinique. Enfin, l'association oxaliplatine-cisplatine apparaît additive, voire synergique, dans des lignées ovariennes ou de cancer du col. Ces résultats encourageants font actuellement l'objet d'études cliniques de phase I ou II. L'étude des associations in vitro devrait permettre de découvrir d'autres associations synergiques en vue de nouvelles applications thérapeutiques.

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