ARTICLE
104 - Implication du système Fas/FasL et
de la thymidine phosphorylase dans la réponse apoptotique induite
par la capécitabine (Xéloda®)
Bezulier K 1, Ciccolini J 1,
Evrard A 2, Cuq P 2, Aubert C 1, Cano
JP 2, Catalin J 1
1 Upres-EA3286, Laboratoire de
pharmacocinétique, UFR Pharmacie, Marseille.
2
Laboratoire de toxicologie, UFR Pharmacie, Montpellier.
La capécitabine (Xéloda®) est une nouvelle
fluoropyrimidine dont l'activation en métabolites cytotoxiques
est sous la dépendance de diverses enzymes hépatiques (carboxyl
estérase, cytidine déaminase) et tumorales (thymidine phosphorylase).
Afin d'expliciter le rôle de la thymidine phosphorylase (TP) comme
facteur déterminant la réponse tumorale à la capécitabine,
un modèle in vitro de co-culture hépatique/colique
a été développé. L'utilisation de la lignée
d'adénocarcinome colique humain LS174T transfectée par le
gène codant pour la TP humaine a ainsi permis de montrer que les
clones à forte activité TP (LS174T-TP+) étaient
jusqu'à 7 fois plus sensibles à la capécitabine que
les cellules sauvages. Des études complémentaires ont confirmé
une plus forte induction de l'apoptose précoce et tardive au sein
des lignées TP+ exposées à la capécitabine.
En outre, nous avons également montré une surexpression
de près de 300 % de la protéine apoptotique CD95 (Apo1-Fas)
au sein des cellules TP+ après traitement par la capécitabine.
Cette implication de Fas dans l'apoptose induite par la capécitabine
a été confirmée par l'utilisation d'anticorps anti-Fas
et anti-FasL qui ont antagonisé le gain de cytotoxicité
observé au sein des clones transfectés.
Nos données in vitro suggèrent ainsi que la fonctionnalité
de Fas est un facteur à prendre en compte dans l'expression de
la sensibilité tumorale à la capécitabine, et qu'une
forte activité TP se traduit par une réponse antiproliférative
optimisée. Des études complémentaires chez la souris
nude xénogreffée seront nécessaires afin de préciser
le rôle exact de Fas/FasL dans l'effet antitumoral de la capécitabine
in vivo.
105 - La progression
tumorale dans l'épithélium de la tête et du cou est
accompagnée par une augmentation parallèle et continue de
l'activité télomérase et des altérations des
régulateurs du cycle cellulaire
Soria JC 1, 2, Morat L 2, Commo
F 1, Dabit D 1, Perie S 3, Sabatier L
2, Fouret P 4
1 Service d'anatomie pathologique,
Hôpital Tenon, UFR Saint-Antoine, Paris.
2 CEA, DSV/DRR/Laboratoire de radiobiologie et oncologie,
BP 6, Fontenay-aux-Roses.
3 Service d'ORL et de chirurgie de la face et du cou, Hôpital
Tenon, UFR Saint-Antoine, Paris.
4 Service d'anatomie
et de cytologie pathologiques, Groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière,
UFR Pitié-Salpêtrière, Paris.
Des modèles cellulaires ou animaux ont montré que les
altérations des régulateurs du cycle cellulaire (p16/Rb/cycline
D1) peuvent coopérer avec l'activation de la télomérase
durant l'immortalisation cellulaire et la progression tumorale. Les observations
faites dans les tumeurs humaines sont-elles compatibles avec ces schémas
?
Méthodes. Nous avons étudié l'expression
de p16 par immunohistochimie et l'activité télomérase
par TRAP dans 21 lésions prémalignes et 27 carcinomes épidermoïdes
(CE) infiltrants des voies aérodigestives supérieures. Nous
avons également examiné l'expression d'autres régulateurs
du cycle cellulaire (cycline D1, Rb) ainsi que la présence de génomes
de papillomavirus.
