Technological advances in immuno-oncology: from fundamental concepts to patient immunological monitoring

ARTICLE

L'immunologie du cancer a connu au cours des dernières décennies un bouleversement grâce aux concepts nouveaux autour de la découverte des antigènes de rejet tumoral, des bases moléculaires et cellulaires de la reconnaissance lymphocytaire, l'adhésion et la costimulation, une meilleure connaissance du conflit entre le système tumoral et le système immunitaire de l'hôte, mais également une sophistication croissante des technologies. Ces avancées considérables ont relancé l'intérêt pour les immunothérapies anticancéreuses.

En effet, le développement technologique a largement contribué et facilité l'émergence de nouveaux concepts et permis le développement de la biothérapie du cancer. Nous allons illustrer les quelques innovations technologiques dans le domaine de l'immuno-oncologie qui ont permis un renouvellement significatif des concepts et la naissance des outils qui permettent actuellement à l'immunothérapie d'être un mode de traitement. Il est devenu clair qu'un suivi qualitatif et quantitatif de la réponse immune permettrait d'orienter des phases ultérieures et devrait fournir de précieuses informations sur les nouvelles stratégies en immunothérapie génique et cellulaire. En effet, l'évaluation des réponses immunitaires chez les patients traités dans les essais d'immunothérapie constitue un objectif dominant indispensable à l'optimisation de ces traitements. Il s'agit d'identifier des critères objectifs de réponse biologique dans le but d'établir à terme des corrélations avec l'efficacité thérapeutique. C'est en partie grâce aux innovations technologiques que les suivis immunologiques sont devenus mieux adaptés et ont permis quelquefois l'amélioration de protocoles d'immunothérapie. Nous citerons les plus pertinentes.

Clonage des antigènes tumoraux, identification des peptides les plus immunogènes et approches vaccinales

Antigènes de rejet des tumeurs

Un axe de recherche en immunologie des tumeurs correspond à l'identification d'antigènes tumoraux avec l'espoir que l'immunisation de patients cancéreux contre ces antigènes pourrait déclencher une réaction immunitaire capable d'éliminer la tumeur sans endommager les tissus sains. De nombreuses études ont montré que, chez les patients porteurs de cancer, en particulier de mélanome, il est possible de dériver in vitro des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de réagir contre la tumeur, mettant ainsi en évidence une réponse immune spécifique et permettant l'identification d'antigènes associés. Différents mécanismes permettent la génération de peptides épitopiques reconnus par les lymphocytes T spécifiques de cellules tumorales (tableau). Ces épitopes peuvent provenir soit de gènes non mutés exprimés uniquement dans les cellules tumorales ou dans certains tissus sélectifs, soit de séquences introniques exprimées d'une façon aberrante, soit de gènes normaux mais traduits de manière alternative à la normale, soit de gènes mutés exprimés uniquement par les cellules tumorales [1-2].

Les méthodes d'identification des antigènes de tumeurs

* Approche génétique

Plusieurs approches ont été développées afin de caractériser les gènes qui codent les antigènes associés aux tumeurs reconnus soit par les lymphocytes T, soit par les lymphocytes B. La plupart de ces approches nécessitent au préalable l'établissement de clones lymphocytaires T, obtenus à partir des lymphocytes du sang périphérique de patients cancéreux ou à partir des lymphocytes infiltrant les ganglions de drainage ou la tumeur (TIL), et de lignées tumorales reconnues spécifiquement par ces effecteurs lymphocytaires autologues (figure 1). L'approche génétique permet d'identifier des antigènes tumoraux reconnus par des CTL ou des lymphocytes T auxiliaires (Th) spécifiques. Cette approche, mise au point par l'équipe de T. Boon en 1991, a permis de caractériser le premier antigène associé au mélanome, MAGE-1, reconnu par un clone CTL [3]. Elle consiste à transfecter, conjointement dans des cellules receveuses (les cellules 293-EBNA), une banque d'ADNc préparée à partir des ARNm des cellules tumorales et le gène de CMH (complexe majeur d'histocompatibilité) pertinent pour la présentation de l'antigène. Ces cellules sont ensuite analysées pour leur capacité d'interagir avec les effecteurs T cytotoxiques. Cette reconnaissance induit l'activation du clone T qui est traduite par la sécrétion de cytokines tel que le TNF (tumor necrosis factor), dosée dans le surnageant de culture [4-5]. L'ADNc induisant une activation du clone CTL spécifique est alors séquencé. Cet ADNc code l'antigène reconnu.

La transfection de la banque d'ADNc issue des cellules tumorales s'effectue en général dans des cellules cibles qui n'expriment pas l'antigène reconnu et qui expriment l'allèle HLA pertinent pour la présentation. Ces cellules cibles peuvent correspondre soit à un variant de la cellule tumorale autologue qui a perdu l'expression de l'antigène [3], soit à des cellules COS, soit à des cellules 293-EBNA-1. L'utilisation des cellules COS ou 293-EBNA-1 est plus avantageuse car ces cellules permettent d'amplifier les plasmides transfectés et de produire, à partir des ADNc introduits dans ces plasmides, de grandes quantités de protéines. Elles nécessitent néanmoins une cotransfection avec le gène qui code l'élément de restriction du CMH (figures 2 et 3).

La dernière étape de cette approche consiste à identifier l'épitope peptidique issu de l'antigène reconnu. Plusieurs minigènes codant des parties distinctes de l'antigène sont transfectés dans les cellules cibles, permettant ainsi de localiser grossièrement la séquence qui code la région de la protéine antigénique dont l'épitope est issu. Différents peptides issus de cette région sont ensuite synthétisés. Chaque peptide est alors analysé pour sa capacité à stimuler le clone CTL-spécifique.

* Approche biochimique

Une autre méthode, fondée sur des techniques biochimiques, consiste à immunoprécipiter les molécules du CMH exprimées à la surface des cellules tumorales. Les peptides présents dans les molécules HLA sont alors décrochés par élution acide. Ils sont ensuite purifiés par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Chaque fraction de peptides est analysée pour sa capacité à activer le lymphocyte T spécifique. Les peptides qui sont capables d'induire une réponse sont alors séquencés. Cox et al. [6] ont été les premiers, grâce à cette approche, à identifier un épitope d'antigène tumoral humain, gp100, reconnu par des CTL.

* Approche immunologique inverse

Si les deux approches précédentes nécessitent d'isoler un clone T spécifique de la lignée tumorale et de déterminer l'élément de restriction HLA, l'approche immunologique inverse consiste à induire in vitro des lymphocytes T spécifiques d'une protéine dont on soupçonne qu'elle pourrait être antigénique. Les cellules présentatrices sont soit transfectées avec le gène codant la protéine candidate, soit chargées avec des peptides synthétiques déduits du motif canonique de fixation aux molécules de classe I du CMH, puis sont utilisées pour sensibiliser des cellules T in vitro. Des lymphocytes T ainsi induits reconnaissant les antigènes candidats sont ensuite analysés pour leur capacité à lyser les cellules tumorales. La mise en évidence d'une reconnaissance spécifique suggère que l'antigène d'intérêt comporte au moins un ou plusieurs peptides épitopiques [7-11]. Ainsi, après plusieurs stimulations in vitro des lymphocytes T de donneurs volontaires avec des cellules dendritiques infectées par un canarypoxvirus (Alvac) contenant la séquence complète du gène MAGE-A1, des clones CTL spécifiques de cinq nouveaux épitopes de la protéine MAGE-A1 ont pu être isolés. Ces clones CTL CD8⁺ sont capables de reconnaître les cellules tumorales exprimant le gène MAGE-A1 [10].

L'approche immunologique inverse est fondée sur l'induction des cellules effectrices in vitro par des peptides sélectionnés en fonction de leur capacité de liaison aux molécules HLA. Cependant, certains de ces peptides sélectionnés ne sont jamais présents à la surface des cellules tumorales. Cette absence de présentation semble être due à une destruction de ces épitopes par le protéasome. Ainsi l'épitope MAGE-3(271-279) n'est pas exprimé correctement par les cellules tumorales. L'inhibition du protéasome par la lactacystine rétablit la reconnaissance des lignées de mélanome MAGE-3⁺ HLA-A*0201⁺ par les lymphocytes cytotoxiques CD8⁺ [12]. L'analyse des produits de digestion in vitro de l'épitope MAGE-3(271-279) flanqué d'une séquence additionnelle courte de six acides aminés à son extrémité COOH terminale (FLWGPRALVETSYVK) par du protéasome purifié permet de définir deux sites majeurs de clivage en position 278 et 280 et non en position 279. Les acides aminés entourant les sites de clivage par le protéasome jouent un rôle prépondérant dans l'efficacité d'apprêtement des épitopes antigéniques [13].

L'identification des épitopes d'antigènes tumoraux qui sont les cibles d'une réponse cytotoxique antitumorale a permis d'envisager leur utilisation dans des protocoles de vaccination. Néanmoins, les essais cliniques effectués à ce jour n'ont pas démontré d'une façon rigoureuse l'efficacité de cette approche vaccinale. Deux hypothèses pourraient expliquer ces résultats : 1) les épitopes utilisés n'ont pas été suffisamment immunogènes pour recruter un répertoire CTL large et avide, capable de reconnaître efficacement et d'éliminer les cellules tumorales ; 2) le répertoire CTL spécifique des épitopes dominants de ces antigènes tumoraux a subi la pression de la sélection négative qui a eu comme effet l'élimination physique ou fonctionnelle des CTL à forte avidité. