ARTICLE
L'introduction du 5-fluoro-uracile (5FU) en thérapeutique anticancéreuse
humaine est maintenant ancienne, puisqu'elle remonte aux années
cinquante [1]. Depuis la découverte de son action sur la thymidylate
synthétase (TS) [2, 3] et du rôle essentiel joué par
l'acide folinique (AF) intracellulaire (sous forme de N5,10-méthylène-tétrahydrofolate)
dans la formation du complexe FdUMP-TS [4-6], l'association 5FU-AF est
devenue un standard de nombreux protocoles de chimiothérapie dans
différents types de cancers.
En 1982, Machover et al. [7] réalisent l'une des premières
études ouvertes évaluant la modulation du 5FU par de fortes
doses d'acide folinique chez des patients atteints d'un cancer colorectal
et d'un adénocarcinome gastrique. Le taux de réponse obtenu
était supérieur à 50 %. Ces résultats furent
ensuite confirmés par plusieurs observations cliniques [8, 9] ou
méta-analyses [10, 11] et les modalités d'administration
des deux médicaments ont été validées [12,
13]. Quelques essais cliniques ont été réalisés
en associant le 5FU avec la forme lévogyre de l'AF, sans qu'aucun
ne montre de réel avantage, en termes d'efficacité clinique
ou de toxicité, par rapport à la forme racémique
[14, 15]. Plus récemment, la potentialisation du 5FU par l'AF et
l'oxaliplatine a permis d'obtenir des résultats très prometteurs
dans le traitement du cancer colorectal métastatique [16-18].
Depuis le début des années quatre-vingt-dix, de nombreuses
publications ont montré l'intérêt de l'association
5FU-AF dans d'autres localisations : sphère ORL [19-22], œsophage
[23], estomac [24], poumon [25, 26] et sein [27].
Contrairement au traitement du cancer colorectal, où l'AF est
généralement administré en perfusion de 1 à
2 h avant la perfusion continue de 5FU (protocoles Fufol et Folfox) [12,
16], dans les autres localisations, les deux produits sont fréquemment
mélangés dans le même récipient et administrés
en perfusion continue de plusieurs jours à l'aide de pompes portables.
Comparée à l'administration séparée de chaque
médicament, la perfusion offre de nombreux avantages pratiques
(pour le patient et le personnel infirmier) et économiques (moindre
coût).
Si de nombreux travaux ont montré la stabilité du 5FU
seul, à température ambiante, dans différents matériaux
[28-32], les résultats concernant la stabilité et la compatibilité
du mélange 5FU-AF, sous forme lévogyre ou racémique,
sont assez contradictoires.
En 1989, Anderson et al. [33] évaluent la stabilité
d'un mélange 5FU-folinate de calcium en utilisant une méthode
de chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Les deux
produits sont restés stables en solution (>= 90 % de la concentration
initiale) pendant 15 jours à température ambiante et aucune
précipitation n'a été mentionnée.
En 1993, Montoya Garcia-Reol et al. [34] étudient la stabilité
de l'association 5FU-AF dans des poches PVC à différentes
concentrations (1,2/0,3 0,6/0,15 0,3/0,02 et 2/0,35 mg/ml).
L'analyse a été réalisée par CLHP et l'évolution
des concentrations est évaluée en termes d'aire sous la
courbe pour chacune des deux molécules. Les auteurs concluent que
le mélange est plus stable (14 jours) lorsque les dilutions sont
effectuées dans du NaCl 0,9 % que dans du glucose à 5 %.
En 1995, Trissel et al. [35] étudient différentes
combinaisons de 5FU et d'AF (l et d,l), conservées dans des poches
PVC de 250 ml à + 4, 23 et 32 °C, à l'aide d'une lampe
à lumière monodirectionnelle de haute résolution.
Les résultats obtenus montrent l'apparition de cristaux de 5 à
10 µ dès la mise en solution ; ces cristaux augmentent de
taille (> 25 µ) et en quantité en fonction des concentrations
respectives des deux molécules. Les auteurs concluent à
l'incompatibilité du 5FU avec le folinate de calcium et le lévofolinate
de calcium dans les poches en PVC aux trois températures étudiées.
La même année, Milano et Renée [36] publient les
résultats d'un travail visant à étudier l'influence
des contenants, du diluant (NaCl 0,9 % ou glucose 5 %) et de la forme
de l'AF (l ou d,l) sur la stabilité de mélanges 5FU-AF correspondant
à des protocoles d'administration en perfusion continue de 24 et
120 h. Les mélanges ont été observés à
l'œil nu, à la lumière ambiante et les concentrations
des deux constituants sont mesurées à différents
temps (de T0 à 72 h) par CLHP. La formation d'un précipité
est mise en évidence en 24, 48 ou 72 h dans les trois types de
récipients étudiés (flacon verre, poche PVC et cassette)
pour l'association 5FU 50 mg/ml-AF (d,l) 30,8 mg/ml, aussi bien dans le
NaCl 0,9 % que dans le glucose à 5 %. Ce précipité
est accompagné d'une diminution significative de la concentration
d'AF dans les flacons de verre. Sa formation semble liée aux concentrations
respectives des deux composés, puisque rien n'a été
observé avec les mélanges 5FU 50 mg/ml-l AF 15,4 mg/ml,
5FU 6,5 mg/ml-d,l AF 4 mg/ml et 5FU 6,5 mg/ml-l AF 2 mg/ml. Un essai de
mélange 5FU 50 mg/ml-l AF 30,8 mg/ml ne donnant aucun précipité
est mentionné, mais les données ne sont pas présentées.
Les auteurs expliquent ces différences, soit par une modification
du pH lors du mélange, soit par une différence d'excipient
entre les deux formulations d'AF (NaCl pour la forme racémique
et mannitol pour la forme lévogyre). Ils suggèrent que le
chlorure de sodium déplace le calcium du folinate pour former un
précipité de chlorure de calcium.
Dans ce travail, nous avons entrepris l'étude de la stabilité
du mélange 5FU-AF sous forme racémique et lévogyre,
en utilisant les préparations correspondant aux protocoles d'administration
décrits par Dreyfuss et al. [19] et Lavieille et al.
[20]. Pour évaluer l'influence de la forme d'AF (d,l ou l) dans
l'apparition d'un précipité, nous avons mélangé
le 5FU avec l'AF (l) à doses équithérapeutiques (l
folinate = 1/2 d,l folinate) et équimolaires (2 x l folinate =
1 x d,l folinate). Par ailleurs, afin d'aller plus en avant dans l'explication
du phénomène observé, nous avons prévu de
caractériser la nature du précipité si celui-ci venait
à apparaître.
Résultats
Les résultats obtenus avec les six combinaisons de 5FU et d'AF
sont résumés dans les tableaux I à VI.
Modification du pH
Quelles que soient les concentrations de 5FU et d'AF, ainsi que la nature
du contenant (flacon en verre, poche ou cassette), aucune modification
du pH des solutions n'est observée tout au long de l'étude.
Floculation
L'apparition d'un floculat est observée dans toutes les associations
utilisant le 5FU à la concentration de 50 mg/ml, et cela quelle
que soit la forme de l'AF, racémique ou lévogyre.
La concentration en AF ne semble pas être un facteur déterminant
dans l'apparition du floculat puisque le même phénomène
est observé pour des associations 5FU 50 mg/ml AF 30,8 mg/ml et
5FU 50 mg/ml-AF 15,4 mg/ml, que l'AF soit sous forme racémique
ou lévogyre.
La nature du récipient ne semble pas non plus jouer un rôle
déterminant, même si le floculat a tendance à apparaître
un peu plus précocement dans les flacons en verre que dans les
récipients en matière plastique.
Aucune floculation n'apparaît dans les combinaisons utilisant
le 5FU à la concentration de 6,5 mg/ml, quel que soit l'isomère
de l'AF.
Il apparaît donc d'emblée que la floculation observée
n'est pas liée à la forme de l'AF, ni à sa concentration.
Par ailleurs, il est important de noter que ces différences de
comportement ne semblent pas, non plus, liées à des différences
de rapports de concentrations entre le 5FU et l'AF puisque ceux-ci sont
soit de 1,62 (5FU 50 mg/ml + AF (d,l ou l) 30,8 mg/ml et 5FU 6,5 mg/ml
+ AF (d,l ou l) 4 mg/ml), soit de 3,25 (5FU 50 mg/ml + AF (l) 15,4 mg/ml
et 5FU 6,5 mg/ml + AF (l) 2 mg/ml), qu'il y ait ou non floculation.
Évolution des concentrations en 5FU et en AF
Les pentes des 72 droites de régression obtenues figurent dans
le tableau VII.
Évolution du 5FU
Pour le 5FU 50 mg/ml, sur les 18 droites de régression établies,
10 ont une pente inférieure à celle de la droite de référence,
montrant une tendance nette à la diminution de la concentration
du 5FU dans les solutions ayant floculé. Cependant, l'analyse ne
révèle que 3 pentes statistiquement inférieures à
0,104 (pentes a, b et c) (tableau VII).
Pour le 5FU 6,5 mg/ml, une seule droite de régression a une pente
inférieure à 0,104. L'analyse statistique ne montre
pas de différence significative par rapport à la droite
de référence. Ces résultats montrent l'excellente
stabilité du 5FU à la concentration de 6,5 mg/ml dans les
conditions de l'expérimentation.
Évolution de l'AF
Quelle que soit la concentration de l'AF, et quelle que soit sa forme,
racémique ou lévogyre, les pentes des droites de régression
obtenues sont toutes largement supérieures à celle de la
droite de référence. Dans toutes les combinaisons testées,
la concentration en AF, sera donc, après 96 h, toujours supérieure
à 90 % de la concentration initiale.
