Angiogenesis and cancer

ARTICLE

La croissance des tumeurs solides est contrôlée à la fois par des mécanismes strictement intratumoraux et par des interactions entre la tumeur et le tissu environnant. Dès 1975, Folkman et al. [1] ont démontré l'importance de la néovascularisation lors de la croissance tumorale. Dans la phase préinvasive de la tumeur (latence), très peu de néovaisseaux peuvent être décelés. En revanche, l'angiogenèse est massive lors de la phase invasive et métastasiante, d'où l'hypothèse très novatrice que le passage de la phase latente à la phase agressive est contrôlé directement par la néovascularisation. Ce passage est communément dénommé switch angiogénique. La production par la cellule cancéreuse de facteur(s) diffusible(s) a alors été mise en évidence : facteur(s) capable(s) de stimuler la croissance, la migration et la différenciation des cellules endothéliales. Cette substance fut appelée « facteur de l'angiogenèse tumorale » ou TAF (tumor angiogenesis factor). Le premier facteur TAF identifié était un facteur de croissance déjà connu pour ses propriétés angiogéniques, le facteur de croissance des fibroblastes (fibroblast growth factor, FGF) [2, 3]. Celui-ci a par la suite été isolé à partir de nombreux tissus tumoraux et ses facultés de stimuler l'angiogenèse in vitro et in vivo ont été confirmées [4]. Plus récemment, d'autres facteurs non homologues des FGF ont rejoint la famille des TAF. La conjonction des travaux de plusieurs équipes a notamment révélé le rôle majeur du vascular endothelial growth factor (VEGF) dans l'angiogenèse nécessaire à la croissance de certaines tumeurs solides.

Le contrôle moléculaire de l'angiogenèse fait très vraisemblablement intervenir une balance entre facteurs pro- et antiangiogénique. Le rôle des facteurs antiangiogéniques dans cette balance a été démontré pour la thrombospondine [5], et plus récemment pour l'angiostatine [6] et l'endostatine [7].

Si l'on identifie de plus en plus précisément les régulateurs principaux et annexes de l'angiogenèse et si certaines interactions entre ces facteurs ont été caractérisées, les étapes moléculaires concertées régies par ceux-ci et conduisant au switch ne sont pas élucidées. Dans cet article, nous allons essentiellement résumer les avancées récentes dans le domaine de l'angiogenèse tumorale. Nous décrirons tout d'abord le switch angiogénique, puis les propriétés biologiques des facteurs impliqués dans la régulation de celui-ci. Nous évoquerons par la suite la modulation pharmacologique et les implications cliniques et thérapeutiques visant à inhiber spécifiquement l'angiogenèse tumorale. Pour complément, le lecteur pourra se référer aux revues de Hanahan et Folkman [8], Ferrara et Davis-Smyth [9] et Bikfalvi et al. [10].

Les mécanismes moléculaires de l'angiogenèse tumorale. Le switch angiogénique

La surexpression de l'antigène T sous la dépendance du promoteur d'un gène de régulation de l'insuline induit un insulinome chez la souris transgénique (lignée RIP-Tag). Ce modèle développé par Hanahan et al. [11] en 1985 a permis l'élaboration du concept de switch angiogénique. Les îlots pancréatiques de souris RIP-Tag prélevés en phase préangiogénique et cultivés en présence de cellules endothéliales n'entraînent pas de modifications de ces dernières quant à leur statut de différenciation, migration ou prolifération. Par contre, lorsque les îlots sont prélevés à un stade de malignité déclarée et cocultivés avec les cellules endothéliales en gel de collagène en trois dimensions, la formation de réseaux capillaires convergents vers l'îlot angiogenèse est observée. Cela indique que les cellules tumorales acquièrent la capacité de stimuler l'angiogenèse au cours de leur progression maligne.

Différentes molécules semblent être à l'origine du switch angiogénique dans ce modèle. La perte d'hétérozygotie au locus codant pour p53 favorise clairement le switch, ainsi que le facteur de croissance/survie IGF-II ; FGF-1 semble également impliqué. Le rôle de la protéine p53 a été élucidé dans différents modèles [12, 13]. Elle régule positivement l'activité d'inhibiteurs de l'angiogenèse comme la thrombospondine (TSP-1) et négativement le VEGF. In vivo, ce double rôle antitumoral de p53 est également suggéré par l'analyse de carcinomes colorectaux qui montre une corrélation entre perte d'hétérozygotie et densité microvasculaire [14].

