Recent progress on the role of APC protein in the origin of colorectal cancer

ARTICLE

Les cancers colorectaux peuvent schématiquement se diviser en deux grandes catégories, selon qu'ils sont héréditaires ou non.

­ Les cancers héréditaires à transmission autosomique dominante, qui représentent 5 à 10 % des cancers colorectaux [1], sont eux-mêmes subdivisés en deux groupes. Le premier réunit les cancers caractérisés par la présence de polyadénomes multiples : c'est la polypose adénomateuse familiale, dite FAP ou familial adenomatous polyposis. Cette maladie, qui représente moins de 1 % des cancers colorectaux, est caractérisée par la présence d'un grand nombre d'adénomes ou de polypes adénomateux. Dans le deuxième groupe figurent les cancers sans polyadénomes, ou syndrome de Lynch ou hereditary non polyposis colon cancer (HNPCC).

­ Les cancers dits sporadiques, qui n'ont pas de contexte héréditaire évident et sont caractérisés par la présence d'adénomes susceptibles d'évoluer en carcinomes. Ces cancers représentent la majorité des néoplasies colorectales.

Il est intéressant de remarquer que, dans la polypose adénomateuse familiale comme dans les cancers sporadiques, des mutations du gène APC ont été mises en évidence [2-5]. Dans la maladie familiale, la mutation initiale est d'origine germinale et constitutionnelle, dans le cancer sporadique, elle est somatique. Dans les deux cas, la mutation du gène aboutit généralement à l'expression d'une protéine tronquée. On s'interroge de ce fait sur le rôle joué par cette anomalie dans la genèse du cancer colorectal.

Le rôle de la protéine APC dans le développement des tumeurs commence à être mieux compris. Des études physiologiques et biochimiques ont montré que l'APC sauvage pouvait réguler la croissance, l'adhérence et la migration cellulaires. Les caractéristiques de cette protéine seront décrites ainsi que l'incidence de certaines mutations sur la formation des tumeurs et leur évolution. Cette revue complète celle publiée récemment [6].

Génétique

Des études moléculaires et génétiques ont montré que les individus portant une mutation germinale du gène APC localisé sur le chromosome 5q21 étaient prédisposés au développement d'un cancer du côlon [7]. Cette prédisposition touche en France environ 2 000 sujets [8]. La polypose rectocolique familiale est caractérisée par l'apparition de polypes adénomateux dans le côlon et le rectum pendant les premières décennies de la vie. Faute d'ablation chirurgicale, les individus affectés développent un carcinome vers l'âge de 40 ans. Les mutations constitutionnelles du gène APC dans la FAP sont nombreuses et diverses ; elles sont présentes dans tous les tissus de l'organisme mais, dans les cellules du côlon, une mutation somatique du deuxième allèle s'installe [9, 10]. L'inactivation somatique du second gène normal hérité du parent non atteint a été montrée dans 19 cas sur 24 dans des adénomes de malades atteints de FAP [11]. L'inactivation du 2^e allèle amplifie l'effet prolifératif induit par la première mutation. Selon d'autres travaux, l'hyperméthylation de la région promotrice du gène APC pourrait également être impliquée dans la progression du cancer du côlon [12] dans la mesure où cette hyperméthylation correspond souvent à une réduction de la transcription du gène.

Dans le cas des cancers sporadiques, les deux mutations sont d'origine somatique. Un premier événement inactive un seul des deux gènes de la cellule. Un deuxième fait disparaître l'expression du gène resté jusqu'à présent normal. Dans les carcinomes sporadiques, la mutation des deux allèles a pu également être mise en évidence [13].

Dans les tumeurs colorectales sporadiques, qu'elles soient bénignes ou malignes, il y a mutation du gène APC. Ce résultat suggère que la mutation de l'APC est un événement précoce de la tumorigenèse colorectale [13].

Des délétions alléliques des chromosomes 17 et 18 peuvent cependant se surajouter [14], ainsi que d'autres mutations que celles du gène APC, mais il ne semble pas qu'elles soient à l'origine du cancer du côlon. Ainsi, le gène de P53 est muté dans 80 % des cancers colorectaux, mais les individus qui présentent cette mutation n'ont pas de prédisposition particulière au cancer du côlon comme c'est le cas pour la mutation du gène APC [15]. Le gène ras est également muté ; cependant ses mutations ne constituent vraisemblablement pas l'altération initiale dans le développement des tumeurs colorectales, dans la mesure où les petits adénomes provenant de malades avec ou sans FAP ne les contiennent pas fréquemment [14].

Les localisations des mutations sur le gène APC sont variées et peuvent être corrélées, dans une certaine mesure, à des manifestations cliniques. Ainsi, des mutations en amont du codon 157 [16] sont associées à une forme atténuée du cancer, caractérisée par un nombre restreint d'adénomes dont l'apparition est retardée. Des mutations localisées entre les codons 169 et 1464 [17] correspondent à l'émergence d'un nombre important d'adénomes. Les mutations germinales affectent deux points chauds, les codons 1061 et 1309. Les mutations somatiques sont principalement concentrées au niveau des codons 1301 et 1450 [13, 18].

Des données épidémiologiques ont montré que le régime alimentaire ou les conditions de vie pouvaient favoriser ou non l'apparition d'un cancer du côlon [19].

Caractéristiques de la protéine APC

La protéine APC normale est une molécule de 2 843 acides aminés qui comporte quatre domaines : un domaine aminoterminal qui permet son oligomérisation, un domaine qui renferme des motifs armadillo (motifs trouvés dans la protéine armadillo de la drosophile, homologue de la beta -caténine chez les vertébrés), une région centrale constituée de séquences répétées d'acides aminés et une partie carboxyterminale (figure 1).

Les altérations génétiques observées au cours du cancer colorectal génèrent l'expression d'une protéine tronquée, soit par une mutation faux sens (codon stop) ou par insertion ou délétion de nucléotides conduisant à un décalage du cadre de lecture. Dans ces conditions, la protéine est généralement amputée de son groupement carboxyterminal [20]. Cependant, dans 15 % des cancers colorectaux, une protéine APC intacte reste synthétisée [21]. Il faut préciser cependant que les protéines tronquées sont souvent instables et ne sont pas toujours faciles à détecter.

La protéine tronquée reste néanmoins capable de s'associer à la protéine normale et pourrait ainsi l'inactiver par une action dominante négative [22], propriété qui n'a pas été démontrée in vivo [23], mais qui permettrait de comprendre comment l'inactivation d'un seul allèle du gène APC pourrait dans certains cas contribuer à la tumorigenèse.

Chez les malades atteints de FAP, les tumeurs sont généralement localisées dans les cellules épithéliales du côlon, alors que, chez ces malades, d'autres tumeurs peuvent être présentes comme des tumeurs desmoïdes, des voies biliaires, de la thyroïde ou du système nerveux central (syndrome de Turcot) [24-26].

Bien que la protéine APC normale soit exprimée dans un grand nombre de tissus, l'expression de ses mutants est généralement limitée aux cellules du côlon. Cependant, sa forme tronquée a été détectée dans quatre lignées lymphoblastoïdes obtenues chez 7 malades atteints de FAP [21].

Ces données attestent donc que la protéine APC jouerait un rôle spécifique dans la tumorigenèse des cellules du côlon, et que son effet serait redondant dans les autres types cellulaires.

Modèles animaux

On dispose de modèles murins qui reproduisent plus ou moins fidèlement la maladie humaine :

­ la lignée de souris Min (multiple intestinal neoplasia) a été établie à partir de souris traitées par la nitroso-éthyl-urée ; ces souris portent une mutation dominante pour le locus Min qui a été identifié à Apc [27, 28] ;

­ des souris mutantes hétérozygotes Apc^716ont été produites par manipulation génétique, récemment [29]. Ces deux mutants murins développent des adénomes et des carcinomes au niveau de l'intestin. Chez les souris mutantes Min, une mutation non sens de l'exon 15 du gène Apc est présente et, chez les souris Apc^716, la partie carboxyterminale de la protéine est tronquée à partir de l'acide aminé 716.

Chez les souris Min qui développent des adénomes intestinaux multiples et possèdent des mutations du gène Apc identiques à celles trouvées dans la FAP, le nombre de polypes varie d'une souche de souris à l'autre. Les variations ainsi observées ont pu être attribuées au gène Mom 1 (pour « modifier of Min ») qui code pour la phospholipase A2, impliquée dans la synthèse de l'acide arachidonique ; or, chez les souris Min, l'augmentation de la phospholipase exerce un effet protecteur [30]. Ce résultat démontre que le phénotype de la FAP peut être affecté par la modification d'un locus indépendant de celui de l'APC.

Organisation de l'épithélium intestinal

Les entérocytes sont issus des cellules souches situées dans la crypte de Lieberkühn et migrent du pôle basal vers le pôle apical, le long de l'axe villositaire, sous forme d'une couche de cellules épithéliales. Pendant la différenciation normale des entérocytes, il y a équilibre entre l'adhérence cellule-cellule et l'adhérence cellule-membrane basale. Les cellules prolifèrent activement dans le tiers inférieur de la crypte, elles migrent et entrent en apoptose ou mort programmée à l'apex [31] (figure 2).

Au cours de la formation des adénomes, les entérocytes s'accumulent à la base de la crypte indiquant vraisemblablement un défaut dans l'adhérence et/ou dans la migration des cellules. L'équilibre entre division et mort cellulaire est perturbé, entraînant une prolifération anarchique des cellules de la crypte et un déficit d'apoptose. Ces déséquilibres peuvent être imputés à certaines mutations de la protéine APC qui, dans les conditions normales, peut réguler la division cellulaire et l'apoptose, l'adhérence et la migration cellulaires.

APC, croissance et mort cellulaires

Dans les cellules épithéliales normales du côlon, l'APC se concentre dans les cellules situées au sommet de la villosité [13]. L'augmentation de son expression coïncide ainsi avec la maturation des cellules. L'expression de protéines APC anormales perturbe la multiplication et l'apoptose de la cellule, conduisant à une expansion relative du nombre des cellules contenant l'APC mutée. En effet, il a été montré in vitro que l'on pouvait rétablir le programme d'apoptose en exprimant de façon inductible la forme sauvage dans des cellules colorectales humaines [32]. D'autres auteurs ont montré que l'APC intervenait également dans la régulation de la phase G1 du cycle [33] : dans la lignée cellulaire fibroblastique NIH-3T3, l'expression de l'APC sauvage entraînait une diminution de l'expression de la kinase dépendant des cyclines, la cdk2 active dans la phase G1, alors que la protéine APC mutée était incapable de réguler l'activité de la kinase cdk2.

À partir d'échantillons d'intestins normaux ou de polypes prélevés chez les patients atteints de FAP, à l'occasion d'une ablation chirurgicale, Zhang et al. [34] ont montré que la croissance cellulaire était perturbée dans les adénomes et les carcinomes du côlon avec une surexpression de la cycline D, cycline de la phase G1 du cycle et de la kinase associée, cdk4. Des résultats similaires ont été obtenus chez les souris Min. Ainsi, les protéines impliquées dans la progression des cellules dans la phase G1 du cycle se trouvent dérégulées quand la protéine APC est anormale.

APC et liaison avec des protéines spécifiques

APC et beta -caténine

L'APC se lie à la beta -caténine [35, 36] qui a été originellement associée à la zone d'adhérence des cellules épithéliales. La beta -caténine se lie au domaine cytoplasmique des cadhérines et à l' alpha -caténine. Elle est reliée au réseau d'actine via l' alpha -caténine [37]. L'APC se lie à la beta -caténine par deux régions différentes : la première est constituée par 3 x 15 répétitions d'acides aminés entre les acides aminés 1020 et 1169 et un second motif qui comprend des répétitions de 20 acides aminés compris entre les acides aminés 1324 et 2075 (figures 1 et 3). Bien que de nombreux mutants de l'APC aient perdu au moins l'un des deux sites de fixation, ils gardent la capacité de se lier à la beta -caténine.

L'APC pourrait jouer un rôle important dans l'adhérence cellulaire par ses capacités de liaison avec les beta - et gamma -caténines (plakoglobine) en modulant l'expression de la beta -caténine libre et fixée dans la cellule. En effet, certaines lignées de cellules du côlon qui expriment l'APC mutée contiennent des taux importants de beta -caténine. La transfection de ces cellules avec l'APC sauvage ou avec des fragments contenant la partie centrale des 20 acides aminés réduit significativement la quantité totale de beta -caténine [38]. Une surexpression de l'APC sauvage induit une augmentation du catabolisme de la beta -caténine. La région de l'APC responsable de la régulation de la beta -caténine est localisée dans la partie centrale de la molécule, qui est également le domaine phosphorylable par la glycogène synthétase ou GSK3 [39]. La forme phosphorylée de l'APC aurait une affinité plus importante pour la beta -caténine que la forme non phosphorylée. L'hypothèse émise est que l'APC « pressentirait » l'excès de beta -caténine intracellulaire. Elle s'associerait alors plus fortement à la GSK3 qui la phosphoryle et à la beta -caténine pour en démarrer la dégradation protéolytique, via la voie ubiquitine-protéasome [40].

Il existe un équilibre entre cadhérine/ beta -caténine et APC/ beta -caténine, les liaisons de la beta -caténine avec les cadhérines ou avec l'APC étant mutuellement exclusives [41, 42] ; la phosphorylation de ces protéines modulerait les affinités d'interactions. Une surexpression in vivo d'une forme dominante négative de la N-cadhérine, capable d'interagir avec la beta -caténine ou la plakoglobine dans les entérocytes murins, induit des altérations au niveau de l'adhésion et de la migration cellulaire. La forte expression de la forme dominante négative déplace l'équilibre d'interaction entre les différents partenaires de la beta -caténine, dont l'APC [43]. La perte de l'expression de la E-cadhérine entraîne une dissociation des cellules de leur environnement [44]. Un déplacement de l'équilibre APC, cadhérine, beta -caténine quand l'APC est mutée peut modifier l'adhérence cellulaire. Une interruption des contacts cellule-cellule et de la signalisation pourrait modifier le comportement de la cellule.

En plus des fonctions d'adhésion, la beta -caténine est impliquée dans des processus indépendants de signalisation. Elle s'associe aux facteurs LEF (lymphoid enhancer binding factor) ou TcF (T cell factor) [45], le complexe est alors transloqué dans le noyau où il régule l'activité transcriptionnelle de gènes cibles. L'APC pourrait réguler la formation du complexe transcriptionnel beta -caténine-LEF. La perte de fonction de l'APC induirait une activation transcriptionnelle incontrôlée des gènes cibles de TcF ou de LEF et contribuerait de ce fait à la tumorigenèse du côlon [46, 47]. Comme cela a été précisé récemment, un défaut de la formation du complexe transcriptionnel peut résulter également de mutations de la beta -caténine [48].

APC et microtubules

L'APC s'associe aux microtubules [49] (figure 3). Cette interaction nécessite la présence du groupement carboxyterminal de la protéine APC qui est absent dans les adénocarcinomes des malades atteints de FAP et dans les carcinomes coliques sporadiques. Au cours de la formation des polypes, les cellules s'accumulent dans la crypte, ce qui suggère un dérèglement de la migration cellulaire. L'interaction de l'APC et des microtubules serait cruciale pour la migration cellulaire.

Dans des lignées de cellules épithéliales rénales (MDCK) et intestinales (IEC-6), l'APC se trouve dans les zones de protubérance de la membrane cellulaire qui contient des microtubules [50]. Elle serait importante pour la migration cellulaire, de par sa localisation en bordure de la cellule migrante, alors que les microtubules sont nécessaires à la stabilisation des protubérances cellulaires impliquées dans cette migration.

La migration des cellules intestinales a été particulièrement étudiée in vivo chez la souris. Trois à cinq jours sont nécessaires à l'accomplissement d'un cycle depuis la prolifération des entérocytes jusqu'à leur apoptose. Lorsque l'APC est surexprimée in vivo, la migration des cellules devient désordonnée [51].

Interaction de l'APC avec d'autres constituants cellulaires

En sus de la beta -caténine, de la GSK3 et des microtubules, l'APC peut se lier à d'autres protéines : la protéine EB1 de 31 kDa [52] dont on ignore encore la fonction, mais aussi la protéine DLG, produit de l'homologue du discs large gene de la drosophile [53]. La protéine EB1 est exprimée dans de nombreuses lignées de cancer du côlon mais également dans des lignées de cellules fibroblastiques et épithéliales. On a montré que la protéine DLG était colocalisée avec l'APC dans le cytoplasme des cellules épithéliales du côlon chez le rat. EB1 et DLG se lient au niveau de la partie carboxyterminale de l'APC qui est systématiquement tronquée dans les cancers du côlon. Les protéines EB1 et DLG pourraient être impliquées dans la croissance et la migration cellulaires associées à l'APC.

Conservation structure/fonction au cours de l'évolution

Une étape importante dans la compréhension du rôle de l'APC dans le développement fut la découverte d'un homologue de l'APC chez la drosophile ou D-APC [54]. Un homologue de la beta -caténine existe également chez la drosophile, la protéine armadillo. La liaison armadillo/D-APC est régulée par ZW3 (zest-white 3) qui est une kinase homologue de la GSK3. La kinase ZW3 est capable de phosphoryler armadillo comme la GSK3 est capable de phosphoryler la beta -caténine chez les vertébrés. Armadillo réagit avec la D-APC et avec la cadhérine d'insecte. Il est remarquable de constater que la conservation structure/fonction n'est pas limitée à ces protéines d'adhésion, mais se continue dans la signalisation cellulaire. En effet, le taux de beta -caténine est régulé par l'APC mais aussi par la protéine Wnt-1 dont il existe un homologue chez la drosophile, Wingless ou Wg [55, 56]. Des études récentes chez la souris et Xenopus laevis ont montré que la signalisation par Wnt induisait la formation d'un complexe hétérodimérique contenant la beta -caténine et un membre de la famille LEF (lymphoid enhancer factor) [57]. Le complexe beta -caténine/LEF pénètre dans le noyau pour y excercer semble-t-il une activité transcriptionnelle. L'APC, en coordination avec ZW3/GSK3, inhiberait l'activité transcriptionnelle du complexe LEF- beta -caténine [47].

Étiologie et thérapeutique

Des études étiologiques et l'utilisation de modèles animaux ont permis de démontrer le rôle de l'alimentation dans le développement des cancers colorectaux. Par exemple, les huiles de poisson qui renferment des acides gras polyinsaturés, comme l'acide éïcopentaénoïque et l'acide docosahéxanoïque ou DHA, diminuent l'incidence des cancers expérimentaux [58, 59]. Parallèlement, on observe une régression de la prolifération de la muqueuse quand les malades sont traités par certains acides gras [60, 61].

Une nourriture riche en fibres est, par ailleurs, protectrice vis-à-vis du cancer du côlon. Cet effet a pu s'expliquer, expérimentalement, par la propriété qu'a le butyrate de sodium, qui provient de la fermentation bactérienne des fibres alimentaires, d'induire l'apoptose dans des cultures de cellules d'adénomes et de carcinomes [62].

Par des études épidémiologiques, il a été mis en évidence que les personnes qui prennent régulièrement de l'aspirine ont un risque plus faible de développer un cancer du côlon que la population générale [63]. L'administration de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) réduit le nombre et la taille des adénomes, que ce soit chez les malades atteints de FAP [64, 65] ou chez les souris Min et Apc^716 [66]. Expérimentalement, le développement des tumeurs du côlon et leur nombre sont réduits quand le sulindac, une molécule de la classe des AINS, est administré en même temps que l'azométhane, agent carcinogène chez le rat [67].

Le mécanisme cellulaire responsable de l'activité antinéoplasique des dérivés du sulindac a été partiellement élucidé : en effet, le médicament ou ses métabolites sont des inhibiteurs de l'activité de la cyclooxygénase 2 ou Cox2, impliquée dans la synthèse des prostaglandines à partir de l'acide arachidonique. Contrairement à l'isoenzyme Cox1 qui est constitutif, Cox2 est induit après activation par de nombreux facteurs, comme les facteurs de croissance, les cytokines, les promoteurs de tumeurs. Il est surexprimé dans les tumeurs du côlon [68], son activité est bloquée par les AINS dans les modèles murins [69]. Les médicaments type sulindac agiraient donc sur le cancer du côlon en inhibant l'action antiapoptotique de la prostaglandine pGE2 et en compensant de ce fait les anomalies dues à la mutation de l'APC. Cet effet a été mis en évidence in vivo mais aussi in vitro, sur des cultures cellulaires [70]. La démonstration de l'implication de Cox2 dans la cancérogenèse du côlon a été apportée récemment [71], grâce à l'obtention des souris doublement invalidées, APC^716 et Ptgs2^­/­ (le gène de Cox2). Une absence de la protéine Cox2 dans ces doubles mutants réduit considérablement le nombre et la taille des polypes adénomateux chez les souris APC^716. Ce résultat conforte l'hypothèse selon laquelle Cox2 et la voie des prostaglandines seraient impliquées dans la maladie ; en effet, l'augmentation de la synthèse de l'acide arachidonique, précurseur des prostaglandines, protège les souris Min contre le développement des tumeurs du côlon. Le mode d'action de ces médicaments est vraisemblablement plus complexe ; en effet, le sulindac, ajouté in vitro dans une culture de cellules de carcinome du côlon, diminue la concentration de prostaglandine E2 mais augmente aussi la quantité d'ARNm de l'APC [72].

Remerciements

Nous remercions vivement Olivier Delattre pour nous avoir aidés dans la relecture de cette revue.

CONCLUSION

La protéine APC sauvage est une protéine plurifonctionnelle qui intervient dans le contrôle de certaines fonctions cellulaires essentielles telles que la division cellulaire (multiplication et apoptose), l'adhérence et la migration. Une revue très détaillée couvre l'ensemble de ses fonctions [73]. On ne connaît pas encore parfaitement son rôle dans la tumorigenèse du côlon. Il semble que l'une de ses fonctions majeures serait de réguler la formation et l'accumulation des complexes nucléaires beta -caténine-Tcf ou LEF, modulant ainsi l'expresssion des gènes cibles de ces facteurs de transcription

Des mutations ou des aberrations du gène APC ont été découvertes dans d'autres types de cancer que celui du côlon. Par exemple, une mutation a été retrouvée dans 7/13 hépatoblastomes sporadiques [74], dans 9/31 carcinomes mammaires [75], et une altération de l'expression de l'APC est signalée dans 2/25 mélanomes humains [76].

Dans un domaine différent, des études récentes on montré que l'APC pouvait exercer un effet sur la régulation de la migration cellulaire au cours de la tubulogenèse épithéliale [77].

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