Ces résultats montrent que, d'une part, l'association du 5FU
à la concentration de 50 mg/ml avec l'AF à 30,8 mg/ml et
15,4 mg/ml, sous forme racémique ou lévogyre, entraîne
une floculation s'accompagnant d'une perte de 5FU alors que l'AF reste
parfaitement stable ; d'autre part, l'association du 5FU à la concentration
de 6,5 mg/ml avec l'AF, racémique ou lévogyre, à
4 et 2 mg/ml donne une solution stable pendant 96 h à température
et lumière ambiantes, les concentrations des deux molécules
étant supérieures à 90 % de la concentration initiale
après 4 jours de stockage.
Analyse du floculat
Afin d'analyser la nature du floculat observé avec les fortes
concentrations de 5FU, le floculat a été récupéré,
lavé 3 fois avec de l'eau distillée et 3 fois avec de l'alcool
méthylique anhydre. Il a ensuite été séché
et conservé à 20 °C.
Le floculat est soluble dans l'eau et peu soluble dans l'alcool. Du
fait de la composition des mélanges initiaux, un dosage de 5FU,
de calcium et d'AF a été réalisé sur le floculat.
Le floculat est lavé 3 fois avec 5 ml d'eau stérile avec
agitation douce, puis 3 fois avec 5 ml de méthanol anhydre avec
agitation par vortex. La phase liquide est éliminée après
chaque lavage. Le floculat est ensuite séché afin d'éliminer
toute trace de liquide. Pour le dosage, il est dissous dans de l'eau stérile
(1 mg/ml) et séparé en deux fractions, l'une pour le dosage
du calcium et l'autre pour les dosages de 5FU et d'AF. Le calcium est
dosé par méthode biochimique habituelle (CX7, Laboratoires
Beckman). Le 5FU et l'AF sont dosés par les mêmes méthodes
CLHP que celles qui ont servi pour l'étude.
Les résultats des différents dosages montrent que le floculat
est composé pour : environ 80 % de 5FU (figure 1), environ
10 % d'AF (figure 2), environ 10 % de calcium. Ils sont compatibles
avec ceux obtenus lors de l'étude de l'évolution du 5FU
et de l'AF au cours du temps pour lesquels on observe une diminution du
5FU en solution et une grande stabilité de l'AF.
Discussion
Cette étude de stabilité du 5FU à deux concentrations
couramment utilisées en perfusion continue : 50 et 6,5 mg/ml [19,
20], en association avec des doses équithérapeutiques et
équimolaires d'AF (sous forme l et d,l), permet de porter plusieurs
conclusions :
Les mélanges 5FU 6,5 mg/ml-AF (l et d,l) 4 mg/ml et AF
(l) 2 mg/ml sont stables dans le temps. Les solutions obtenues sont limpides,
le pH reste inchangé et les concentrations des deux molécules
restent largement supérieures à 90 % des concentrations
initiales après 96 h de stockage à température et
lumière ambiantes.
Ces solutions peuvent donc être considérées comme
stables pendant 4 jours.
Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Anderson et
al. [33].
Lorsque le 5FU à 50 mg/ml est mélangé à
l'AF, racémique ou lévogyre, à la concentration de
30,8 ou 15,4 mg/ml, il apparaît systématiquement un précipité
sous forme d'un floculat dans les 24 h qui suivent la mise en solution,
accompagné d'une légère diminution de la concentration
en 5 FU en solution.
Ces résultats sont en contradiction avec ceux de Milano et Renée
[36] qui n'observent aucun floculat avec le mélange 5FU 50
mg/ml-AF (l) 15,4 mg/ml. Les auteurs avaient expliqué le phénomène
par une modification du pH de la solution. Or, nos résultats montrent
la parfaite stabilité de ce paramètre au cours de l'étude.
Les excipients des produits utilisés dans nos expériences
et dans l'étude de Milano et Renée sont tout à fait
comparables.
L'analyse du floculat montre que celui-ci est constitué en majorité
de 5FU (80 %) et de pourcentages équivalents de calcium et d'AF
(10 %). Il s'agit donc vraisemblablement d'un précipité
de 5FU ayant entraîné de faibles proportions de folinate
de calcium de la solution.
Cela semble confirmé par la légère diminution des
concentrations du 5FU observée et la parfaite stabilité
de l'AF en solution.
Il est à noter que ce phénomène s'observe pour
toutes les formes d'AF, lévogyre et racémique. L'action
du chlorure de sodium, excipient du folinate de calcium sur le calcium
du folinate pour former un précipité de chlorure de calcium,
phénomène suggéré par Milano et Renée
[36], n'apparaît pas responsable de la formation du floculat.
Les solutions de 5FU dosées à 50 mg/ml correspondent aux
solutions commercialisées. Il s'agit de solution au seuil de solubilité
du principe actif. Selon toute évidence, le phénomène
de floculation observé avec ces concentrations de 5FU résulterait
d'un recul de solubilité de la molécule dû à
l'addition d'AF.
La détermination de la plus grande concentration d'AF permettant
d'obtenir une solution stable dans le temps devrait faire l'objet d'une
étude complémentaire.
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