Dans un autre système, le carcinome pulmonaire de Lewis (LLC), la stimulation de la formation de néovaisseaux s'accompagne de la perte d'un inhibiteur de l'angiogenèse. Il s'agit de l'angiostatine (voir plus loin). Paradoxalement, celle-ci est produite par la tumeur primaire elle-même et inhiberait le développement des métastases latentes. Cette situation est différente de celle décrite pour le modèle Rip-Tag, dans lequel le contrôle se situe au niveau de la tumeur primaire.

L'hypoxie peut réguler positivement le switch angiogénique. L'hypoxie induit l'expression du VEGF-A dans un grand nombre de cellules normales ou transformées (pour revue voir [9]). Par ailleurs, dans certaines tumeurs présentant une nécrose significative comme les glioblastomes multiformes, l'ARNm codant pour le VEGF est fortement exprimé dans les cellules tumorales qui sont juxtaposées aux zones de nécrose. Les facteurs impliqués dans l'induction du VEGF-A au cours de l'hypoxie sont le heat shock inducing factor (HIF) [15], l'adénosine [16] et pp60^c-src [17].

Facteurs impliqués dans l'angiogenèse tumorale

VEGF

Plusieurs équipes ont démontré que les membres de la famille des VEGF stimulent la croissance des cellules endothéliales. L'action des VEGF est plus restreinte que celle des FGF. Le VEGF-A existe sous 4 isoformes de 121, 165, 189 et 206 acides aminés. Des homologues du VEGF-A ont été décrits qui incluent le VEGF-B, pour lequel un rôle angiogénique a récemment été proposé [18], et le VEGF-C [19].

Les molécules de VEGF-A se fixent sur 2 types de récepteurs de surface appelés FLK-1 (ou KDR) et FLT-1. La transduction du signal par ces types de récepteurs a récemment fait l'objet de recherches actives. L'activité tyrosine kinase de FLK-1 est fortement stimulée par la fixation de VEGF-A contrairement à celle de FLT-1. FLT-1 est capable de s'associer à la sous-unité p85 de la phosphatidylinositol-3-kinase [20]. De plus, la phosphorylation de Fyn et Yes est stimulée en réponse au VEGF-A dans les cellules exprimant FLT-1 [21]. Enfin, l'activation de FLT-1 par le VEGF-A in vitro conduit à une stimulation de la migration des monocytes [22]. L'ensemble des données indique donc que FLK-1 et FLT-1 participent tous les deux à la signalisation mais par des voies distinctes. Les essais d'angiogenèse in vitro suggèrent que le VEGF-A agit principalement via FLK-1. Une analyse par mutagenèse dirigée de VEGF-A conforte cette hypothèse [23]. Chez la souris nude, la croissance de glioblastomes est inhibée par surexpression dans les cellules endothéliales d'une forme dominante-négative de FLK-1 [24]. Les invalidations par recombinaison homologue (knock-out) des gènes codant pour les récepteurs FLK-1 et FLT-1 ont été réalisées et mettent en évidence le rôle primordial de ces molécules lors de l'angiogenèse embryonnaire [25, 26]. Ces deux gènes étant essentiels lors du développement, les souris homozygotes ­/­ pour l'un ou l'autre ne sont pas viables, si bien que le phénotype lié à l'incidence tumorale n'a pu être établi. Plus révélatrice encore d'une régulation extrêmement fine des processus angiogéniques au cours du développement est l'haplo-insuffisance létale observée chez les embryons +/­ pour le gène du VEGF-A [27, 28]. La létalité apparaît en milieu de gestation après le début de l'organogenèse ; elle est la conséquence de défauts de vascularisation majeurs. Notons enfin que les cellules souches embryonnaires (ES) VEGF-A ­/­ ont une capacité très réduite à former des tumeurs après transplantation chez des souris nude.

Un grand nombre de tumeurs humaines synthétisent le VEGF-A. En ce qui concerne les tumeurs présentant une nécrose significative, l'expression du VEGF-A est particulièrement élevée dans les cellules tumorales adjacentes aux zones de nécrose exposées à l'hypoxie [29].

La transcription du gène codant pour le VEGF-A est activée dans les cellules tumorales mais pas dans les cellules endothéliales. En revanche, FLK-1 et FLT-1 sont présents à la surface des cellules endothéliales adjacentes aux cellules tumorales. Cela indique que le VEGF-A induit l'angiogenèse sur un mode paracrine. Notons qu'une source supplémentaire de VEGF-A est constituée par les lymphocytes infiltrant la tumeur. Le VEGF-A se lie aux cellules endothéliales intratumorales et s'accumule également au niveau de la paroi vasculaire.

