Thérapie génique - Communications 190 à 194

ARTICLE

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Caractérisation de l'expression et optimisation du transfert, par des vecteurs rétroviraux, du gène suicide de la thymidine kinase dans des cellules tumorales coliques

Malafosse R ^{1, 2}, Finzi L ^{1, 2}, Goere D ¹, Baudoin F ³, Penna C ¹, Capeau J ², Nordlinger B ¹

¹ Service de chirurgie générale et oncologique, Hôpital Ambroise-Paré, Boulogne ; ² Unité Inserm U. 402, Faculté de Médecine Saint-Antoine, Paris ; ³ Service d'immunologie, Hôpital Ambroise-Paré, Boulogne.

Le transfert rétroviral du gène suicide de la thymidine kinase du virus Herpès simplex (Hsv-tk) suivi d'un traitement par le ganciclovir (GCV) induit une réponse antitumorale sélective. Une des étapes limitante de la thérapie génique par des vecteurs rétroviraux est l'intégration du transgène dans le génome de la cellule cible. Cette intégration dépend du cycle cellulaire. L'objectif de ce travail était d'augmenter l'efficacité du transfert rétroviral du gène Hsv-tk dans des cellules tumorales coliques par le bloquage pharmacologique réversible de leur cycle cellulaire.

Méthodes : Les cellules tumorales coliques DHDK12 ont été synchronisées, en phase S, par le méthotrexate. Les cellules synchronisées (Sy) et témoins non synchronisées (T) ont été transduites par les vecteurs rétroviraux pTG 5391 (gène de la beta-galactosidase : beta-gal) et pTG 9344 (Hsv-tk). Pour valider l'effet de la synchronisation sur l'efficacité des vecteurs rétroviraux, l'expression des transgènes a été caractérisée par cytométrie en flux selon trois approches quantitatives :

- L'immuno-détection de la thymidine kinase par des anticorps monoclonaux.

- La recherche de l'accumulation intracellulaire de substrats marqués. Le fluorescéine di-beta-D-galactopyranoside (FDG) constituait le substrat de la beta-galactosidase (beta-gal). Le GCV a été marqué par un dérivé biotinylé de faible masse moléculaire qui, après phosphorylation du GCV par la thymidine kinase virale, était détectée par l'extravidine-FITC.

- L'étude de l'apoptose par fixation membranaire de l'annexine V après 72 h de traitement par le GCV.

Résultats. Le marquage par l'anticorps monoclonal et le signal produit par l'accumulation intracellulaire du GCV biotinylé étaient spécifiques des cellules exprimant Hsv-tk. Après synchronisation, l'utilisation du FDG a permis de montrer un doublement du taux de transduction des cellules tumorales par le vecteur pTG 5391 (Sy : 26 % versus T : 11 %). Cette amplification de l'expression de beta-gal était corrélée à la cinétique du cycle cellulaire. Les résultats étaient similaires après transduction par le vecteur pTG 9344. L'expression de Hsv-tk était augmentée dans les cellules synchronisées. L'analyse quantitative de la thymidine kinase et de son activité devait être interprétée en fonction des modifications cellulaires liées au traitement par le méthotrexate. L'augmentation du marquage spécifique par l'annexine V (Sy : 46 % versus T : 23 %) traduisait une intensification de l'apoptose induite par le GCV sur les populations cellulaires transduites par Hsv-tk après synchronisation.

Conclusion. La synchronisation en phase S augmente l'efficacité de la transduction de cellules tumorales coliques par des vecteurs rétroviraux. Cette optimisation du transfert de Hsv-tk se traduit par une intensification majeure de l'apoptose induite par le GCV. In vivo, le conditionnement des cellules cibles par de faibles doses de méthotrexate pourrait contribuer à une réponse antitumorale complète après transfert rétroviral d'un gène suicide.

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In vitro targeting of glioblastoma cells neoangiogenic potential through anti-VEGF ribozymes

Ciafré SA, Wannenes F, Farace MG

Dept. of Experimental Medicine and Biochemical Sciences, University of Rome Tor Vergata, via Montpellier, 1, 00133 Roma.

