Involvement of the INK4a-ARF locus in genetic predisposition to familial melanoma and in skin carcinogenesis

ARTICLE

Quelques années après la découverte du gène suppresseur de tumeur p53, a lieu, fin 1993 ­ début 1994, la caractérisation d'un nouveau gène suppresseur de tumeur situé sur le chromosome 9p21, p16^INK4A, appartenant à la famille des inhibiteurs de kinases dépendantes des cyclines (CDK) et contrôlant la phase de transition G1/S du cycle cellulaire. Ce gène va se révéler impliqué à la fois dans la prédisposition héréditaire au mélanome familial et dans l'oncogenèse d'un grand nombre de cancers. Ultérieurement, il fut montré que p16^INK4A était issu d'un locus ayant une organisation tout à fait unique, le locus INK4a-ARF, lui permettant de contrôler simultanément deux voies de signalisation impliquées dans la régulation du cycle cellulaire, la voie p53-MDM2 et la voie CDK4-Rb.

Dans la première partie de cet exposé, nous ferons le point sur l'implication de p16^INK4A dans la prédisposition héréditaire au mélanome. Ensuite, nous discuterons le rôle du locus INK4A-ARF dans l'oncogenèse des carcinomes cutanés sporatiques et provenant de malades atteints de xeroderma pigmentosum.

Un locus pour deux gènes, ou un gène pour deux protéines

Le locus INK4a-ARF, situé sur le chromosome 9p21, code pour deux protéines distinctes (figure 1). La protéine p16^INK4A est codée par 3 exons (E1alpha, E2 et E3), et est un régulateur du cycle cellulaire appartenant à la classe des inhibiteurs des kinases cyclines-dépendantes. Plus récemment a été caractérisé un transcrit alternatif issu du même locus, p16beta. Celui-ci code pour ARF (p14^ARF chez l'homme), protéine qui joue également un rôle important dans le contrôle de la multiplication cellulaire, mais par une voie de signalisation différente, impliquant les protéines p53 et MDM2.

La voie p16^INK4A-CDK4-pRb

Clonage de p16^INK4A : évidence pour un gène suppresseur de tumeur

La région chromosomique 9p21 est l'objet de délétions dans un grand nombre de cancers, ce qui suggérait l'existence d'un gène suppresseur de tumeur sur ce locus. Une cartographie délétionnelle de la région a pu être établie à partir de lignées de mélanomes [1] ; elle a permis d'identifier p16^INK4A, gène déjà connu comme régulateur négatif de la division cellulaire [2]. Des délétions homozygotes et/ou ponctuelles de p16^INK4 étaient présentes dans plus des deux tiers des lignées de mélanomes étudiées [1].

Fonctions de p16^INK4A

* P16^INK4A est un inhibiteur de CDK4 (cyclin-dependant-kinase 4) et régule négativement l'activité du complexe CDK4-cycline D1. Il atteint son pic d'expression au point de transition G1/S du cycle et empêche l'inactivation de la protéine pRb (normalement inactivée par phosphorylation par le complexe CDK4-cycline D). L'effet résultant est l'inhibition de la libération de facteurs de transcription essentiels (E2F) au passage de la phase G1 vers la phase S du cycle cellulaire, qui restent « piégés » par la protéine pRb active, maintenant la cellule en phase G1 [2]. P16^INK4A agit principalement par inhibition compétitive en se liant à CDK4 ou CDK6, prévenant ainsi leur association avec la cycline D1 [2].

* p16^INK4A induit un arrêt du cycle cellulaire en G1. Son expression ectopique dans des lignées cancéreuses diminue la prolifération de ces dernières avec arrêt des cellules en G1 [3]. P16^INK4 est régulé négativement par pRb (mécanisme de feed back), qui diminue le niveau de transcription de p16^INK4A en agissant sur son promoteur [4].

* p16^INK4A joue un rôle dans la sénescence réplicative. Les cellules somatiques humaines normales ont un potentiel prolifératif limité qui dépend du nombre de divisions cellulaires. Au stade de sénescence, elles sont arrêtées en G1 avec une pRb hypophosphorylée (activée), mais restent biologiquement actives et viables pendant de longues périodes. P16^INK4A paraît être impliqué dans ce processus car, d'une part, le phénomène de sénescence peut être imposé à une cellule immortalisée en y introduisant un chromosome 9 humain normal et, d'autre part, p16^INK4A s'accumule dans les fibroblastes et les kératinocytes, parallèlement au nombre de divisions cellulaires [5].

* p16^INK4A est induit par les rayonnements ultraviolets. Les UVC à faible doses induisent une augmentation de p16^INK4A dans des lignées kératinocytaires, parallèlement à un ralentissement du cycle cellulaire en G2 [6]. p16^INK4A est également induit par les UVB (dont des doses subérythémales). Cette induction, de 15 à 20 %, est observée à la fois dans les kératinocytes des couches basales et suprabasales et dans les mélanocytes. Elle est maximale 24 heures après l'irradiation (et donc plus tardive que l'induction de p53) et persiste pendant 48 heures, diminuant après 72 heures [7]. Son rôle pourrait être proche de celui de p53, en permettant à la cellule de réparer les dommages de l'ADN UV-induits.

Transcrit alternatif issu du locus INK4a-ARF :la voie ARF-p53

Le transcrit p16beta comprend un premier exon différent alternatif (E1beta), plus centromérique, qui est transcrit à partir d'un promoteur différent de p16beta, puis épissé dans un cadre de lecture différent aux deux derniers exons de p16^INK4A [8].

P16beta code pour ARF (alternating reading frame), protéine hautement basique de 132 acides aminés chez l'homme (13 902 daltons, p14^ARF) [9] qui est localisée dans le nucléole cellulaire, et d'expression ubiquitaire.

Une séquence spécifique de ARF permet sa localisation dans le nucléole. Chez l'homme, elle est située dans l'exon 2, correspondant aux résidus 82 à 101 de la protéine [10]. Elle se fixe sur MDM2, induit sa dégradation et stabilise p53. Cela permet l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose induits par p53. Sous l'induction de MDM2, p14^ARF quitte le nucléole, puis participe à la formation de complexes hétérotrimériques (p14^ARF-MDM2-p53) dans le noyau cellulaire, bloquant le passage de p53 et de MDM2 dans le cytoplasme [11]. Un autre mécanisme est la relocalisation et la séquestration nucléolaire de MDM2 par p14^ARF [12]. Ces deux mécanismes permettent la stabilisation de p53, en empêchant sa dégradation. Plus récemment, il a été montré que p14^ARFpouvait stabiliser p53, même sans relocalisation nucléolaire de MDM2, sans que le mécanisme précis de ce processus n'ait encore été décrypté [13].

La transfection de ARF entraîne un arrêt du cycle cellulaire en G1 et en G2, dépendant de la présence de p53 ; les cellules dans lesquelles la protéine p53 est absente (p53^­/­) ou inactivée (par exemple par l'antigène T du virus SV40) ne sont plus sensibles à cet effet de ARF [14].

Des souris spécifiquement knock-out pour l'exon 1b développent spontanément des tumeurs de nombreux types (lymphomes, fibrosarcomes, thymomes...) et, après application cutanée d'un carcinogène initiateur, le DMBA, des carcinomes cutanés à de multiples sites. Les souris hétérozygotes ARF^+/­ développent également des tumeurs, dans lesquelles l'allèle résiduel d'ARF a disparu, fait caractéristique de l'inactivation en deux étapes d'un gène suppresseur de tumeur.

Les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ARF^­/­ n'entrent pas en sénescence et s'immortalisent spontanément. De même, l'immortalisation des MEF des souris hétérozygotes ARF^+/­ s'accompagne soit d'une perte de l'autre allèle d'ARF, soit d'une mutation de p53, ces deux événements étant mutuellement exclusifs.

Implication du locus INKa-ARF dans la prédisposition au mélanome

Mélanome familial

Il est défini par l'existence dans une famille d'au moins deux membres atteints de mélanome et représente 8 à 12 % de l'ensemble des mélanomes. Il présente un certain nombre de caractéristiques cliniques : la présence inconstante d'une entité particulière, le syndrome des nævus atypiques (défini par la présence d'au moins 50 nævus sur le tégument, dont certains sont cliniquement atypiques), un phototype clair et des cheveux roux, la fréquence des mélanomes multiples.

Le mode de transmission est autosomique dominant de pénétrance variable. Les études de liaison génétique ont permis de mettre en évidence deux loci de susceptibilité au mélanome, traduisant une hétérogénéité génétique. Un gène prédisposant au phénotype combiné (nævus atypiques + mélanome) a été initialement localisé sur le locus 1p36, résultat remis en question car de nombreux groupes n'ont pu le reproduire. Un gène de susceptibilité au mélanome familial a pu finalement être situé sur le bras court du chromosome 9 (9p21), près du locus de l'interféron alpha [15] en prenant en compte uniquement les malades atteints de mélanome. D'autres loci potentiels ont été suggérés par étude de liaison et cartographie d'exclusion, notamment sur les chromosomes 6 et 10 [16].

Mutations germinales dans la séquence codante du gène

La même année (1994), deux équipes ont démontré le rôle de p16^INK4A dans la prédisposition au mélanome familial, en mettant en évidence des mutations germinales dans la séquence codante du gène [17, 18].

Depuis 1994, de nombreuses études ont été réalisées, certaines portant sur de grandes séries, qui confirment l'implication de p16^INK4a dans la prédisposition héréditaire au mélanome familial, avec des fréquences différentes. Ces différences ont plusieurs explications : mauvaise stringence des critères retenus pour le diagnostic de mélanome familial, différences méthodologiques quant à la recherche de mutations, hétérogénéité génétique.

Au total, sur 707 familles étudiées, la fréquence globale de détection de mutations germinales de p16^INK4A est de 20 %. Cependant, elle augmente nettement dans plusieurs situations : présence d'au moins 3 cas de mélanomes dans la famille [19, 20], présence d'un malade atteint de multiples mélanomes primitifs dans la famille (fréquence de mutation de 32 à 81 %) et présence d'un cancer du pancréas dans la famille (fréquence de mutation d'environ 40 %) [21]. En revanche, lorsque la famille ne compte que deux cas de mélanome, la fréquence de mutations germinales chute brutalement (5 %), sauf lorsqu'il existe un cas de mélanome multiple primitif. En France, la fréquence de mutations détectées est de 64 % dans les familles avec deux membres atteints au premier degré, lorsque l'un d'eux est porteur d'un mélanome multiple primitif [19].

Plusieurs auteurs ont pu démontrer que les mutations détectées avaient un effet délétère sur la protéine [22, 23]. Les protéines mutantes perdent la capacité de se fixer sur CDK4 ou CDK6 et ne sont plus capables d'inhiber l'activité kinasique des complexes cycline D1-CDK4 et cycline D1-CDK6. Le cancer du pancréas semble particulièrement fréquent dans les familles de mélanomes comportant une mutation fonctionnelle de p16^INK4A [21]. De plus, d'autres cancers semblent plus fréquents : cancer épidermoïde [24], cancers du sein [25], myélome multiple [26], cancers multiples chez un même individu.

Plus récemment, il a été montré que des mutations germinales de p16^INK4A étaient présentes chez des malades atteints de mélanomes multiples primitifs ne rapportant pas d'histoire de mélanome familial [27]. La fréquence des mutations se situe entre 10 % et 15 %.

À l'heure actuelle, aucune mutation spécifique de p14^ARF (c'est-à-dire ne touchant que l'exon 1beta) n'a été détectée chez 180 familles de mélanome étudiées. Cependant, si environ un tiers des mutations germinales de p16^INK4A ne touchent que l'exon 1alpha, la majorité des mutations de l'exon 2 affectent aussi le cadre de lecture de p14^ARF, dont certaines sont situées dans un domaine fonctionnel de p14^ARF crucial (acides aminés 82-101) impliqué dans la localisation nucléolaire de p14^ARF. Sutout, deux publications récentes rapportent la présence de délétions étendues du locus comprenant l'exon 1beta dans des familles associant des cas de mélanome et de tumeurs du système nerveux central [28, 29].

Données actuelles concernant le conseil génétique dans le mélanome familial

Plusieurs cas sont à distinguer :

­ mutations germinales de p16^INK4A ségrégeant avec le phénotype et ayant des conséquences in vitro sur l'activité de la protéine : il paraît raisonnable d'offrir un conseil génétique et une éducation sur les stratégies de prévention du mélanome dans ces familles. Le conseil génétique doit cependant informer quant aux incertitudes concernant la pénétrance des mutations de p16^INK4A, et l'efficacité non prouvée des stratégies de prévention et de surveillance fondées sur le test génétique ;

­ mutations dont on ne dispose pour l'instant d'aucune donnée fonctionnelle, le conseil génétique apparaît actuellement prématuré ;

­ pas de mutation : il faut garder à l'esprit qu'un test génétique négatif n'élimine pas le risque de mélanome ; au mieux il le réduit à celui de la population générale qui, dans certaines régions, est 25 fois plus élevé que la moyenne du fait des facteurs d'environnement (UV) et/ou de l'origine ethnique des habitants (par exemple Australie).

Le diagnostic moléculaire ne doit pas se substituer à l'attitude clinique de surveillance, mais peut, dans certains cas, la guider. L'éducation de tous les membres de la famille en ce qui concerne la photoprotection est capitale, et sa mise en œuvre impérative, en particulier chez les nourrissons et enfants (utilisation de lunettes de soleil, de chapeaux, de vêtements protecteurs, d'écrans solaires de haut indice contre les UVA et les UVB). Dès l'âge de 10 ans, les membres de la famille doivent avoir un examen de l'ensemble du tégument permettant un repérage de l'ensemble des nævus, atypiques ou non. Des photographies d'ensemble et des gros plans des nævus atypiques sont utiles pour la surveillance ultérieure. La surveillance clinique porte sur toute modification de taille, forme, couleur, bordure des nævus connus et sur l'apparition de nouveaux nævus. Une auto-surveillance doit également être pratiquée.

Rôle du locus INK4a-ARF dans la carcinogenèse cutanée

Les carcinomes cutanés non mélaniques sont actuellement les tumeurs ayant la plus forte incidence dans le monde chez les sujets à peau blanche. Le fort taux de récurrence à 5 ans (50 %) et le potentiel invasif local et parfois métastatique font de ces cancers un problème de santé publique majeur. On distingue deux principaux types : 1) les carcinomes basocellulaires (CBC), tumeurs à croissance lente, mais dont le potentiel invasif local peut occasionner des destructions tissulaires importantes ; 2) les carcinomes épidermoïdes (CE), en plus de leur malignité locale, ont un potentiel métastatique élevé. Les CE sont parfois précédés par des lésions précancéreuses : la kératose actinique et la maladie de Bowen.

La transformation des kératinocytes est un événement à plusieurs étapes (initiation, promotion tumorale, puis conversion maligne). Les gènes impliqués sont différents selon qu'il s'agisse des CBC ou des CE : des mutations du gène p53, le plus souvent de type UV-induites, sont présentes dans 30 à 50 % des CE et CBC [30].

La voie de signalisation Sonic Hedgehog (Shh) apparaît capitale dans l'oncogenèse des CBC. Shh est le ligand de patched (ptch), récepteur transmembranaire associé à une autre protéine, smoothened (Smo). La fixation de Shh sur ptch lève l'inhibition de ptch sur Smo, permettant l'activation de signaux intracellulaires de différenciation et/ou de prolifération (figure 2). L'activation de la voie conduit à la transcription de plusieurs gènes cibles, incluant ptch et les facteurs de transcription Gli1 et Gli3 [31]. Des mutations du gène patched sont trouvées dans 33 % des CBC sporadiques, souvent de type UV-induites [32]. Plus récemment, des mutations activatrices de Smo ont aussi été mises en évidence [33].

Il existe de multiples arguments faisant penser que le locus INK4a-ARF joue un rôle très important dans la carcinogenèse cutanée : fréquentes pertes d'hétérozygotie du locus 9p21 (30 à 40 % des carcinomes) [34], inhibition de la multiplication des kératinocytes murins après transfection par p16^INK4A, suppression du phénotype tumoral de kératinocytes tumoraux après transfection de p14^ARF, développement chez les souris nullizygotes (INK4a-ARF^­/­) de carcinomes épidermoïdes cutanés après irradiation par les UVB et/ou application cutanée de carcinogènes chimiques (7,12 diméthylbenz[a] anthracène (DMBA), souvent utilisé comme carcinogène initiateur) [35].

Carcinomes cutanés sporadiques

Notre travail a permis de détecter des mutations somatiques de INK4a-ARF dans 12 % des carcinomes cutanés étudiés, 24 % des CE et 3,5 % des CBC, avec un profil mutationnel typiquement UV-induit [36]. Parallèlement, des mutations du gène p53 étaient présentes dans 19 % des CE et 46 % des CBC. Les mutations de p16^INK4A sont donc aussi fréquentes dans les CE, dans cette série, que les mutations de p53, ce qui suggère un rôle important de p16^INK4A dans l'oncogenèse de ces cancers. Dans deux tiers des cas, les mutations étaient de type UV-induites (soit doubles transitions CC -> TT, soit transition C -> T à des sites dypirimidiques CC). Cela souligne le rôle mutagène des UV dans la carcinogenèse cutanée. De telles mutations avaient été précédemment décrites dans des lignées de mélanome et des mélanomes primitifs. P16^INK4A, comme p53, peut donc être inactivé par mutagenèse UV, sous l'effet de la formation de photoproduits, en particulier de dimères de pyrimidines.

Le rôle de ces mutations sur le processus de carcinogenèse pourrait être de faciliter l'immortalisation kératinocytaire, d'empêcher l'inhibition de contact, conférant un avantage sélectif supplémentaire aux cellules tumorales, d'occasionner un déficit « fonctionnel » de réparation de l'ADN. Il a été en effet montré que l'irradiation UV de lignées de mélanomes irradiées n'exprimant pas p16^INK4A, ou ayant une mutation de p16^INK4A, empêchait le ralentissement du cycle cellulaire, et, parallèlement, augmentait le nombre de lésions d'ADN UV-induites [6]. p16^INK4A pourrait donc avoir un rôle dans le stress génotoxique, permettant notamment la réparation de certaines lésions de l'ADN par le biais d'un ralentissement du cycle cellulaire.

En fait, plusieurs expériences montrent que la dérégulation de l'axe cycline D1-CDK4-Rb-E2F apparaît essentielle dans le processus de carcinogenèse cutanée. La surexpression de E2F1 ciblée dans l'épiderme murin (sous le contrôle du promoteur de la kératine 5) entraîne une hyperplasie épidermique. Le croisement de ces souris avec des souris exprimant un transgène ras activé aboutit à la formation précoce de papillomes. De plus, le croisement de ces mêmes souris avec des souris p53 hétérozygotes ou nullizygotes (qui ne développent spontanément que rarement des carcinomes cutanés) induit l'apparition de nombreuses tumeurs cutanées.

Dans notre étude [36], la totalité des mutations siégeaient dans l'exon 2 de p16, commun à p16^INK4A et p14^ARF, et deux tiers d'entre elles entraînaient des modifications de p14^ARF, lui suggérant donc un rôle dans le processus tumoral. Dans une précédente étude, les mutations détectées dans des CE étaient toutes situées dans le domaine fonctionnel de p14^ARF [37]. N'oublions pas que les souris ARF^­/­ développent spontanément ou après irradiation UVB des CE ou des papillomes cutanés à de multiples sites. Cependant, en l'absence d'études fonctionnelles de mutants p14^ARF spécifiques, il est impossible de conclure avec certitude quant à la nature délétère de ces mutations.

Implication du locus INK4a-ARF dans les carcinomes de malades atteints de xeroderma pigmentosum [38]

Le xeroderma pigmentosum (XP) est une génodermatose de transmission héréditaire autosomale récessive prédisposant à la survenue de carcinomes cutanés à un âge précoce. Cette maladie constitue de ce fait un excellent modèle pour mieux comprendre et préciser les anomalies génétiques impliquées dans la carcinogenèse cutanée. Plusieurs anomalies ont déjà été caractérisées dans les carcinomes cutanés des malades atteints de xeroderma pigmentosum, impliquant les gènes ras et p53 dans les CBC et les CE, et plus spécifiquement le gène patched dans les CBC.

Notre étude a permis de mettre en évidence des mutations inactivatrices de p16^INK4a dans environ un tiers des tumeurs XP analysées, 33 % des CE et 20 % des CBC (tableau).

Les mutations de p16^INK4a sont plus nombreuses que dans les carcinomes sporadiques (tableau), ce qui est probablement en rapport avec l'hypermutabilité et l'instabilité génétique des cellules des malades atteints de xeroderma pigmentosum [39].

Les mutations sont UV-induites et en grande majorité composées de mutations en tandem CC:GG -> TT:AA. Ce spectre mutationnel est typique de la mutagenèse induite par les rayonnements ultraviolets, et est très différent de celui observé dans les cancers viscéraux, dans lesquels plus de la moitié des mutations détectées sont des transversions. Il apparaît aussi spécifique du xeroderma pigmentosum du groupe C [39]. Les cellules XPC réparent très lentement les lésions de l'ADN UV-induites, ce qui pourrait favoriser une double désamination des dimères de cyclobutanes cytosines [40].

Il existe des points chauds mutationnels (hot spots), trois mutations représentent plus des deux tiers du nombre total des mutations de p16^INK4a [38]. Cette mutagenèse préférentielle pourrait être directement liée à la séquence nucléotidique de ces codons (CCG ou CCC), cible préférentielle des UV et/ou au rôle important joué par ces codons dans la structure ou la fonction des protéines p16^INK4a ou p14^ARF.

Les mutations de p16^INK4a et p53 sont situées en grande majorité sur le brin non transcrit [38], ce qui reflète donc une réparation préférentielle des lésions UV-induites de l'ADN situées sur le brin transcrit. Cela est probablement lié au fait qu'au moins la moitié des tumeurs cutanées étudiées provenait de malades XPC dont le déficit NER n'affecte que la réparation globale.

L'ensemble des tumeurs mutées comportait une mutation affectant le cadre de lecture de p14^ARF, bien qu'aucune mutation n'ait été détectée spécifiquement dans l'exon 1beta. Ces mutations pourraient avoir un effet délétère sur la fonction de p14^ARF car, dans la majorité des tumeurs XP, elles affectent un codon conservé entre les ADNc humain et murin et/ou elles sont situées dans le domaine fonctionnel de p14^ARF.

Dans les carcinomes XP, il existe une forte association entre la présence de mutations de p16^INK4a et de p53, et de p53 et p14^ARF, et ce, contrairement aux carcinomes cutanés sporadiques et à la plupart des tumeurs humaines [14]. Cela pourrait être dû à une sélection préférentielle de clones tumoraux ayant des mutations de plusieurs gènes, à un effet coopératif des voies de signalisation p14^ARF-p53 et p16^INK4a-pRb et au fait que les fonctions de p53 et de p14^ARF ne sont pas strictement superposables (en particulier p14^ARF ne semble pas intervenir dans le stress génotoxique, mais constitue une ligne de défense contre les signaux oncogéniques)

CONCLUSION

Le locus INK4a-ARF joue donc un rôle très important dans la prédisposition au mélanome familial. Cependant, plusieurs questions demeurent :

1) Quel est l'impact exact de chaque mutation au plan fonctionnel ? De nombreux tests ont été développés, mais ils présentent des limites du fait qu'ils ne reproduisent qu'imparfaitement la réalité présente in vivo. Il faudrait donc s'attacher à développer un test simple, reproductible et fiable. Cette étape paraît capitale dans la perspective d'un conseil génétique de bonne qualité.

2) Quelle est la pénétrance des mutations germinales de p16^INK4A ? La pénétrance a été évaluée de 53 à 64 %, mais dans des petites séries. Il paraît donc souhaitable de l'évaluer en réalisant des études sur un grand nombre de familles, dans différentes régions du monde. Là encore, ces réponses sont souhaitables dans la perspective du conseil génétique.

3) Les mutations germinales de p16^INK4A sont-elles le seul facteur de risque génétique dans les familles de mélanomes mutées ? Pour une mutation donnée, le risque de mélanome n'est probablement pas identique dans des familles différentes. Cela suggère que le background génétique familial joue très probablement un rôle. Il vient par exemple récemment d'être démontré que certains polymorphismes du récepteur à l'alphaMSH étaient fortement associés à un risque de mélanome.

4) Une étude préliminaire suggère que les mutations germinales de INK4a-ARF pourraient aussi être détectées dans d'autres situations que celle du mélanome familial (survenue de mélanome à un âge jeune, syndrome des nævus atypiques associé à un mélanome). La réponse précise à ces questions nécessite des investigations complémentaires telle qu'une étude clinique, épidémiologique et génétique prospective de nombreux malades.

5) Il n'a pas été mis en évidence de mutation de INK4a-ARF dans certaines familles liées génétiquement au locus 9p21. Ces cas peuvent correspondre à des mutations non détectées car présentes dans les régions régulatrices du gène ou de délétions de l'ensemble du gène qui n'auraient pas été mises en évidence par les techniques classiques. Les hypothèses d'une empreinte parentale d'un des deux allèles qui influerait sur le niveau d'expression de p16^INK4A ou de p14^ARF, ou de l'inactivation d'un autre gène situé sur le même locus sont également possibles.

Hormis son rôle dans la prédisposition héréditaire au mélanome familial, l'inactivation somatique du locus INK4a-ARF par le biais de mutations UV-induites apparaît importante dans la carcinogenèse cutanée. Plusieurs questions restent en suspens : stade auquel survient l'inactivation du locus (lésions débutantes, initiation tumorale ou lésions évoluées, progression tumorale), importance des autres modes d'inactivation, en particulier de la méthylation, et rôle joué par p16^INK4A dans le stress génotoxique.

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