Résultats. Quatre sur 9 dysplasies légères
(44 %), 8 sur 12 dysplasies avancées (67 %) et 25 sur 27 CE (92
%) avaient une activité télomérase élevée
(p = 0,009 pour la tendance). Il y avait un accroissement parallèle
avec la sévérité des lésions pour les proportions
de cas avec inactivation de p16 ou surexpression de la cycline D1 (p =
0,02 and p = 0,01, respectivement). Pour Ki67, un marqueur de prolifération,
cette tendance n'était pas significative (p = 0,08). Des papillomavirus
infection étaient observés dans 4 cas seulement (8,3 %).
Conclusion. La progression de la maladie est accompagnée
par une augmentation parallèle et continue de l'activité
télomérase et des altérations des régulateurs
du cycle cellulaire. Ces observations sont compatibles avec les modèles
in vitro de coopération entre ces anomalies.
106 - Étude
du statut Fas/FasL au sein de tumeurs colorectales : facteur pronostique
de réponses aux fluoropyrimidines ?
Bézulier K 1, Ciccolini J 1, Fina F
2, Martin PM 2, Milano G 3, Catalin J
1
1 Upres-EA3286, Laboratoire de
pharmacocinétique, Faculté de pharmacie, Marseille.
2 Laboratoire d'oncologie expérimentale, Faculté
de médecine Nord, Marseille.
3 Laboratoire d'oncopharmacologie,
Centre Antoine-Lacassagne, Nice.
Les récentes connaissances en oncologie ont permis de reconsidérer
la problématique anticancéreuse. Ainsi la progression tumorale
est désormais reconnue plus comme la conséquence d'une suppression
de l'apoptose que d'une inactivation de la prolifération cellulaire.
Dans cette optique, l'arsenal chimiothérapeutique n'est plus considéré
selon ses seules propriétés cytotoxiques, mais également
selon ses capacités à induire ou à restaurer une
réponse apoptotique.
Le 5-fluorouracile ou 5FU (chef de file des fluoropyrimidines et molécule
de référence dans le traitement du cancer colorectal) fait
ainsi l'objet de nombreuses études visant à élucider
quelles sont les voies de signalisation intervenant dans la transmission
du signal apoptotique résultant de son utilisation. Après
la mise en évidence in vitro de l'implication du système
Fas/FasL dans cette transmission d'apoptose induite par le 5FU, il nous
a paru intéressant de se pencher sur le rôle éventuel
de ce système en pratique clinique. Pour cela nous avons étudié
rétrospectivement sur un panel de biopsies tumorales coliques et
hépatiques, issues de patients avant avoir été traités
avec un protocole de type Fufol, l'expression du système Fas/FasL
par RT-PCR quantitative en temps réel. Ainsi, nous cherchons à
établir une corrélation entre le statut répondeur/non
répondeur des patients et une anomalie du système Fas/FasL
au sein des tumeurs, pour à terme déterminer si l'expression
tumorale de Fas/FasL peut être un paramètre utilisable comme
facteur pronostique de réponse aux fluoropyrymidines.
107 - Effet anti-proliférant
et mécanisme d'action de l'agmatine sur deux lignées d'adénocarcinome
de côlon humain HT29 et Caco2
Michaud M, Garrigue J, Bayard A, Blachier F, Mayeur
C
Laboratoire de nutrition et sécurité
alimentaire, CRJ, INRA, 78352 Jouy-en-Josas Cedex.
L'agmatine est un métabolite dérivant de l'arginine alimentaire
via l'arginine décarboxylase des bactéries coliques
(une voie métabolique de l'arginine distincte de celle des polyamines).
L'agmatine est capable de réduire la prolifération de plusieurs
types cellulaires d'origine non intestinale, en interférant avec
le métabolisme des polyamines. Afin d'étudier l'effet anti-proliférant
et le mécanisme d'action de l'agmatine sur deux lignées
d'adénocarcinome colique humain, les cellules HT29Glc/+
et Caco2 ont été cultivées en présence
ou en l'absence d'agmatine sulfate à des concentrations croissantes
(de 100 muM à 5 mM).
L'agmatine réduit la croissance des cellules HT29 et des Caco2
dès 2 mM et provoque une inhibition maximale à 5 mM dans
les deux lignées cellulaires. Elle n'a aucun effet nécrotique
(mesuré par la fuite de la lactate déhydrogénase)
sur les deux lignées étudiées, quelles que soient
la dose d'agmatine et la durée du traitement. En utilisant la cytométrie
en flux, nous avons déterminé sur les cellules HT29 adhérentes
que l'agmatine (5 mM) diminue la proportion de cellules en phase G1 et
augmente celle de la phase G2/M avec un décollement des cellules
après trois jours de traitement. Les premières analyses
sur Caco2 suggèrent fortement que l'agmatine possède
un effet identique sur les deux lignées.
La biosynthèse des polyamines (dont la putrescine) est régulée
au cours du cycle cellulaire. Afin d'étudier le mode d'action de
l'agmatine, nous avons mesuré le flux de l'ornithine à travers
l'ornithine décarboxylase (ODC : enzyme limitante de la synthèse
de polyamines) et le transport de putrescine en présence ou en
l'absence d'agmatine (de 1 mM à 5 mM). Les premiers résultats
sur cellules HT29 suggèrent que l'agmatine inhibe très rapidement
le flux d'ornithine à travers l'ODC (mesuré sur cellules
viables) et l'activité catalytique de l'ODC (mesurée sur
homogénat cellulaire). En outre, l'agmatine réduit rapidement
le transport de putrescine (mesuré sur cellules intactes).
Ces résultats montrent que l'agmatine réduit la croissance
des cellules HT29 et Caco2 et arrête les cellules en
fin de cycle cellulaire (phase G2/M), sans aucun effet nécrotique.
De tels effets pourraient être médiés par une réduction
massive de la biosynthèse endogène de polyamines et du transport
de putrescine à travers la membrane plasmique. D'autres études
sur modèles animaux de carcinogenèse chimio-induite pourraient
confirmer le rôle modulateur potentiel de l'agmatine à l'égard
du cancer colorectal.
108 - L'estérification
avec le phénylacétate (NaPaC) sur la prolifération
des cellules tumorales mammaires MCF7ras in vitro et in vivo
Di Benedetto M, Briane D, Oudar O, Derbin C, Crépin
M, Kraemer M
Université Paris 13, Upres 2360, Laboratoire
d'oncologie cellulaire, 74, rue Marcel-Cachin 93017 Bobigny Cedex.
Le phénylacétate de sodium (NaPa) et un carboxyméthyl
benzylamide dextran (CMDB7) sont capables de bloquer la prolifération
des cellules tumorales mammaires MCF7ras in vitro et in vivo.
Les résultats antérieurs ont montré que les CMDB
bloquent la croissance des tumeurs MCF7ras induites chez la souris athymique
en inhibant l'angiogenèse tumorale.
Nous avons étudié l'effet d'un nouveau produit, le NaPaC
(Sterilyo, France), dérivé du dextrane obtenu par l'estérification
d'un CMDB (le LS17 de composition chimique identique au CMDB7) avec le
NaPa sur la croissance des tumeurs MCF7ras. Nous avons choisi une concentration
en NaPaC 10 fois moins importante que les doses de CMDB habituellement
utilisées (150 mg/kg) afin de mettre en évidence l'amélioration
de l'effet antiprolifératif du dérivé du dextrane
après substitution avec le phénylacétate. Les résultats
montrent que ce NaPaC inhibe à une très faible dose (15
mg/kg), la croissance tumorale des tumeurs MCF7ras en bloquant l'angiogenèse
tumorale. Nous avons montré que l'association des molécules
libres NaPa-CMDB inhibe également de manière synergique
la prolifération des cellules Huvec-C in vitro. Cependant,
les effets anti-angiogéniques de cette association ne sont pas
supérieurs à ceux de chacune des molécules. Le NaPaC
permet d'augmenter les effets antiprolifératifs induits par l'association
NaPa-CMDB in vitro et in vivo. En fonction de son degré
de substitution en phénylacétate, le NaPaC inhibe de 3 à
100 fois plus la prolifération des cellules MCF7ras in vitro
par rapport à l'association NaPa-CMDB. Comme les dérivés
du dextrane CMDB, le NaPaC inhibe complètement l'activité
mitogénique des milieux conditionnés des cellules MCF7ras
sur les fibroblastes et sur les cellules endothéliales.
109 - ICBP90 (Inverted
CCAAT box Binding Protein of 90 kDa) : un nouveau marqueur de prolifération
des cellules cancéreuses
Mousli M 1, Hopfner R 1, Bathami
K 1, Marin C 2, Bellocq JP 2, Vignaud
JM 3, Louis B 4, Bronner C 1
1 Inserm U. 425, Faculté
de Pharmacie, 74, route du Rhin, BP 24, 67401 Illkirch Cedex.
2 Service d'anatomolgie-pathologie, Hôpital de Hautepierre,
67200 Strasbourg.
3 Service d'anatomolgie-pathologie, CHU Brabois, rue Morvan,
54500 Vandœuvre-lès-Nancy.
4 Centre de pathologie,
18, rue Kempf, 67015 Strasbourg Cedex.
Nous avons récemment identifié une nouvelle protéine
humaine, appelée ICBP90 pour Inverted CCAAT box Binding Protein
of 90 kDa. Il s'agit d'un facteur de transcription régulant l'expression
de la topoisomérase IIalpha, cible majeure des substances anti-cancéreuses
de nouvelle génération. L'originalité réside
dans le fait que cette protéine serait le premier membre d'une
nouvelle famille de facteurs de transcription contrôlant la prolifération
cellulaire normale et pathologique. L'ICBP90 est exprimée dans
des cellules non tumorales (fibroblastes pulmonaires et cellules musculaires
lisses bronchiques), uniquement lorsqu'elles sont en prolifération.
En revanche, dans des cellules tumorales (cellules A549, HeLa, Jurkat...)
l'ICBP90 est encore exprimée lorsque les cellules sont à
confluence. Le gène de l'ICBP90 est long d'environ 36 kilobases
et constitué de 6 exons traduits et de 2 exons non traduits. Plusieurs
régions promotrices, entraînant la transcription de différents
ARN messagers, semblent mises en jeu en fonction du type cellulaire.
Les premiers résultats, obtenus en immuno-histochimie sur des
coupes histologiques de tumeurs mammaires, bronchiques, coliques et prostatiques,
montrent que l'ICBP90 est un marqueur de prolifération des cellules
cancéreuses. Ces premiers résultats suggèrent que
sa fiabilité pourrait s'avérer supérieure à
celle du marqueur traditionnellement utilisé, le Ki67 (Mib1). L'utilisation
de l'ICBP90 en tant que marqueur de cellules cancéreuses en prolifération
pourrait représenter un allié précieux pour les nouvelles
microtechniques de diagnostic précoce des cancers.
110 - La sensibilisation
à Trail des cellules cancéreuses coliques humaines HT29
conduit au clivage de Bid et à la dépolarisation de la membrane
mitochondriale
Lacour S, Hammann A, Drouineaud V, Solary E, Dimanche-Boitrel
MT
Unité Inserm U. 517 Mort cellulaire et cancer,
Faculté de Médecine, 7, boulevard Jeanne-d'Arc, 21000 Dijon.
Trail (TNF-related apoptosis inducing ligand) est un agent thérapeutique
potentiel appartenant à la superfamille du TNFalpha, capable d'induire
la mort par apoptose de nombreuses cellules cancéreuses humaines
in vitro mais aussi in vivo. Précédemment,
nous avons montré que la sensibilisation à l'apoptose induite
par Trail par les agents anticancéreux des cellules HT29 impliquait
l'activation de la procaspase 8. Ici, nous avons complété
ce travail en étudiant l'expression et le clivage de Bid (cible
de la caspase 8) par western-blot et la dépolarisation de la membrane
mitochondriale analysée par cytométrie en flux après
marquage par le DePsipher, au cours des traitements associant Trail à
un agent anticancéreux (cisplatine, doxorubicine ou 5-fluorouracile).
Dans un premier temps, nous montrons qu'un traitement par les agents
anticancéreux ou par le ligand Trail ne modifie pas l'expression
de la molécule proapoptotique Bid et n'induit pas son clivage.
Seuls les traitements associant les agents anticancéreux à
Trail conduisent au clivage de Bid en sa forme tronquée tBid de
15 kDa. De même, seules les associations (agent anticancéreux
+ Trail) conduisent à la dépolarisation de la membrane mitochondriale.
Au cours d'une étude cinétique, nous montrons qu'il existe
une parfaite concordance entre l'activation de la procaspase 8, le clivage
de Bid et la dépolarisation de la membrane mitochondriale, phénomènes
observables à partir de 10 heures de cotraitement.
Dans un deuxième temps, nous montrons que l'inhibiteur perméant
IETD-fmk spécifique de la caspase 8 inhibe à la fois la
sensibilisation à Trail par les agents anticancéreux dans
un test de marquage par le Hoechst et une partie de la dépolarisation
de la membrane mitochondriale. De même, l'inhibiteur perméant
LEHD-fmk spécifique de la caspase 9 inhibe en partie l'apoptose
induite par ces cotraitements.
L'ensemble de ces données suggère que la voie mitochondriale
pourrait participer aussi à la sensibilisation à Trail par
les agents anticancéreux dans les cellules HT29.
111 - BRCA1 possède
une activité antitumorale distincte de celle de p53 et p21
Randrianarison V 1, Marot D 1,
Foray N 2, Cabannes J 1, Meret V 2, Connault
E 1, Opolon P 1, Perricaudet M 1, Feunteun
J 2
1 Unité vectorologie et
transfert de gènes CNRS UMR1582,
2 Unité génétique oncologique, CNRS1599,
Institut Gustave-Roussy, 39, rue Camille-Desmoulins, 94800 Villejuif.
La perte de la fonction du gène BRCA1 apparaît comme
une étape cruciale dans l'oncogenèse des cellules épithéliales
mammaires et ovariennes. L'appartenance de BRCA1 à la famille
des gènes suppresseurs de tumeurs semble acquise, même si
son rôle biologique demeure non élucidé. En 1996,
Holt et al. ont rapporté que l'apport exogène du
gène BRCA1 au moyen d'un vecteur rétroviral inhibe la prolifération
cellulaire et tumorale de lignées cancéreuses mammaires
et ovariennes. Depuis cette observation cependant, cette activité
anti-tumorale de BRCA1 n'a plus été documentée.
En utilisant un vecteur adénoviral, nous avons étudié
l'effet du transfert de BRCA1 dans des cellules cancéreuses
mammaires et ovariennes de statuts différents en BRCA1 et
p53, et l'avons, en outre, comparé à celui de p53
ou p21. Nos résultats ont montré que l'apport de
BRCA1 sauvage inhibe la prolifération des cellules in
vitro et leur tumorigénicité. De même, dans des
tumeurs préétablies in vivo, l'administration de
BRCA1 est aussi efficace que celle de p53 ou de p21
pour induire l'inhibition de la croissance ou la régression tumorale.
Cependant, le mécanisme responsable de leur activité anti-proliférative
est différent. En effet, à l'inverse de p53 et de
p21, BRCA1 n'induit ni l'apoptose ni l'arrêt du cycle en
G1. De plus, le transfert de BRCA1 n'entraîne ni l'activation
de p53, ni celle de p21. Différent et indépendant
de celui de p53 et de p21 donc, le mécanisme anti-tumoral
de BRCA1 reste néanmoins à définir.
112 - Le changement
de conformation des p53 mutantes est-il la composante essentielle pour
un effet dominant négatif vis-à-vis de la p73 ?
Bensaad K 1, Le Bras M 1, Unsal
K 1, Tominaga O 1, Rouillard D 2, Delattre
V 1, Soussi T 1
1 Laboratoire de génotoxicologie
des tumeurs,
2 Service de cytométrie,
Institut Curie, 26,
rue d'Ulm, 75005 Paris.
La protéine p53 est un facteur de transcription qui a un rôle
essentiel dans le maintien de l'intégrité du génome.
Suite à un stress génotoxique, elle est stabilisée
et active alors la transcription de nombreux gènes impliqués
dans l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose. Afin de mieux comprendre
les relations entre la structure et la fonction biologique de la protéine
p53 humaine, nous avons généré des protéines
chimériques entre les p53 humaines (p53H) et de xénope (p53X),
phylogénétiquement très proches.
La protéine p53X est thermosensible : elle a une conformation
sauvage à 32 °C qui est proche de sa température physiologique
(27 °C), mais elle a une conformation mutante à 37 °C.
Les parties centrales de p53H et p53X, comportant leur domaine de fixation
à l'ADN, ont été échangées afin de
générer deux protéines chimériques. Les comportements
de ces protéines ont été étudiés, à
32 et 37 °C, au niveau de la fixation à l'ADN, de la transactivation,
de l'apoptose et de l'inhibition de la croissance cellulaire. Il a ainsi
été montré que la partie centrale de la p53X est
responsable de la thermosensibilité de la protéine, quel
que soit le contexte p53 des régions adjacentes, humaine ou xénope.
La protéine p73alpha, un homologue de la p53, peut interagir avec
certaines p53 mutantes, mais pas avec la p53 sauvage. Cette activité
serait responsable de l'activité oncogénique dominante de
certaines p53 mutantes dans les cancers humains. Cette interaction serait
spécifique des p53 mutantes ayant subi un changement de conformations.
Les protéines chimériques que nous avons générées
subissent un changement conformation en l'absence de toute mutation et
devraient donc se révéler des outils très utiles
pour valider ce modèle d'interactions p53 mutantes et p73. Des
expériences préliminaires montrent que la p53X se fixe fortement
à p73 à 37 °C.
113 - Deux voies
alternatives d'induction de l'apoptose par la staurosporine
Belmokhtar CA, Hillion J, Ségal-Bendirdjian
E
Inserm U. 496, Centre G.-Hayem, Hôpital Saint-Louis,
1, avenue Claude-Vellefaux, 75010 Paris.
La sensibilité des cellules tumorales aux anticancéreux
dépend essentiellement de l'efficacité de ces agents à
induire l'apoptose. Cependant, une variété de voies de signalisation
contrôle cette induction et par conséquent détermine
la susceptibilité des cellules à la mort.
Nous avons mis en évidence que des agents pharmacologiques différents
(cisplatine, staurosporine) peuvent induire deux voies distinctes d'apoptose
impliquant des endonucléases différentes [Exp Cell Res
1995 ; 350-400 et Exp Cell Res 2000 ; 99-109]. En utilisant deux
sous-lignées de leucémie murine L1210 (L1210/S et L1210/0),
nous mettons en évidence que la staurosporine active deux voies
de signalisation de l'apoptose différentes selon l'équipement
enzymatique de la cellule : une voie « rapide » (3 h), dépendante
de l'activation des caspases, et une voie « lente » (12 h) indépendante
des caspases. Dans les deux cas, les cellules meurent par apoptose [Oncogene,
2001, sous presse]. L'utilisation d'un inhibiteur des caspases à
large spectre, z-VAD-fmk, a permis de montrer que les deux voies coexistent
dans la lignée L1210/S, mais que la voie lente, indépendante
des caspases, est masquée par la voie rapide, dépendante
des caspases. Seule la voie lente est observée dans la lignée
L1210/0. L'absence de la voie rapide dans la lignée L1210/0 semble
être la conséquence d'un défaut général
d'activation des caspases, actuellement en cours d'identification.
Ainsi, ce système cellulaire constitue un outil de choix pour
distinguer dans l'apoptose les événements associés
à l'activation des caspases et pour identifier les facteurs qui
vont déterminer les cellules à entrer dans un processus
d'apoptose dépendant ou non de l'activation des caspases.
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