Le VEGF-A a été détecté à des concentrations très élevées dans un certain nombre de tumeurs incluant les cancers gastriques et les cancers du sein [30]. Cette surexpression est accompagnée d'une augmentation significative de la densité de microvaisseaux dans les tumeurs. Enfin, l'expression du VEGF-A dans les cellules tumorales est positivement corrélée avec le pouvoir métastasiant.

L'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-VEGF-A dans des essais d'inhibition de croissance tumorale a clairement démontré que le VEGF-A est impliqué dans l'angiogenèse in vitro et in vivo : une dizaine de lignées tumorales humaines injectées en sous-cutané chez des souris nude voient leur croissance inhibée jusqu'à 95 % lorsqu'elles sont soumises à un traitement par les anticorps [9]. L'observation directe par vidéomicroscopie de la formation et des propriétés biologiques des nouveaux vaisseaux sanguins a permis d'évaluer directement l'activité angiogénique du VEGF au sein des tumeurs des animaux traités ou non par les anticorps. Des données complémentaires basées sur ce type d'approche ont montré que les caractéristiques prolifératives et morphologiques des vaisseaux tumoraux requièrent une stimulation constante par le VEGF-A [31].

FGF

Les FGF appartiennent à une famille croissante qui compte actuellement dix membres ainsi que quatre nouveaux facteurs appelés fibroblast homology factors (FHF) [32]. Les propriétés angiogéniques de deux prototypes FGF-1 et FGF-2 ont été particulièrement étudiées.

FGF-1 et FGF-2 ont un poids moléculaire de 18 kDa et une homologie d'environ 50 %. Ces deux facteurs se lient à des récepteurs de surface cellulaire spécifiques. Quatre types de récepteurs à activité tyrosine kinase ont été caractérisés, incluant FGFR1 (Flg), FGFR2 (bek), FGFR3 et FGFR4 (pour revue voir [10]). La spécificité et l'affinité de ces récepteurs sont régulées par épissage alternatif d'exons codant pour la 3^e boucle d'immunoglobuline-like (Ig-like) extracellulaire. En particulier, la variante Ig-like IIIc lie préférentiellement le FGF-2. Les cellules endothéliales expriment les récepteurs FGFR1 et FGFR2, et l'autophosphorylation est stimulée par le FGF-1 et le FGF-2. Le FGF-2 est synthétisé sous différentes formes (pour revue voir [10]). Les formes de haut poids moléculaire du FGF-2 (HPM FGF-2) de 21 à 24 kDa ont une extension N-terminale riche en motifs GC présentant des arginines méthylées. Ces formes sont localisées préférentiellement dans le noyau. À l'opposé, la forme standard du FGF-2 (d'un poids moléculaire de 18 kDa) ne comporte pas d'extension N-terminale. Cette isoforme est cytosolique ou associée à la membrane plasmique, et peut être sécrétée par des voies non élucidées. Il a été montré que les différentes formes moléculaires ont des rôles et des mécanismes d'action distincts. Les HPM FGF-2 contrôlent la prolifération cellulaire par un mécanisme intracellulaire indépendant d'un récepteur de surface, tandis que le FGF-2 de 18 kDa induit une migration cellulaire par la voie autocrine [33].

FGF-1 et FGF-2 stimulent l'angiogenèse in vitro et in vivo. L'activation des cellules endothéliales par ces facteurs est nettement supérieure à celle du VEGF in vitro. Par exemple, l'effet du FGF-1 et du FGF-2 sur la prolifération des cellules endothéliales capillaires ou macrovasculaires est au moins deux fois supérieur à celui du VEGF. De même, le FGF-2 régule de manière très fine la production des activateurs du plasminogène, tandis que l'effet du VEGF est nettement plus modéré. Enfin, les formes exogènes et les formes endogènes du FGF-2 exprimées par les cellules stimulent fortement l'expression des intégrines beta 1 in vitro [34, 35]. L'expression de ces intégrines n'est pas significativement altérée par le VEGF-A (Klein et al., communication personnelle). L'ensemble des données indique donc que plusieurs paramètres majeurs de l'angiogenèse sont régulés in vitro d'une manière très précise par le FGF. Ces paramètres sont moins étroitement contrôlés par le VEGF in vitro. Cependant, le FGF-2 et le VEGF-A ont une action d'importance équivalente dans des expériences d'angiogenèse in vivo qui utilisent la membrane chorio-allantoïdienne du poulet ou la poche cornéenne du lapin. Par ailleurs, il a été rapporté que des anticorps dirigés contre les intégrines alpha _v beta ₃ et alpha _v beta ₅ sont capables de bloquer l'angiogenèse in vivo induite par le FGF-2 et le VEGF-A respectivement [36]. Ces résultats sont en contradiction avec les données dérivées des études in vitro. Les raisons pour ces discordances ne sont pas élucidées.

Des études cliniques publiées ou en cours de réalisation confirment l'implication du FGF-2 dans l'angiogenèse tumorale [37, 38]. Une corrélation a été démontrée entre la concentration du FGF-2 dans les urines, dans le liquide céphalorachidien, ainsi que dans le sérum de patients atteints de cancer du système nerveux central et le grade tumoral. Les patients atteints de gliomes de haut degré de malignité possèdent une concentration sérique en FGF-2 8 fois supérieure à celle des tumeurs cérébrales de faible malignité. Par ailleurs, cela est strictement corrélé avec le degré de vascularisation intratumorale (Bello et al., communication personnelle). Enfin, après l'exérèse tumorale, les taux sériques du FGF-2 reviennent au niveau des valeurs contrôles.

Si le rôle du FGF-2 au cours de l'angiogenèse tumorale est suggéré par plusieurs approches, qu'en est-il des autres membres de la famille ? Il serait très intéressant de savoir si un ou plusieurs d'entre eux (en particulier le FGF-1) confèrent à ce système de régulation une certaine redondance fonctionnelle permettant d'affiner le contrôle spatio-temporel.

* Angiopoïétine

L'angiopoïétine a été récemment identifiée comme le ligand de la kinase transmembranaire Tie2 par une approche de clonage appelé secretion trap expression cloning [39]. L'angiopoïétine est une protéine glycosylée de 70 kDa. Elle est formée de deux régions : la région amine-terminale contient un motif de type coiled-coil caractéristique des protéines capables d'hétérodimériser ; la région carboxyle-terminale est homologue au fibrinogène. Le traitement par la PGNase-F qui enlève les sucres de la molécule réduit le poids moléculaire à 55 kDa. L'angiopoïétine se lie à Tie2 (KD 3,7 nM) et active sa phoysphorylation.

Au cours du développement embryonnaire de la souris, son expression est localisée au niveau du myocarde et du mésenchyme à un stade précoce et à un stade ultérieur dans les cellules environnant les vaisseaux en développement [40]. La disruption du gène codant pour l'angiopoïétine conduit à une létalité des embryons au stade 12,5 jours, qui est vraisemblablement la conséquence de modifications profondes de l'architecture vasculaire.

Il est surprenant que l'angiopoïétine n'active ni la prolifération des cellules endothéliales ni la formation des tubes capillaires in vitro. Des données récentes indiquent une implication moins directe vraisemblablement liée au recrutement des cellules mésenchymateuses lors du développement vasculaire. Un rôle de l'angiopoïétine dans l'angiogenèse tumorale n'a pas encore été établi.

Inhibiteurs

* L'angiostatine

L'angiostatine a été découverte et isolée à partir d'urine de souris présentant une tumeur pulmonaire de Lewis [6]. L'angiostatine est un fragment de la plasmine de 56 kDa représentant quatre boucles Kringle. L'action de l'angiostatine est principalement endothéliale. Récemment, le rôle des différentes boucles Kringle a été élucidé. Il semble que la boucle IV présente une activité d'auto-inhibition moléculaire [41]. Cependant, son récepteur n'est pas identifié, et les mécanismes de régulation et le mode d'action de l'angiostatine ne sont pas encore élucidés.

Les résultats du groupe de Folkman sont en faveur d'une action inhibitrice de l'angiostatine sur le développement des métastases latentes [42]. En effet, l'exérèse de la tumeur primaire de Lewis entraîne le développement de métastases en corrélation étroite avec une chute du taux urinaire en angiostatine. L'administration d'angiostatine juste après l'exérèse inhibe le développement des métastases. Ces résultats indiquent que l'angiostatine joue un rôle important dans le maintien de la latence des métastases.

* L'endostatine

L'endostatine est un inhibiteur de l'angiogenèse identifié très récemment dans les cellules endothéliales hémangiomateuses [7]. C'est une molécule de 20 kDa correspondant au fragment C-terminal du collagène type XVIII. L'endostatine inhibe fortement l'angiogenèse in vitro et in vivo, ainsi que la croissance tumorale. L'endostatine présente une propriété importante : son relargage continu in vivo fait régresser complètement la tumeur primaire vers l'état d'îlot microscopique latent. L'endostatine est donc non seulement capable de maintenir la latence tumorale mais aussi de provoquer la régression tumorale.

* Le facteur plaquettaire-4

Le facteur plaquettaire-4 (PF-4) est un polypeptide de 7 kDa qui est produit dans les plaquettes sous forme de complexe tétramérique. Il a été montré que le facteur plaquettaire-4 inhibe l'angiogenèse in vitro et in vivo. Le PF-4 pourrait jouer un rôle in vivo lors de l'activation plaquettaire. En effet, il a été montré que les plaquettes libèrent lors de l'activation un inhibiteur de l'activité du FGF-2 identique au PF-4 [43].

Il a été proposé que le PF-4 exerce son effet par inhibition de la liaison du FGF-2 à son récepteur. Cependant, d'autres groupes n'ont pas pu confirmer ces données. Nous avons récemment analysé le mécanisme d'action du PF-4. Nos résultats indiquent qu'il empêche l'activation des récepteurs aux FGF par inhibition de la dimérisation (Perollet et al., communication personnelle).

* La thrombospondine-1

La thrombospondine-1 (TSP-1) appartient à une famille de glycoprotéines produite par un nombre de cellules normales et transformées. Il a été montré que la TSP-1 est un inhibiteur puissant de l'angiogenèse in vivo et in vitro et joue un rôle dans le switch angiogénique. En effet, la perte d'un gène suppresseur de tumeur dans les fibroblastes de hamster induit une réponse angiogénique par diminution de la sécrétion de la TSP-1 [5]. La nature du gène suppresseur capable de réguler l'expression de TSP-1 a été élucidée en utilisant les fibroblastes isolés de patients présentant la maladie de Li-Fraumeni [12]. Ces fibroblastes possèdent un allèle sauvage et un autre muté pour le gène codant pour p53. Il a été montré que la perte d'hétérozygotie inhibe l'expression de la TSP-1. Par ailleurs, la transfection de p53 sauvage dans les fibroblastes stimule l'expression endogène de p53 et régule positivement des séquences promotrices du gène TSP-1. Cela indique que p53 sauvage inhibe l'angiogenèse induite par ces fibroblastes grâce à son action sur la synthèse de TSP-1.

Inhibition pharmacologique de l'angiogenèse tumorale

Un certain nombre de composés inhibiteurs de l'angiogenèse ont été décrits. Ceux-ci incluent l'héparine, l'héparinase, la thalidomide, la suramine, le sulfate de protamine, des peptides dérivés du PF-4 et des antiœstrogènes.

Parmi les héparinases, les héparinases I et III inhibent l'angiogenèse induite par le FGF-2 in vitro et in vivo [44]. La thalidomide, la suramine et le sulfate de protamine inhibent vraisemblablement l'interaction de certains facteurs angiogéniques avec leurs récepteurs de surface cellulaire.

En ce qui concerne le PF-4, Gupta et al. [45] ont montré qu'un peptide de 53 acides aminés dérivé du PF-4 par clivage protéolytique inhibe l'angiogenèse à une concentration 50 fois plus faible que la molécule de PF-4 entière.

Enfin, les antiœstrogènes comme le tamoxifène, la nafoxidine et le clomifène ainsi que des analogues synthétiques inhibent la croissance des cellules endothéliales induite par le FGF et le VEGF. Cette activité antiangiogénique n'est pas dépendante des récepteurs aux œstrogènes [46].

Corrélations cliniques et perspectives thérapeutiques

Comme il a été dit plus haut, un certain nombre de cancers humains sont dépendants de l'angiogenèse et traversent deux phases, une phase préangiogénique latente et une phase angiogénique agressive. Des corrélations cliniques significatives ont été établies entre le pouvoir invasif et métastasiant d'un certain nombre de cancers, la présence d'une néoangiogenèse intratumorale, la surexpression des ARNm de facteurs angiogéniques comme le VEGF et le FGF-2 dans les cellules tumorales, et un taux sérique ou urinaire anormalement élevé des molécules correspondantes. Donc, des inhibiteurs de ces facteurs tels que des anticorps spécifiques, des oligonucléotides antisens [47] ou encore des molécules pharmacologiques inhibant les voies de signalisation correspondantes pourraient intervenir avec succès dans des protocoles thérapeutiques en conjonction avec les traitements classiques. De même, des molécules mimant l'activité antiangiogénique du PF-4 et de l'endostatine offrent une perspective d'utilisation thérapeutique séduisante. On est en droit de spéculer sur une faible toxicité de ces molécules sur l'arbre vasculaire normal du fait de l'état quiescent des cellules endothéliales de la plupart des tissus de l'adulte.

Des composés comme le TNP-40, analogue synthétique de la fumagiline, ayant fait leur preuve chez des modèles animaux de type RIP-Tag [48] sont en essai clinique depuis plusieurs années.

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