Pharmacologie - Communication 147 à 170

ARTICLE

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Un puissant dérivé de l'acronycine, S 23906-1, est actif par voie orale dans des modèles métastatiques de cancer du côlon humain

Kraus-Berthier L, Chacun-Beaudenon C, Jan M, Rouillon MH, Hickman JA, Pierré A

Institut de recherches Servier, Division de cancérologie, 11, rue des Moulineaux, 92150 Suresnes.

Le S 23906-1 est un nouvel agent cytotoxique actuellement en développement préclinique, qui possède un profil pharmacologique original. Ce dérivé diester de la benzoacronycine se caractérise in vitro par une puissante activité cytotoxique en essai clonogénique et par des perturbations du cycle cellulaire originales, différentes de celles de la plupart des agents anticancéreux. In vivo, il présente une sélectivité pour les tumeurs solides humaines par rapport aux tumeurs murines [Guilbaud, et al. Clin Cancer Res 2001 ; 7 : 2573]. Le but de cette étude a été d'évaluer l'activité antitumorale de ce composé, administré par voie orale, dans des modèles orthotopiques de tumeurs humaines de côlon greffées sur le caecum de souris nude. Trois tumeurs coliques ont été greffées au jour 0 : HT29, LS174T et HCT116. Dans les trois modèles, le traitement des animaux avec le S 23906-1, administré de 1,56 mg/kg à 6,25 mg/kg (J12, 22), se traduit par une inhibition significative de la croissance de la tumeur primaire. Un effet comparable est obtenu après traitement des animaux par un produit utilisé en clinique dans le traitement du cancer colique, l'irinotecan, administré à 40 mg/kg par voie iv (J12-16). Aux doses maximales tolérées, les valeurs de T/C (croissance tumorale) obtenues avec le S 23906-1 sont comprises entre 13 % et 30 % versus 21 % et 45 % pour l'irinotecan. L'étude histologique des différents organes prélevés à la fin de l'expérience dans le modèle HCT116 montre que l'administration de S 23906-1 supprime totalement la carcinose péritonéale ainsi que la formation de métastases hépatiques, pulmonaires et ganglionnaires (ganglions lymphatiques mésentériques). Des études toxicologiques sont en cours pour compléter l'évaluation préclinique de ce composé. Sa puissance et son efficacité par voie orale permettent d'envisager un développement clinique.

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Le 3,5,4'-triméthoxystilbène, dérivé du resvératrol, est un nouvel agent anti-mitotique provoquant une déstructuration du réseau microtubulaire

Schneider Y¹, Launay JF², Coelho D³, Chabert P, Gossé F², Fischer B², Bischoff P, Raul F

Laboratoire d'oncologie nutritionnelle, Inserm U. 392, Ircad ;
¹ Inserm U. 381 ; ² Laboratoire de cancérologie expérimentale, ULP ;
³ Laboratoire de chimie des polyphénols CNRS UMR 7509, Strasbourg.

Nos précédents travaux ont mis en évidence le pouvoir anti-cancérogène du resvératrol, un polyphénol présent dans le raisin et le vin [1, 2]. L'objectif de ce travail vise à déterminer le potentiel antiprolifératif d'un dérivé du resvératrol, le 3,5,4'-triméthoxystilbène (R3), sur les cellules cancéreuses coliques humaines de la lignée Caco2, ainsi qu'à élucider son mécanisme d'action.

L'addition de R3 dans le milieu de culture entraîne une inhibition dose-dépendante de la croissance des cellules Caco2. Une inhibition partielle de la prolifération cellulaire est observée à la concentration de 0,2 muM, celle-ci devient totale pour une concentration de 0,4 muM. Le composé R3 ne présente aucun effet pro-apoptotique (marquage à l'annexine V), ni cytotoxique (absence de relargage de lactate dehydogénase dans le milieu de culture). L'étude du cycle cellulaire montre que R3 induit un blocage des cellules au niveau de la phase de transition G2/M. Par une étude en immunofluorescence à l'aide d'anticorps anti-tubuline, il a été montré que ce blocage a pour origine une dépolymérisation du réseau microtubulaire. De plus, des études de binding in vitro montrent que R3 est un inhibiteur non compétitif de la colchicine, ce qui suggère l'existence d'un site spécifique de liaison sur la tubuline.

En conclusion, R3 possède un potentiel anti-prolifératif important en provoquant une dépolymérisation du réseau microtubulaire. Ces propriétés sont similaires à celles mises en évidence pour certains agents anticancéreux en cours d'évaluation clinique (combrétastatine A4). Compte tenu de sa faible cytotoxicité, ce composé pourrait se révéler prometteur dans le cadre d'une application en chimiothérapie anticancéreuse.

1. Schneider Y, et al. Cancer Lett 2000 ; 158 : 85-91.

2. Schneider Y, et al. Nutr Cancer 2001 ; 39 : 102-7.

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Caractérisation d'une lignée cellulaire résistante au S23906-1, un nouveau dérivé de l'acronycine

Léonce S, Pérez V, Lambel-Giraudet S, Hickman JA, Pierré A

Institut de recherches Servier, Division de cancérologie, 92150 Su-resnes.

Le S23906-1 est un dérivé synthétique de la benzoacronycine ayant un profil pharmacologique original. Dans le but d'étudier son mécanisme d'action, la lignée de carcinome épidermoïde humain KB-3-1 a été rendue résistante au S23906-1 par une exposition croissante au produit. La lignée ainsi sélectionnée (KB/S23-500) est résistante à 500 nM de S23906-1 (facteur de résistance 15), stable pendant au moins 2 mois, et résistante dans des conditions de culture tridimensionnelle. Les cellules KB/S23-500 greffées en sous-cutané chez la souris nude forment des tumeurs solides qui sont significativement moins sensibles au S23906-1 que les cellules KB-3-1. Des analyses, par cytométrie en flux, montrent que la résistance n'est pas liée à une surexpression de P-glycoprotéine (marquage MRK16) ou d'autres protéines impliquées dans les phénotypes de résistance multidrogue (accumulation de rhodamine 123). Les tests d'inhibition de la prolifération révèlent que les cellules KB/S23-500 ne sont pas résistantes aux poisons du fuseau (NVB, TXL, VCR), présentent une faible résistance croisée (facteur de 1,5 à 4) aux inhibiteurs de topo-isomérase I et II (CPT, VP16 topotécan) et une résistance significative (6 à 8 fois) aux dérivés du platine et à la cytosine arabinoside. Il est intéressant de noter que les cellules KB-3-1 et KB/S23-500 ont la même sensibilité au dérivé diol du S23906-1, lui-même inactif dans les modèles in vivo. Cette dernière observation fait de la lignée KB/S23-500 un outil intéressant pour disséquer le mécanisme moléculaire du S23906-1. Le S23906-1 induit, dans les cellules sensibles, une surexpression de la cycline E suivie d'un arrêt en phase S et d'une mort par apoptose. Dans les cellules résistantes, le S23906-1 induit une perturbation similaire du cycle cellulaire, mais qui n'est pas précédée d'une augmentation de la cycline E, et la réponse apoptotique est plus faible. Des études complémentaires sont en cours pour déterminer le lien entre cycline E et apoptose afin de mieux comprendre les propriétés cytotoxiques du S23906-1.

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Mise en évidence des propriétés antitumorales de la fractalkine

Vitale S, Huet A, Juhel T, Gavelli A, Millet MA, Bourget I, Rossi B, Schmid-Alliana A

Inserm U. 364, Faculté de médecine, avenue de Valombrose, Nice Cedex 02.

Les chimiokines représentent une famille de petites protéines solubles capables de réguler la migration des cellules hématopoïétiques. Aujourd'hui, il apparaît clairement qu'elles sont les médiateurs essentiels de l'infiltration des leucocytes dans les tumeurs. Le transfert de gènes codant pour les chimiokines offre la possibilité de modifier le recrutement des leucocytes dans les tumeurs et ouvre ainsi une nouvelle voie d'approche pour la thérapie des cancers : l'immunothérapie génique.

Ainsi, des travaux ont mis en évidence que le transfert de gènes de chimiokines comme la 6Ckine/SLC, le MIP1alpha, ou le MCP1 dans les cellules tumorales entraîne un ralentissement du développement de la tumeur en favorisant le recrutement intratumoral de cellules possédant une activité tumoricide. Dans ce contexte, nous avons testé les propriétés antitumorales de la fractalkine (FKN), une chimiokine capable d'attirer les cellules natural killer et les lymphocytes T CD8⁺, deux types cellulaires dotés d'activité cytolytique vis-à-vis des cellules tumorales. Nous avons utilisé un modèle expérimental de métastases de tumeurs coliques chez la souris. Ce modèle utilise des cellules carcinomateuses coliques des lignées C26 et CT26 qui présentent la propriété de générer des tumeurs solides lorsqu'elles sont injectées chez la souris syngénique Balb/c. Ces cellules ont été transfectées par un ADN complémentaire codant pour la fractalkine permettant l'obtention de transfectants stables C26-FKN et CT26-FKN exprimant la fractalkine sous ses formes membranaires et solubles.

Nous avons ainsi pu constater que l'injection sous-cutanée de cellules C26 et CT26 non transfectées (C26-wt et CT26-wt) conduit à l'apparition de tumeurs dès 3 jours post-injection alors que les tumeurs ne sont observables qu'à partir de 10 jours après injection de cellules C26-FKN et CT26-FKN. De plus, le volume des tumeurs CT26-FKN est significativement réduit comparé au volume des tumeurs CT26-wt. En effet, au 36^e jour post-injection, la médiane du volume des tumeurs CT26-FKN est de 0 mm³ alors que celle des tumeurs CT26-wt est de 2 983 mm³. L'injection de cellules C26-FKN et C26-wt au niveau du foie conduit à des résultats similaires puisque les tumeurs hépatiques C26-wt présentent un volume médian de 114 mm³ tandis que les tumeurs hépatiques C26-FKN ont un volume médian de 8 mm³, ce qui correspond à une diminution de 93 % du volume des tumeurs hépatiques. Par ailleurs, l'injection sous-cutanée de cellules C26-wt et C26-FKN chez des souris nude (souris déplétées en lymphocytes T) n'entraîne pas de modification significative dans l'apparition des tumeurs par rapport aux souris immunocompétentes. Ce résultat suggère que les lymphocytes T ne sont pas des effecteurs essentiels de la réponse antitumorale induite par la fractalkine.

L'ensemble de ces résultats semble indiquer que la fractalkine, exprimée directement par les cellules tumorales, est capable de retarder le développement de la tumeur. Cet effet est observable au niveau sous-cutanée mais aussi au niveau hépatique, ce qui s'avère d'un intérêt majeur compte tenu de la capacité des tumeurs coliques à générer des métastases dans le foie. D'autre part, l'action antitumorale exercée par la fractalkine ne semble pas être médiée par un recrutement intratumoral de lymphocytes T. Dans le futur, la caractérisation des mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine des effets antitumoraux de la fractalkine pourrait conduire à la mise en place d'un essai d'immunothérapie génique des métastases hépatiques des tumeurs du côlon.

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Le traitement par la cystémustine induit un facteur sérique anti-mélanome

Demidem A ¹, Morvan D ^{2, 3}, Papon J ¹, De Latour M ³, Madelmont JC ¹

¹ UMR 484 Inserm ; ² Université d'Auvergne ; ³ Centre Jean-Perrin, 63005 Clermont-Ferrand.

La cystémustine est une chloroéthylnitrosourée proposée dans le traitement du mélanome. Sa principale cible est l'ADN. Nous avons montré récemment que les tumeurs traitées par la cystémustine induisaient un effet protecteur contre les tumeurs secondaires non traitées. Pour mieux comprendre la modulation de la fonction immunitaire après cystémustine, nous avons testé le versant humoral de l'immunité à l'aide de sérums provenant de donneurs porteurs de mélanome B16 traités par la cystémustine, administrés à des receveurs syngéniques porteurs de tumeur B16 non traitées. Les cellules de mélanomes sont injectées en sc à des souris C56BL6/6J. Deux groupes de donneurs de sérum ont été réalisés : l'un porteur d'une tumeur non traitée, l'autre porteur d'une tumeur traitée par la cystémustine. La cystémustine a été administrée à 15 mug/g par voie it. Les sérums des donneurs ont été prélevés à J30 de l'évolution tumorale. Trois groupes de receveurs porteurs de tumeurs sont comparés : le premier recevant du sérum provenant de donneurs sains (SDS), le second recevant du sérum provenant de donneurs porteurs de tumeurs non traitées (SDNT), le troisième recevant du sérum provenant de donneurs porteurs de tumeurs traitées par la cystémustine (SDT). L'administration des sérums par voie it s'effectue pendant 3 jours de J11 à J13 après l'inoculation des cellules tumorales, les tumeurs étant anatomiquement mesurables. En comparaison avec les SDS et SDNT, le SDT provoque une forte inhibition de la croissance tumorale. L'arrêt de la croissance tumorale a été observé dès la troisième injection du sérum. La différence de la masse tumorale est très significative (4,5 ± 1,1 versus 0,6 ± 0,2 g à J30, p < 0,001, SDNT versus SDT, Mann-Withney test). L'analyse histopathologique témoigne d'une forte altération de la vascularisation tumorale avec une baisse de l'index de densité de vascularisation (2,4 ± 1,4 versus 0,3 ± 0,5, p < 0,01 à J25, SDNT versus SDT) et d'une nécrose tumorale importante (surface nécrosée 29 ± 33 versus 71 ± 14 % à J25, p < 0,01, SDNT versus SDT).

En conclusion, le traitement par de faibles doses de cystémustine, à côté de ses effets génotoxiques, induit un facteur sérique anti-mélanome, ce facteur pouvant résulter d'une immunité humorale.

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La carence en méthionine potentialise l'effet du traitement par la cystémustine dans le mélanome murin

Morvan D ^{1, 2}, Papon J ¹, Madelmont JC ¹, Demidem A ¹

¹ UMR 484 Inserm ; ² Université d'Auvergne, 63005 Clermont-Ferrand.

La cystémustine est une chloroéthylnitrosourée proposée dans le traitement du mélanome. Sa principale cible est l'ADN. La carence en méthionine est considérée comme un moyen de réduire la résistance des tumeurs présentant différents degrés de dépendance à la méthionine. Parmi les mécanismes pressentis figure l'inhibition de l'alkyl-guanine-transférase. Récemment, nous avons montré que la cystémustine ciblait le métabolisme de la méthionine dans le mélanome B16 en augmentant le taux intratumoral de certains accepteurs de méthyle (créatine). Pour poursuivre l'investigation de l'interférence entre le traitement par la cystémustine et le métabolisme de la méthionine, nous avons étudié l'effet de la carence en méthionine sur le mélanome B16 traité par la cystémustine.

Les receveurs C57BL6/6J reçoivent en sc une injection de 0,5 x 10⁶ cellules de mélanome B16. Les receveurs sont partagés en groupes recevant une alimentation standard (STD) ou une alimentation carencée en méthionine de J11 à J17 (CAR). Pour chacun des régimes alimentaires, les receveurs sont subdivisés en groupes non traités (NT) et traités (TR) par la cystémustine (3 injections de 15 mug/g it à J11, J14, J18). Concernant la toxicité générale du régime CAR, il est observé une perte de poids des receveurs de 13 % à J18 dans le groupe CAR/NT (p < 0,01, CAR/NT versus STD/NT, Mann-Whitney test) et de 21 % à J18 dans le groupe CAR/TR (p < 0,01, CAR/TR versus STD/TR), réversible à l'arrêt du régime CAR. Concernant l'effet sur la tumeur du régime CAR, il est observé : 1) une réduction de la masse tumorale de 51 % à J14 et de 69 % à J18 dans le groupe CAR/NT (p < 0,01, CAR/NT versus STD/NT) réversible à l'arrêt du régime CAR (recalage des courbes de croissance des groupes CAR/NT et STD/NT vers J32) ; et 2) une réduction de la masse tumorale de 53 % à J32 dans le groupe CAR/TR (p < 0,02, CAR/TR versus STD/TR).

Ces résultats témoignent que le régime carencé en méthionine : 1) a un effet d'inhibition de croissance, réversible, sur mélanome non traité ; 2) a un effet de potentialisation de l'action de la cystémustine en prolongeant la période d'inhibition de croissance du mélanome traité.

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Modification de la résistance aux agents anticancéreux par des anticorps induits chez des souris immunisées par un vaccin contre la glycoprotéine P170 (mdr1) : analyse de l'expression des gènes impliqués dans ce processus

Roblin-Pawlak C, Perrin L, Lemarteleur T, Ventéo L, Madoulet C

Laboratoire de biochimie, EA 3306, IFR53 biomolécules, UFR Pharmacie, 51096 Reims Cedex.

Parmi les mécanismes de résistance des cellules tumorales à la chimiothérapie, la multidrug resistance (MDR) est sans nul doute le mieux connu, faisant intervenir la glycoprotéine P170 responsable de l'efflux des médicaments. Cette protéine est le produit du gène MDR1 chez l'homme et des isoformes mdr1, mdr3 chez la souris conférant la résistance et d'un autre gène mdr2 chez l'animal non impliqué dans ce mécanisme. Une préparation vaccinale à base de liposomes, gel d'alumine et de lipopeptides correspondant aux boucles extracellulaires 1, 2 et 4 de la P170 murine a été injectée chez la souris B6D2F1. Les sérums prélevés chez la souris et contenant les anticorps induits par vaccination ont été testés ex vivo sur des lignées de leucémie murine L1210 (R), de type monocytique P388 (R) et fibroblastique LM(tk^-)(R) résistantes à la doxorubicine. Les cellules P388 (R) et L1210 (R) cultivées en présence des anticorps induits redeviennent sensibles à la doxorubicine et à la vinblastine. La réversion de chimiorésistance par les anticorps induits dans les deux types cellulaires est identique à celle observée lorsque ces mêmes cellules sont traitées par le vérapamil 3 muM. Dans la lignée P388 (R), seul le gène mdr1 est exprimé tandis que dans les cellules L1210 (R), les deux gènes mdr1 et mdr3 le sont. Dans les cellules fibroblastiques LM(tk^-)(R), nos anticorps et le vérapamil n'exercent aucun effet sur la réversion de la résistance. Par ailleurs, les cellules fibroblastiques surexpriment mdr3.

En conclusion, il semble que le retour à la sensibilité aux agents anticancéreux des cellules résistantes en présence d'anticorps anti-P170 induits nécessite l'expression du gène mdr1, démontrant la spécificité de notre approche vaccinale.

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Modulation de l'expression des gènes de chimiorésistance MDR1 et MRP1 sous l'action de la trichostatine A (TSA) dans des cellules de cancer bronchique à petites cellules H69 sensibles et résistantes à l'étoposide

El Khoury V ¹, Trussardi-Régnier A ¹, Yatouji S ^{1, 3}, Liautaud-Roger F ², Trentesaux C ¹, Dufer J ¹

¹ Unité MéDian, CNRS UMR6142,IFR53, Faculté de pharmacie, Reims ; ² Institut Jean-Godinot, Reims ; ³ Faculté de médecine, Université de Monastir, Tunisie.

La résistance à la chimiothérapie dans les cancers est souvent une cause d'échec thérapeutique. C'est pourquoi l'étude de la régulation de l'expression de gènes majeurs de résistance tels que MDR1 et MRP1 peut être importante. Des résultats antérieurs ont montré une altération de la texture nucléaire et une accessibilité de l'ADN accrue dans des cellules d'adénocarcinome ovarien résistantes à la vincristine (OV1/VCR) et surexprimant le gène MDR1 comparées aux cellules de la lignée parentale (IGROV1). Une hyperacétylation de l'histone H4 a également été observée dans ces cellules résistantes.

L'étude présente a concerné des cellules de cancer bronchique à petites cellules H69WT et leurs dérivés résistants à l'étoposide H69VP. Ces cellules résistantes expriment les gènes MDR1 et MRP1. L'analyse de la sensibilité de la chromatine à la DNase I montre que les cellules H69VP résistantes présentent, comme les cellules OV1/VCR, une accessibilité accrue de l'ADN. Afin d'analyser si une « ouverture » de la chromatine pouvait être impliquée dans la régulation de l'expression des gènes MDR1 et MRP1, des cellules H69WT et H69VP ont été traitées par un inhibiteur des histones désacétylases, la trichostatine A (TSA, 100 ng/ml). Dans la lignée H69WT sensible, le traitement par la TSA induit une expression du gène MDR1 mais ne module pas l'expression du gène MRP1. À noter qu'aucune variation significative n'a pu être mise en évidence également au niveau du gène ubiquitaire beta2-microglobuline. En revanche, dans les cellules H69VP, le traitement par la TSA induit une diminution de l'expression du gène MDR1, sans modulation significative des autres gènes analysés.

Il semblerait donc que, dans les lignées H69WT et H69VP, la régulation transcriptionnelle du gène de résistance MDR1 puisse être, contrairement à celle du gène MRP1, associée à des variations de la structure chromatinienne.

Ce travail a été financé par l'ARERS et le Comité départemental des Ardennes de la Ligue française contre le cancer.

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Recherche de gènes impliqués dans la résistance des cellules cancéreuses coliques de rat au cisplatine par hybridation soustractive

Isambert N ¹, Chapusot C ², Sergent C ¹, Hammann A ¹, Chauffert B ^{1, 3}

¹ Unité Inserm 517, Faculté de médecine, Dijon ; ² Service d'anatomie et de cytologie pathologiques, Centre hospitalier universitaire, Dijon ; ³ Centre régional de lutte contre le cancer Georges-François-Leclerc, Dijon.

Le cisplatine est un médicament anticancéreux utilisé avec succès dans le traitement de certaines tumeurs solides humaines (cancer du testicule ou de l'ovaire). Cependant, son efficacité est faible dans d'autres tumeurs comme les cancers du côlon. Il n'existe pas d'explication univoque de cette chimiorésistance intrinsèque ou acquise : diminution de l'accumulation intracellulaire du platine, augmentation de la détoxification intracellulaire par des composés à fonction thiol, modification des systèmes de réparation de l'ADN (mismatch repair, nucleotide excision repair...), tolérance accrue aux adduits, protection des cellules vis-à-vis de l'apoptose chimio-induite.

Afin d'explorer les mécanismes moléculaires de la résistance des cellules cancéreuses au cisplatine, une hybridation soustractive a été réalisée entre une lignée cellulaire de cancer colique de rat sensible au cisplatine (PROb) et la sous-lignée résistante (CP33). Cette technique a permis de mettre en évidence la surexpression d'une trentaine de gènes dans les cellules résistantes. Nous avons contrôlé la surexpression des gènes du facteur d'élongation 1alpha, de la cytochrome oxydase, du transporteur du monocarboxylate 1 (MCT1) et de la cathepsine L dans CP33 par des méthodes indépendantes comme la RT-PCR, le northern-blot ou le western-blot. En RT-PCR, seul le gène de la cathepsine L est retrouvé surexprimé avec certitude d'un facteur 2,3 dans les cellules CP33. La surexpression du facteur d'élongation 1alpha est plus discutable. Il n'y a pas de surexpression de MCT1, ni de la cytochrome oxydase. Les analyses en northern-blot et en western-blot n'ont pas montré de surexpression dans les cellules résistantes pour les quatre gènes étudiés et les protéines correspondantes. Compte tenu de la surexpression du gène de la cathepsine L, une enzyme lysosomale, nous avons évalué le nombre de lysosomes dans les cellules sensibles et résistantes par microscopie de fluorescence et par cytofluorimétrie en utilisant l'acridine orange. En microscopie de fluorescence, les cellules CP33 apparaissent plus grosses au niveau du cytoplasme et du noyau. Elles contiennent plus de lysosomes. Cette impression visuelle est confirmée par la cytofluorimétrie qui a permis d'évaluer l'augmentation du nombre de lysosomes à un facteur 1,8. Toutefois, l'inhibition de l'activité lysosomale par la bafilomycine A₁ ne modifie pas le degré de résistance des CP33.

Le manque de spécificité des résultats obtenus amène à discuter de la validité de la technique d'hybridation soustractive, même si cette méthode semblait séduisante pour explorer les différences moléculaires entre cellules cancéreuses sensibles et résistantes aux médicaments de chimiothérapie.

Ce travail a été réalisé grâce au soutien des comités de la Saône-et-Loire et de la Haute-Marne de la Ligue nationale contre le cancer et à l'attribution d'une bourse de l'Association pour la recherche sur le cancer.

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Utilisation d'anticorps monoclonaux anti-idiotypiques du VEGF pour le ciblage des vaisseaux tumoraux

Pagès F ¹, Andoins C ¹, Fons P ^{1, 2}, Trombe M ^{1, 2}, André K ¹, Plouët J ²

¹ Société AbTech, 151, bd du Montparnasse, 75006 Paris ; ² GDR 1927, IPBS, 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse.

La compréhension de l'importance du vascular endothelial growth factor (VEGF) dans le processus angiogénique qui accompagne le développement tumoral a permis l'émergence de nouvelles thérapies antitumorales fondées sur leur potentiel anti-angiogénique. Si le rôle physiologique du VEGF n'est qu'imparfaitement compris actuellement, il est néanmoins connu que le VEGF se lie aux cellules endothéliales sur plusieurs récepteurs. Au sein du laboratoire, nous avions déterminé que l'activation du VEGFR2 suffisait à déclencher l'angiogenèse tumorale sans affecter les vaisseaux sains. Nous avons développé des nouveaux vecteurs de ciblage du VEGFR2.

Nous avons, dans un premier temps, immunisé des souris avec des anticorps anti-VEGF et fusionné leurs splénocytes avec des myélomes murins. La sélection de ces anticorps monoclonaux anti-idiotypiques du VEGF a été évaluée par Elisa (capture par IgG anti-VEGF) et radiorécepteur essai (domaine extracellulaire du VEGFR2). La spécificité pour VEGFR2 a été confirmée par Elisa (capture par le domaine extracellulaire de VEGFR1 ou VEGFR2). L'activité agoniste de ces anticorps anti-idiotypiques a été confirmée par la mesure de leur effet mitogène sur des cellules endothéliales humaines provenant de cordon ombilical. Injectés chez des souris Balb/c porteuses de greffes de cellules de cancer de sein TS/A (1-5 mg/kg, 2 fois par semaine), ces anticorps stimulent la croissance tumorale. Leur couplage à une toxine, la saporine, les rend cytotoxiques pour les cellules endothéliales angiogéniques (IC50 de l'ordre de 10 nM, alors que l'IC50 de la saporine seule est de l'ordre de 100 nM) et réduit significativement la progression de tumeurs murines ou humaines (50 mug/kg, 2 fois par semaine) sans affecter les vaisseaux sains. L'injection de quantité équivalente de saporine reste sans effet, ni curatif, ni délétère.

Nos résultats permettent ainsi d'envisager le développement d'une nouvelle thérapie antitumorale fondée sur sa capacité à inhiber la croissance des vaisseaux sanguins tumoraux. L'utilisation d'anticorps agonistes du récepteur VEGFR2 comme vecteur de ciblage de drogues cytolytiques permet de réduire de 10 à 100 fois les quantités d'anticorps et de toxine requises pour observer un effet antitumoral.

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Stabilité comparative du complexe entre l'ADN-topo-isomérase I et l'ADN en présence de dérivés de camptothécines et de benzo[c]phénanthridines

Wargnier R, Devy J, Cohen JHM ¹, Pluot M, Duval O ², Nabiev I, Sukhanova A

EA n° 3306 Interactions cellulaires et moléculaires en cancérologie ;
¹ EA n° 3309 Physiopathologie dysimmunitaire humaine, IFR n° 53 biomolécules, Université de Reims Champagne-Ardennes ; ² EA n° 921 SONAS, Université d'Angers.

L'ADN topo-isomérase I humaine (Top1) est une cible pour plusieurs agents antitumoraux. Son implication dans les changements de topologie de l'ADN au cours de processus comme la réplication a conduit à de nombreuses études sur ses inhibiteurs. Deux classes d'inhibiteurs de la Top1 sont connues : les poisons, qui stabilisent les complexes « clivables » entre l'enzyme et l'ADN, et les suppresseurs, qui bloquent la reconnaissance de séquences spécifiques d'ADN par la Top1. Dans cette étude, deux familles d'inhibiteurs de la Top1 ont été testées : les poisons camptothécines - CPT, topotécan, et les ben[c]phenanthridines (BZP : fagaronine, éthoxidine et dérivés) qui montrent un mode d'inhibition « poison » ou « suppresseur » en fonction de leur structure chimique.

La caractérisation quantitative en temps réel des interactions ADN-Top1 en présence ou non d'inhibiteurs a été menée par la technique de résonance plasmonique de surface Biacore^® en utilisant des oligonucléotides soit à forte affinité pour Top1 (OL-Top1), soit CPT-dépendant (OL-CPT). Les complexes binaires Top1-(OL-CPT) se forment avec une vitesse d'association (K_a) de 1,43 x 10⁵ M^{- 1}.s^{- 1} et se dissocient avec une vitesse k_d = 1,4 x 10^{- 1}.s^{- 1} tandis que les mêmes complexes avec OL-Top1 montrent les valeurs 1,58 x 10⁵ M^{- 1}.s^{- 1} et 2,7 x 10^{- 2}.s^{- 1}, respectivement. La présence de topotécan ne change pas le k_a pour les deux oligonucléotides étudiés mais diminue le k_d de 2 fois pour OL-Top1 et de 20 fois pour OL-CPT. En se basant sur le topotécan comme un modèle, nous avons monté le rôle suppresseur de l'éthoxidine et l'ambiguïté de la fagaronine à concentrations différentes. De plus, la caractérisation de trois autres dérivés des BZP nous permet de corréler le niveau d'inhibition vis-à-vis de Top1 avec leurs structures chimiques afin d'optimiser l'élaboration de nouveaux dérivés plus efficaces.

La technique Biacore^® apparaît comme un outil puissant pour un screening facile des molécules inhibitrices de Top1, mais aussi pour différencier le caractère poison ou suppresseur de celles-ci.

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La cytotoxicité de l'irofulvène dans les lignées cancéreuses est corrélée avec l'expression de protéines du système de réparation par excision de nucléotides

Koeppel F ¹, Poindessous V ¹, Raymond E ^{1, 2}, Lazar V ³, Sarasin A ⁴, Larsen AK ¹

¹ Laboratoire de biologie et pharmacogénétique des tumeurs humaines, CNRS UMR 8532 ; ² Département de médecine ; ³ Département de biologie clinique, Institut Gustave-Roussy, Villejuif ; ⁴ Laboratoire de génétique moléculaire, Institut André-Lwoff, Villejuif.

L'irofulvène (MGI114) est un nouvel agent antinéoplasique en cours de développement clinique, dérivé de la toxine illudine S produite par le champignon Omphalatus. Bien que son mécanisme d'action soit mal connu, il a été montré qu'il se lie de façon covalente aux macromolécules cellulaires, ce qui permet de le classer parmi le groupe des agents alkylants.

Nous avons étudié l'activité antiproliférative de l'irofulvène au sein d'un panel de 34 lignées cancéreuses humaines et comparée à celles d'un alkylant classique et d'un alkylant nouveau, respectivement le cisplatine et l'ET743 (ectéinascidine). Il en ressort que l'irofulvène a une forte activité cytotoxique sur une grande variété de lignées cancéreuses humaines d'origine épithéliale (poumon non à petites cellules, carcinomes ovariens et prostate). En revanche, une faible activité a été observée sur les lignées de sarcomes et les lignées leucémiques, ce qui est remarquable pour un agent alkylant. Le spectre d'activité sur le panel suggère de plus que l'irofulvène n'est pas l'objet des mécanismes classiques de résistance tels que la surexpression de pompes d'efflux membranaires ou la perte de la fonction de p53. Par ailleurs, nous avons montré que les cellules déficientes en protéines impliquées dans le système de réparation par excision de nucléotides (NER) présentent une forte sensibilité à l'irofulvène. Une étude menée sur un panel de 17 lignées cancéreuses a permis de comparer les valeurs d'IC50 pour l'irofulvène, le cisplatine et l'ET743 avec le niveau d'expression (mesuré par RT-PCR quantitative, TaqMan) de trois protéines du NER (ERCC1, XPD et XPG). Une corrélation nette entre l'expression de gènes du NER et la résistance cellulaire à l'irofulvène et dans une moindre mesure au cisplatine a été démontrée, tandis qu'aucune corrélation n'a été observée pour ET743.

Étant donné l'importance émergente du NER dans le développement du cancer (ovaire, poumon, côlon et prostate), ces résultats encouragent une utilisation thérapeutique du MGI114. Nos résultats suggèrent de plus que le niveau cellulaire des enzymes liées au NER peut être utilisé comme facteur prédictif pour la sensibilité cellulaire des cellules cancéreuses à l'activité cytotoxique de l'irofulvène.

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Détermination par une technique HPLC simple et rapide du rapport urinaire 6beta-hydroxycortisol/cortisol : inhibition de l'activité du cytochrome P450 3A4 par un agent pharmacomodulateur

Rouits E, Boisdron M, Morel A, Gamelin E

Inserm U. 564, CRLCC Paul-Papin, 49033 Angers.

Le cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) est la forme la plus importante des cytochromes chez l'homme. Il est responsable du métabolisme de près de 60 % des médicaments et donc à l'origine de nombreuses interactions. Il présente une grande variabilité interindividuelle de son expression. Il est également susceptible d'être induit ou inhibé par de nombreuses substances dont le jus de pamplemousse qui est responsable d'une puissante « inhibition-suicide ». La mesure du rapport urinaire 6beta-hydroxycortisol/cortisol (6beta-OHF/FC) est le seul vrai test non invasif permettant d'évaluer in vivo l'activité du CYP 3A4 et le prélèvement d'un échantillon urinaire le matin s'avère être un moyen fiable pour évaluer la variabilité interindividuelle, tout en conservant le confort du patient. Parmi les méthodes développées pour mesurer ce rapport, les méthodes HPLC (high performance liquid chromatography) sont les plus sensibles pour quantifier les stéroïdes.

L'objectif de notre travail a été de mettre en place dans un premier temps une méthode HPLC permettant de mesurer le rapport 6beta-OHF/FC urinaire afin d'étudier la variation d'activité du CYP 3A4 entre les individus et, dans un deuxième temps, d'étudier l'impact de l'administration de jus de pamplemousse à des témoins sur ce rapport afin d'obtenir un inhibition prolongée du cytochrome pour envisager d'utiliser cette substance comme agent modulateur. Nous avons alors développé une méthode consistant en une extraction liquide/liquide suivie d'une analyse HPLC par gradient et une détection UV. La quantification des deux substances est possible de 10 à 5 000 ng/ml et 5 à 2 500 ng/ml respectivement pour 6beta-OHF et FC. Notre technique d'analyse est plus rapide, plus simple et peu coûteuse, donc largement diffusible. Nous avons rendu notre méthode compatible avec l'ingestion de jus de pamplemousse, évitant ainsi les interférences générées par cette substance dans l'urine. En effet, le rapport urinaire 6beta-OHF/FC a été mesuré chez des volontaires sains avant et après ingestion de jus de pamplemousse et ce dernier entraîne une inhibition importante de 55 ± 14 % de l'activité du CYP 3A4 dès l'administration de 600 ml à raison de 3 fois 200 ml répartis sur 24 h. Il est donc possible d'envisager l'utilisation de cette substance comme agent modulateur du CYP 3A4, et plus particulièrement pour les médicaments anticancéreux métabolisés par cette enzyme.

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Quantification simultanée par RT-PCR capillaire en temps réel de marqueurs de résistance au 5-fluoro-uracile sur des cellules et des prélèvements tumoraux

Barbado M, Preisser L, Verrièle V, Boisdron-Celle M, Morel A, Gamelin E

Inserm U. 564, CRLCC Paul-Papin, 2, rue Moll, 49033 Angers.

La résistance tumorale, intrinsèque ou le plus généralement acquise au cours du traitement, est souvent à l'origine d'un échappement thérapeutique. Si un certain nombre des mécanismes de résistance en cause est connu, leur rôle réel et respectif en clinique est beaucoup plus difficile à évaluer. Cette situation est liée en grande partie aux difficultés rencontrées pour quantifier simultanément plusieurs marqueurs de résistance tumorale sur un unique prélèvement de taille réduite.

Pour tenter de résoudre ce problème, nous avons développé un protocole unique de quantification des ARNm de cinq marqueurs de résistance connus au 5-fluoro-uracile (5FU), médicament de référence dans les cancers digestifs : thymidine kinase (TK), thymidilate synthase (TS), dihydropyrimidine deshydrogénase (DPD), dihydrofolate réductase (DHFR), folylpolyglutamate synthase (FPGS). Dans un premier temps, un ADN standard composite a été construit permettant l'amplification des cinq marqueurs dans les mêmes conditions de PCR quantitative avec lecture de fluorescence en temps réel. L'intérêt de ce standard composite a ensuite été testé sur des lignées cellulaires coliques sensibles ou rendues résistantes au 5FU et sur différents prélèvements issus de patients, traités ou non par 5FU. Les ARN totaux ont été extraits à partir de tissus congelés, tumeurs primitives ou métastases hépatiques, dont la nature anatomopathologique est confirmée avant extraction des ARN. L'expression des ARNm des cinq marqueurs a ensuite été quantifiée, puis normalisée par rapport à l'expression d'un « gène de ménage » (glycéraldéhyde-3-phosphate). Malgré un échantillon de prélèvements réduit, nous avons ainsi pu valider notre technique de quantification des ARNm à l'aide d'une molécule standard composite.

Ces résultats montrent dans les prélèvements tumoraux après traitement au 5FU des variations plus marquées de l'expression des ARNm de protéines du cycle cellulaire (TS, TK) par rapport aux protéines du métabolisme (DPD, DHFR, FPGS). Notre approche est actuellement en cours d'exploitation en recherche clinique, et ces standards composites pourraient être à l'avenir développés de façon à caractériser différents mécanismes de résistance à un médicament, et peut-être orienter les décisions thérapeutiques.

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Efficacité de l'association capécitabine et mitomycine comme chimiothérapie des cancers colorectaux métastatiques : résultats préliminaires

Lièvre A ¹, Cervantes L ¹, Mitry E ¹, Vaillant JN ¹, Clavero-Fabri MC ¹, Dutin JP ², Beaumont-Raymont C ³, Ribet C ¹, Dupuy P ¹, Rougier P ¹

¹ Gastroentérologie et oncologie digestive, Hôpital Ambroise-Paré, 92100 Boulogne ; ² CH La Rochelle ; ³ CH Troyes.

L'intérêt d'une 3^e ligne de chimiothérapie chez les patients ayant un cancer colorectal métastatique (CCRM) en progression après CPT11 ou de L-OHP n'est pas démontré. Le 5FU en perfusion continue associé à des bolus de mitomycine C (M) est supérieur au 5FU seul [Ross, et al. Ann Oncol 1997). La capécitabine (X) a une efficacité comparable au Fufol [Van Cutsem, JCO 2001]. Nous avons évalué rétrospectivement l'efficacité et la tolérance de l'association XM après progression sous 2 ou 3 lignes de chimiothérapie.

Patients et méthodes. De janvier 2000 à novembre 2001, 14 patients ont été traités selon le protocole XM : M 7 mg/m² IV/6 semaines et X 2 000-2 500 mg/m²/j J1-J14 et J22-J35. Âge médian 61,8 ans (47-72), EG (OMS) 0 à 3, nombre de sites métastatiques 3 (1-7), 3^e ligne 6 patients et 4^e ligne 8 patients.

Résultats. 36,5 cycles de chimiothérapie ont été administrés (2,75 cycle/patient, 0,5-5). La durée médiane a été de 16,5 semaines et le suivi médian de 5,23 mois (0,62-9,80) ; dose-intensité médiane 93 % (50-100) pour X et 100 % (20-100) pour M. Réponse tumorale (11 patients évaluables, critères Recist) : RP = 1 (9 %), SD = 2 (18 %), contrôle tumoral 29 %, survie globale médiane 5,23 mois (0,66-9,80),
SSP médiane 4,07 m (2,07-5,25), toxicité de grade
3-4 NCI/patient (13 évaluables) : diarrhée 2/13, neutropénie 1/13, anémie 2/13, syndrome main-pieds 2/13. Aucun décès toxique et neutropénie fébrile. Toxicité maximale de grade 1 = 30 %, de grade 2 = 23 %, de grade 3 = 30 %, de grade 4 = 8 % et 3 arrêts pour toxicité.

Conclusion. Avec un taux de contrôle tumoral de 29 %, une survie médiane de 5,23 mois et une toxicité faible, l'association XM est une alternative au traitement symptomatique chez les patients ayant un CCRM en progression après 2 ou 3 lignes de chimiothérapie et demandeurs de chimiothérapie. Son évaluation en première ligne est souhaitable.

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Influence de p53 sur la sensibilité aux agents alkylants de cellules de carcinomes humains : comparaison de modèles expérimentaux

Allagnat F ¹, Hubert C ¹, Comisso M ¹, Raymond E ^{1, 2}, Larsen AK ¹

¹ Physicochimie et pharmacologie des macromolécules biologiques, CNRS, UMR 8532 ; ² Département de médecine, Institut Gustave-Roussy, Villejuif.

Le dysfonctionnement du gène suppresseur de tumeur codant pour la protéine p53 est l'aberration génétique la plus fréquente dans les tumeurs humaines. Cependant, l'influence de p53 sur la sensibilité aux agents anticancéreux reste hautement controversée. Nous avons étudié l'influence de p53 sur la sensibilité de deux modèles de carcinome du côlon à différents agents alkylants classiques (cisplatine, oxaliplatine) et nouveaux (irofulven, ectéinascidine 743). Un modèle basé sur les lignées HCT116 et HCT116 DELTAp53 dont le gène p53 a été invalidé par recombinaison homologue et un modèle composé des lignées RKO néo et RKO E6 transfectée avec le gène codant pour la protéine E6 du virus humain du papillome qui cible la protéine p53 pour la dégradation par le protéasome. Dans le cas de l'utilisation d'agents récents tels que l'irofulven et l'ET743, les deux modèles démontrent que la perte de fonction de p53 n'a pas d'influence sur la cytotoxicité. De manière inattendue, les deux modèles donnent des résultats différents sur l'effet de p53 sur la sensibilité aux dérivés du platine. Dans le modèle HCT116, la perte de fonction de p53 s'accompagne d'une résistance à l'oxaliplatine soixante fois plus importante alors qu'elle n'est augmentée que d'un facteur deux dans le modèle RKO. Dans le cas du cisplatine, la résistance augmente d'un facteur trois dans le modèle HCT116 et diminue d'un facteur deux dans le modèle RKO. Les analyses par western-blot démontrent que, bien que non détectable dans les lignées RKO néo et E6 non traitées, la protéine p53 est présente dans les deux lignées après traitement.

Ce résultat démontre qu'en cas de stress génotoxique, la dégradation de p53 par E6 est insuffisante dans ce modèle. Si ces résultats permettent d'expliquer en partie les différences observées entre les deux modèles pour l'oxaliplatine, d'autres facteurs doivent rentrer en jeux lors du traitement par le cisplatine. En conclusion, la comparaison des deux modèles les plus couramment utilisés pour étudier l'influence de p53 sur la sensibilité de lignées carcinomateuses aux agents alkylants démontre que le modèle RKO néo/RKO E6 est insuffisant pour évaluer l'influence de p53 sur la réponse de cellules soumises à un stress cytotoxique.

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Étude du métabolisme de l'acide rétinoïque : importance des activités cytochromes P450 dans la modulation des réponses biologiques lors de la thérapie antitumorale par les rétinoïdes

Marill J, Capron C, Idres N, Lanotte M, Chabot GG

U. 496, Centre Hayem, Hôpital Saint-Louis, Paris.

Les tumeurs sont caractérisées par une croissance cellulaire anormale accompagnée d'une perte des capacités de différenciation cellulaire. L'activité antiproliférative et pro-différenciante des rétinoïdes, et en particulier celle de l'acide rétinoïque, a orienté les recherches vers leur utilisation comme drogues chimiopréventives et antitumorales. Depuis peu, les différents métabolites de phase I de l'acide rétinoïque ont également démontré leurs capacités à induire des réponses biologiques distinctes selon les tissus considérés, parfois avec une efficacité supérieure à la substance mère. Nous nous sommes donc proposés d'identifier les enzymes responsables du métabolisme de l'acide rétinoïque, essentiellement les cytochromes P450 (CYP) qui sont capables de former de façon préférentielle certains métabolites et qui pourraient donc participer à la régulation fine des réponses biologiques.

Nous avons tout d'abord identifié les CYP responsables de la formation des différents métabolites de l'acide rétinoïque tout-trans [Mol Pharmacol 2000 ; 58 : 1341-8] ainsi que de ses deux isomères également utilisés en thérapeutique, l'acide rétinoïque 9-cis et 13-cis [Biochem Pharmacol 2002 ; 63 : 937-47]. Cette approche enzymatique nous a permis, non seulement d'identifier les CYP capables de métaboliser l'acide rétinoïque, mais, de plus, de déterminer leurs caractéristiques cinétiques, et donc leur efficacité métabolique vers la formation d'un métabolite précis. Ces mécanismes permettent d'envisager une régulation fine par les CYP de la quantité ainsi que du type de ligand disponible.

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Implication de l'activité protéine-arginine méthyl transférase dans la sensibilité à la camptothécine, un inhibiteur spécifique de topo-isomérase I

Verbiest V, Gros L, Jacquemin-Sablon A, Pourquier P

Laboratoire de pharmacologie des agents anticancéreux, Institut Bergonié, Bordeaux.

Les topo-isomérases (topo) sont des enzymes nucléaires dont le rôle principal est de supprimer les contraintes de torsion de l'ADN au cours des processus de transcription et de réplication. Cette fonction repose sur la formation de coupures transitoires de l'ADN qui sont simple- ou double brin. Les inhibiteurs de topo-isomérases, très utilisés en chimiothérapie, exercent leur cytotoxicité en stabilisant le complexe covalent ADN-enzyme. Les mécanismes moléculaires de la réponse cellulaire à ces agents sont encore mal connus. Au cours de la recherche de nouveaux gènes de sensibilité à la 9-hydroxyellipticine, un inhibiteur de topo II, nous avons identifié un gène codant pour des protéines de la famille des protéine-arginine méthyl transférase (PRMT). La répression stable de ce gène dans la lignée de hamster DC-3F/GSE IA confère une résistance à la majorité des inhibiteurs de topo II et une hypersensibilité à la camptothécine, un inhibiteur de topo I. Nous avons recherché les altérations qualitatives et/ou quantitatives de la topo I pouvant expliquer cette hypersensibilité. Nous ne trouvons pas de différence de la quantité de topo I, ni de l'activité de l'enzyme provenant d'extraits nucléaires de la lignée DC-3F/GSE IA et de la lignée témoin. Le nombre de cassures simple brin et de complexes ADN-topo I formés dans des cellules traitées par de la camptothécine est également comparable. Nous n'observons aucune différence dans la cinétique de réparation des cassures simple brin.

Ces résultats préliminaires montrent pour la première fois le lien entre une activité PRMT et la sensibilité à la camptothécine. Ils suggèrent que l'hypersensibilité à la camptothécine conférée par la répression de ce gène est certainement due à des mécanismes se situant en aval de la formation du complexe ADN-enzyme. Ces résultats démontrent par ailleurs que les voies de signalisation des lésions induites par les inhibiteurs de topo I sont différentes de celles mises en jeu pour les inhibiteurs de topo II.

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Quantification de l'expression de gènes liés à la multidrug resistance (MDR1, MRP1, BCRP et TOP2) dans des variants des cellules K562 et MCF7 cultivés en présence de doxorubicine libre ou encapsulée dans des nanosphères de polyisohexylcyanoacrylate

Laurand A, Laroche-Clary A, Larrue A, Huet S, Bonnet J, Robert J

Université Victor-Segalen Bordeaux 2 et Institut Bergonié, 229, cours de l'Argonne, 33076 Bordeaux.

La doxorubicine (dox) encapsulée dans des nanosphères de polyisohexylcyanoacrylate (PIHCA-dox) est capable de contourner le phénomène de multidrug resistance (MDR) dû à la surexpression de la glycoprotéine P. Nous avons cultivé des cellules en présence de PIHCA-dox et de doxorubicine libre pour comparer les mécanismes de résistance sélectionnés par les deux formulations. Pour cela, nous avons cultivé deux lignées tumorales humaines, K562 (érythroleucémie) et MCF7 (carcinome mammaire), en présence de concentrations infratoxiques, progressivement croissantes, de doxorubicine libre ou encapsulée. Les médicaments ont été maintenus au contact des cellules pendant 8 repiquages à chaque concentration (1, 3, 10 et 30 ng par ml de milieu). La cytotoxicité des deux formes a été évaluée dans chaque variant par inhibition de croissance. L'expression des gènes MDR1, MRP1, BCRP et TOP2 a été évaluée dans chaque variant par RT-PCR quantitative en temps réel. L'activité de la glycoprotéine P a été recherchée par cytométrie en flux et celle de la topo-isomérase II par un test de décaténation.

À chaque niveau de sélection, la croissance des lignées cultivées en présence de doxorubicine libre est plus rapide que celle des lignées cultivées en présence de PIHCA-dox et l'obtention de variants est plus facile. Les cellules sélectionnées par la PIHCA-dox sont plus résistantes à la doxorubicine libre que les cellules sélectionnées par la doxorubicine libre et leur résistance à la PIHCA-dox est un peu moindre qu'à la doxorubicine libre. Toutes les lignées surexpriment le gène MDR1, corrélativement à la dose de sélection, de façon plus marquée dans les lignées sélectionnées par la doxorubicine libre que par la PIHCA-dox. En revanche, une faible surexpression du gène MRP1 apparaît dès le premier stade de sélection et se maintient constante lors de l'augmentation de la dose. Pour le gène BCRP, les lignées cultivées en présence de PIHCA-dox présentent une surexpression plus élevée que celles cultivées en présence de doxorubicine libre. Une augmentation de l'expression de la topo-isomérase II a été observée dans les lignées MCF7 cultivées en présence de doxorubicine libre et de PIHCA-dox ; ce phénomène est transitoire dans les lignées K562.

Nos résultats confirment que des mécanismes multiples peuvent être mis en œuvre lors de l'acquisition de la résistance aux agents anticancéreux, et montrent que des formulations différentes du même médicament sont capables de sélectionner ces mécanismes à des niveaux variables.

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La doxorubicine et l'étoposide induisent des altérations différentes de l'expression des gènes de cellules leucémiques en culture

Vekris A, Godard F, Haaz MC, Bonnet J, Robert J

Digem SA, Université Victor-Segalen Bordeaux 2 et Institut Bergonié, 229, cours de l'Argonne, 33076 Bordeaux Cedex.

La doxorubicine et l'étoposide sont deux médicaments anticancéreux qui ont une cible cellulaire commune, l'ADN-topoisomérase II. Cependant, ces deux médicaments présentent des profils distincts de cytotoxicité in vitro et de propriétés antitumorales in vivo. Ces différences peuvent être attribuées au fait que l'interaction médicament-cible induit des événements cellulaires différents pour conduire à la mort cellulaire ou à la résistance. Pour tester cette hypothèse, nous avons cultivé la lignée érythroleucémique K562 et son variant résistant à la doxorubicine en présence de doses équitoxiques de doxorubicine et d'étoposide (la valeur de l'IC₅₀ de chaque médicament dans chacun des deux types cellulaires). Les cDNA obtenus après extraction des RNA et rétrotranscription ont été hybridés sur un array de 1 176 sondes (membranes Clontech Atlas 1.2 I). L'analyse du signal et les comparaisons ont été faites en utilisant la méthode des rangs. Nous avons comparé les altérations induites par les deux médicaments, dans les cellules sensibles et dans les cellules résistantes.

Dans les cellules sensibles, 942 signaux sur 1 176 ont été considérés comme significatifs. Seuls 2 gènes ont leur expression altérée de façon identique par les deux médicaments ; 8 gènes ont leur expression altérée de façon opposée ; 129 gènes montrent une altération spécifique de la doxorubicine et 17 une modification d'expression spécifique de l'étoposide. Dans les cellules résistantes, les chiffres sont les suivants : 1 gène présentant une altération identique de son expression sous l'effet des deux médicaments ; aucun gène d'expression altérée de façon opposée ; 11 et 25 gènes ayant leur expression altérée spécifiquement par la doxorubicine et l'étoposide, respectivement. Parmi les gènes dont l'expression est altérée par la doxorubicine, une grande variété de fonctions est observée ; en revanche, pour l'étoposide, nous avons identifié essentiellement des gènes codant pour des protéines impliquées dans la réception et la transduction des signaux et dans le transport transmembranaire. Ainsi, cette étude montre que la doxorubicine et l'étoposide induisent des altérations très différentes de l'expression des gènes. Cela peut être lié à l'induction d'événements distincts en réponse à l'interaction de ces médicaments avec leur cible primaire commune.

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Recherche et identification de variants polymorphiques du gène de la carboxylestérase 2 humaine impliquée dans l'activation de l'irinotecan en SN38

Charasson, Bellott R, Gorry P, Longy M, Robert J

Institut Bergonié et Université de Bordeaux 2, 229, cours de l'Argonne, 33076 Bordeaux Cedex.

L'irinotecan est devenu un outil thérapeutique majeur pour les cancers colorectaux métastatiques. C'est une prodrogue nécessitant une activation, principalement hépatique, en SN38. Il avait été montré au laboratoire qu'il existait une importante variation individuelle de l'activation de l'irinotecan sur le modèle des microsomes de foie humain [Haaz, et al. NS Arch Pharmacol 1997 ; 356 : 257-62], de même que les taux circulants de SN38 chez les malades traités par irinotecan varient dans une proportion importante [Rivory, et al. Clin Cancer Res 1997 ; 3 : 1261-6]. Cette activation est catalysée principalement par la carboxylestérase hCE2. Nous nous sommes demandés si un polymorphisme génétique de cet enzyme était susceptible d'expliquer la variabilité individuelle de l'activation de l'irinotecan en SN38, et par conséquent la variabilité individuelle des effets thérapeutiques et toxiques de l'irinotecan.

Le gène de la carboxylestérase 2 (16q22.1) est composé de 12 exons. Le séquençage du génome humain répertorie six SNP (single nucleotide polymorphism). Il n'existe pas de données concernant leur fréquence dans la population. Aucune de ces variations n'est susceptible d'altérer la séquence protéique, mais l'une siège au niveau du promoteur du gène, en position - 330 avant le codon d'initiation de la transcription. Nous avons recherché dans une population préliminaire de onze échantillons individuels d'ADN humains l'existence de variants polymorphiques : 1) au niveau de chaque exon et des jonctions exon-intron ; 2) au niveau des six variations signalées dans la séquence du gène (promoteur, intron 2, intron 10, intron 12). Pour cela, nous avons mis au point 14 réactions de PCR et nous avons réalisé l'analyse de ces 14 fragments par dHPLC (denaturing high performance liquid chromatography) dans la population étudiée. Au stade actuel, nous avons retrouvé 2 variants alléliques au niveau du promoteur, 4 dans l'intron 10, 3 dans l'intron 12, et 1 dans l'exon 12 ou à la jonction exon-intron (non signalé dans la séquence du gène). Les séquençages de ces variants sont en cours. Parallèlement, nous avons commencé, dans dix échantillons de foies humains obtenus de l'IIAM, l'étude de la correspondance entre l'activité carboxylestérase activant l'irinotécan, l'expression du gène hCE2 par RT-PCR quantitative en temps réel, et la caractérisation des variants polymorphiques. Cette étude permettra de savoir si le polymorphisme du gène de la hCE2 est susceptible de s'accompagner d'une variation de l'activité et/ou de l'expression de l'enzyme.

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Bases précliniques pour l'association ZD1839 (Iressa) et cisplatine-fluoropyrimidines dans le traitement des cancers ORL

Magné N, Fischel JL, Dubreuil A, Formento P, Tiffon C, Formento JL, Francoual M, Milano G

Laboratoire d'oncopharmacologie, Centre Antoine-Lacassagne, 33, avenue de Valombrose, 06189 Nice Cedex 2.

Le récepteur à l'EGF (REGF) est particulièrement surexprimé dans les cancers épidermoïdes de la sphère ORL où il représente un facteur de mauvais pronostic avéré. Le ciblage thérapeutique du REGF (Iressa, ZD1839) est donc justifié dans cette pathologie où le traitement de référence est représenté par l'association cisplatine (CP)-5-fluoro-uracile (5FU).

Le but de cette étude préclinique est d'analyser l'effet antiprolifératif et proapoptotique du ZD1839 seul ou en association avec le cisplatine (CP) et/ou des fluoropyrimidines (5FU, capecitabine) sur des lignées cellulaires ORL d'origine humaine. La recherche d'association optimale de ces drogues a été établie par le test de cytotoxicité MTT combiné à une analyse de Chou et Talalay. Les mécanismes moléculaires induits par ZD1839 sur la prolifération cellulaire, sur l'apoptose et sur les mécanismes de réparation de l'ADN (DNA-PK) ont été examinés.

ZD1839 potentialise l'effet du CP et/ou du 5FU, l'effet de la capecitabine (5'DFUR) lorsqu'il est appliqué avant et maintenu pendant l'exposition à ces cytotoxiques (effet synergique avec Chou et Talalay < 0,6). L'effet synergique observé peut être expliqué par l'action du ZD1839 : sur le cycle cellulaire avec un blocage de plus de 50 % des cellules en phase G0/G1 accompagné d'une augmentation de p21 et p27 de plus de 60 %, une baisse de la thymidylate synthase (TS) (facteur 40), une augmentation de la thymidine phosphorylase (TP) (facteur 2,5) ; sur l'apoptose par une augmentation de Bax de plus de 100 % et une diminution de Bcl2 d'au moins 60 % à des temps précoces (24 heures), une baisse de 50 % de la phosphorylation AKT, une augmentation additive de l'activité caspase 3 dans l'association des drogues et une baisse de DNA-PK de 30 % à partir de 48 heures d'exposition au ZD1839.

En conclusion, l'association ZD1839 et traitement conventionnel pour les cancers ORL (CP-5FU) est synergique et les changements moléculaires induits par ZD1839 permettent d'en expliquer et d'en fournir des explications mécanistiques plausibles. Sur ces bases, des futurs essais cliniques en oncologie ORL sont à mettre en œuvre.

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Alkylation des guanines de l'ADN par le composé S23906-1, un nouvel agent antitumoral dérivé de l'acronycine

David-Cordonnier MH ¹, Laine W ¹, Lansiaux A ¹, Pierré A ², Hickman JA ², Bailly C ¹

¹ Inserm U. 524, Lille, Centre Oscar-Lambret, Lille ; ² Institut de Recherches Servier, Suresnes.

Sur le plan moléculaire, nous avons disséqué le mécanisme d'action d'un nouvel agent antitumoral potentiel, le composé S23906-1, dérivé d'un alcaloïde naturel, l'acronycine. Le S23906-1 forme des adduits covalents stables avec l'ADN, identifiés par un retard de migration sur gel d'électrophorèse. À l'inverse, le composé diol S23907 qui est dépourvu des deux groupements acétate (C1, C2) et inactif biologiquement, ne forme pas ces adduits covalents avec l'ADN. Les groupements acétate du S23906-1 sont donc essentiels pour la liaison à l'ADN de cette nouvelle molécule. Le S23906-1 se lie à l'ADN principalement par les résidus de guanine : il forme des complexes stables avec un oligonucléotide contenant exclusivement les paires de bases G-C, et ne réagit pas avec un oligonucléotide comportant des paires de bases A-T. Des études complémentaires de footprinting et de fluorescence ont confirmé cette sélectivité vis-à-vis des séquences GC. La substitution des guanines par des résidus inosines a permis de caractériser le site réactionnel : le groupement amino exocyclique de la guanine exposé dans le petit sillon de l'ADN. Sur le plan cellulaire, l'ADN génomique de cellules B16 traitées par le S23906-1 a été extrait et la formation d'adduits mise en évidence par fluorescence. La microscopie confocale a permis de visualiser le S23906-1 dans les cellules spécifiquement au niveau nucléaire. Ces données moléculaires et cellulaires sur le mécanisme d'action de ce dérivé de l'acronycine offrent à cette nouvelle molécule antitumorale un nouveau champ d'investigation et ouvrent des objectifs en termes de développement de nouveaux médicaments anticancéreux. Le S23906-1 est actuellement en développement préclinique.

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Identification des gènes impliqués dans la réponse apoptotique induite par les homocamptothécines BN80915 et BN80927

Lansiaux A ¹, Hildebrand MP ¹, Bal C ¹, Wattez N ¹, Demarquay D ², Bigg DCH ², Bailly C ¹

¹ Inserm U. 524 et Centre Oscar-Lambret, Lille ; ² Institut Henri-Beaufour, Les Ulis.

Les dérivés homocamptothécines (hCPT) BN80915 et BN80927 sont deux agents anticancéreux inhibant la topoisomérase I par stabilisation du complexe covalent ADN-enzyme. Seul le BN80927 inhibe également l'activité catalytique de la topo-isomérase II. D'autre part, ces deux dérivés de la camptothécine qui possèdent un cycle lactone particulier à sept sommets, présentent une activité cytotoxique et induisent un phénomène apoptotique vis-à-vis d'une large gamme de lignées cellulaires. In vivo, sur différents modèles de xénogreffes, les profils antitumoraux des deux composés sont différents. Dans le but de différencier le(s) mécanisme(s) d'action de ces deux hCPT apparentées, les gènes spécifiquement impliqués dans la réponse apoptotique ont été identifiés et caractérisés par l'étude du transcriptome (DNA arrays). Pour cela, les cellules coliques HT29 ont été traitées avec les drogues selon différentes conditions (IC₅₀, 10 x IC₅₀, 24 et 72 h). Les profils d'expression des gènes ont été analysés sur des membranes (Clontech) comprenant 205 gènes (cycle cellulaire, apoptose) ; chaque composé présente un profil d'expression génique propre. Nous avons alors analysé plusieurs gènes (ou leur produit protéique) par des méthodes complémentaires (RNase protection assay, cytométrie, colorimétrie, western-blot). Sur ce modèle, les expressions génique et protéique sont distinctes entre les deux dérivés hCPT, dépendent de la concentration et de la durée d'administration. Les gènes sur- ou sous-exprimés après traitement comprennent bclw, cycline D3, JNK1, IGF2 pour le BN80927 ; Bax, E2F1, GRB2, TRADD et XPC pour le BN80915. Ces profils d'expression des gènes démontrent des mécanismes d'action différents et apportent des arguments en faveur du développement clinique spécifique de ces deux molécules.