Dlioblastoma multiforme is one of the most highly vascularized solid neoplasms, with the amount of neovasculature closely correlated with the degree of malignancy. Among angiogenic factors, vascular endothelial growth factor (VEGF) plays an important role in the neovascularization and growth of human cancers, and particularly in gliomas, where up-regulation of VEGF is a common event. Thus, strategies to down-regulate VEGF could be applied to reduce the preformed tumour vasculature in established gliomas. We have designed hammerhead ribozymes against VEGF mRNA, with the aim of strongly down-regulating expression and secretion of VEGF by glioma cells and inhibiting their proangiogenic potential. Our experimental strategy can be summarized into the following steps: a) Design of two new ribozymes targeting human VEGF mRNA specifically cutting its sequence around 5' end, thus yielding short pieces of mRNA completely unavailable to the translational machinery. b) Cloning of the designed ribozymes into a short region of Adenovirus type 2 (Ad2), VAI, owning several features making it an optimal carrier for efficient and specific delivery of ribozymes into the cytoplasm: VAI is transcribed by the RNA Polymerase III, which drives high levels of expression, its secondary and tertiary structure confers high stability to the transcribed molecule, and VAI is specifically sorted into the cytoplasm, where the activity of the ribozyme is required. c) Transfection of a human glioma cell line, U87, with plasmids harbouring the anti-VEGF ribozyme-VAI « hybrid » molecules, and d) ELISA measurement of VEGF secretion from transfected glioma cells. By this assay we have demonstrated that, in a transient transfection experiment, the time course of the ribozyme transcription is inversely correlated with extracellular VEGF secretion by transfected cells. Thus, we have shown that an efficient expression of the ribozyme is required to obtain an effect on VEGF secretion, and we are now producing new retroviral vectors aimed at the delivery of the antiangiogenioc ribozymes directly in vivo into experimentally-induced intracranial gliomas in rats.

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Thérapie génique des carcinomes hépatocellulaires et des glioblastomes : ciblage du récepteur à l'urokinase par des rétrovirus amphotropes à enveloppe modifiée

Boucquey A ¹, Franco D ¹, Weber A ¹, Horellou P ¹

¹ EMI 00-20, Hôpital Antoine-Béclère, 157, rue de la Porte-de-Trivaux, 92141 Clamart cedex.

Obtenir un ciblage spécifique des cellules cancéreuses par des vecteurs rétroviraux constitue une étape-clé dans le développement de protocoles de thérapie génique. Il a été montré qu'une forte proportion de carcinomes hépatocellulaires (CHC) et de glioblastomes (GB) expriment le récepteur à l'urokinase (uPAR), dont les taux d'expression sont également corrélés au potentiel invasif de ces tumeurs. Disposant d'un panel de lignées cellulaires humaines de GB et de CHC, nous avons évalué leur taux d'expression de l'uPAR, par western-blot. Un anticorps anti-uPAR humain a permis de détecter l'expression d'une protéine de 55 kDa dans la lignée de CHC HuH 7, ainsi que dans 4 lignées de GB sur les 7 testées, avec une expression plus intense pour les lignées SNB19, U399 et SF126. La lignée U87 présentait une plus faible expression de la protéine, et l'expression de l'uPAR n'était pas détectable dans les lignées SKMG12, U373 et T98G.

Afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales à fort potentiel invasif, nous avons réorienté le tropisme de rétrovirus amphotropes (MoMuLV) vers l'uPAR en modifiant la glycoprotéine d'enveloppe. Pour ce faire, nous avons généré deux types d'enveloppes recombinantes, en incorporant un ligand de l'uPAR à la sous-unité SU de l'enveloppe virale. Nous avons choisi d'une part le fragment aminoterminal de l'urokinase (ATF), d'une taille de 115 acides aminés (aa) contenant la région de fixation de la protéase à son récepteur. Notre choix pour le deuxième ligand s'est porté sur la partie restreinte de l'ATF au domaine de liaison de l'uPA à l'uPAR, d'une taille de 19 aa. Nous avons montré que les protéines d'enveloppe modifiées étaient correctement maturées et que les rétrovirus recombinants résultants étaient infectieux, notamment sur les lignées de GB et de CHC. Pour améliorer l'infectivité du rétrovirus, nous avons intercalé un peptide de jonction comprenant un site de clivage à une protéase, l'urokinase, entre le ligand et la sous-unité SU. Ce peptide a permis d'augmenter la transduction des cellules cibles.

Nos résultats suggèrent que l'uPAR est un candidat de choix dans l'élaboration de stratégies de ciblage rétroviral des cellules tumorales humaines, et valident la stratégie d'infection en deux étapes.

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La surexpression de la décorine humaine à l'aide d'un vecteur adénoviral induit in vivo, localement et à distance, un effet pro-apoptotique spécifique des cellules tumorales

Tralhão JG ¹, Schaefer L ³, Evaristo C ¹, Schonherr E ³, Micegova M ³, Kayal S ⁴, Veiga-Fernandes H ⁵, Danel C ¹, Aresta S ⁶, Kresse H ³, Lemarchand P ¹

¹Inserm E0016, Faculté Necker-Enfants malades, Paris ; ³ Département de médecine interne, Université de Münster, Allemagne ;
⁴ Inserm U. 411 ; ⁵ Inserm U345, Faculté Necker-Enfants malades ;
⁵ Inserm U. 528, Institut Curie, Paris.

La décorine (DCN) est un protéoglycan ubiquitaire de la matrice extracellulaire. La surexpression de la DCN dans des lignées tumorales humaines induit une surexpression de p21^WAF1, inhibiteur puissant de l'activité des kinases cyclines-dépendantes, et freine la croissance tumorale in vitro et in vivo. Nous avons voulu évaluer in vivo l'effet antitumoral autocrine et paracrine de la surexpression de la DCN à l'aide d'un vecteur adénoviral (Ad DCN). Une injection intratumorale ou intraveineuse d'AdDCN induit in vivo une réduction du volume des tumeurs humaines xénogéniques chez la souris nude, par apoptose des cellules tumorales. L'apoptose a été evaluée par l'analyse du cycle cellulaire par FACS (présence d'un pic en sous-G1) et in vivo par Tunel. L'injection intratumorale d'AdDCN entraîne une inhibition de la croissance non seulement de la tumeur injectée, mais également d'une tumeur controlatérale non injectée, montrant ainsi un effet antitumoral à distance. L'étude par immunohistochimie avec des anticorps anti-DCN et la quantification de la DCN dans les tumeurs, confirme la migration de la DCN dans la tumeur située à distance du point d'injection. L'apoptose des cellules tumorales, induite par la DCN, est indépendente du background génétique des cellules tumorales humaines testées. Cet effet pro-apoptotique semble lié à l'expression forte du gène de la DCN obtenue par l'utilisation d'un vecteur adénoviral. De plus, cet effet pro-apoptotique est spécifique des cellules tumorales, aucune apoptose ni inhibition de croissance n'ayant été observée dans des cellules humaines non tumorales (hépatocytes, Huvec et fibroblastes). Ces résultats soulignent l'intérêt de la thérapie génique par le transfert adénoviral du gène de la DCN, en tant que nouvelle approche du traitement du cancer primaire et métastasé.

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Optimisation du schéma de thérapie génique locale par injection intratumorale itérative de gène p53 sauvage complexé à la polyéthylènimine glucosylée dans les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou

Merlin JL ¹, Dolivet G ¹, Barberi-Heyob M ¹, Erbacher P ², Behr JP ², Guillemin F ¹

¹ Centre Alexis-Vautrin, Vandœuvre-lès-Nancy ; ² Faculté de Pharmacie, Illkirch.

Nos premiers résultats in vitro [Merlin, et al. Cancer Gene Therapy 2001] et in vivo [Merlin, et al. Clin Cancer Res 2001] ont montré l'intérêt du transfert du gène sauvage de p53 complexé à la polyéthylènimine glucosylée (PEIglu) dans les cancers épidermoïdes de la tête et du cou. L'étude présente rapporte les essais d'optimisation du schéma de thérapie génique par administration intratumorale itérative dans des xénogreffes de cancers humains de la tête et du cou.

L'étude quantitative des cinétiques d'expression transgénique a été menée en utilisant la luciférase comme gène rapporteur et a permis d'optimiser le schéma d'administration. L'efficacité thérapeutique du transfert du gène p53 sauvage a été ensuite évaluée par étude d'inhibition de croissance de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nude. Différents schémas d'administration de complexes PEIglu/ADN ont été évalués par injections intratumorales itératives hebdomadaires ou bi-hebdomadaires pendant 8 à 10 semaines consécutives). L'expression maximale du transgène est observée 48 h après injection. Chez les souris traitées en schéma hebdomadaire pendant 5 semaines, l'effet inhibiteur de la croissance tumorale apparaît lié à la durée de la thérapie génique et la croissance tumorale est retardée pendant plus de 8 semaines. En schéma bi-hebdomadaire, aucune différence n'est observée entre 1, 3 et 5 semaines de traitement. Le retard de croissance tumorale observé est supérieur et plus durable pour les tumeurs de petite taille (150 mm³) par rapport aux tumeurs de taille supérieure (500 mm³) pour lesquelles la croissance reprend dès l'arrêt de la thérapie génique.

Ces résultats confirment l'intérêt potentiel de la polyéthylènimine glucosylée pour le développement d'un schéma itératif de thérapie génique locale pour le transfert de gène p53 sauvage dans les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou.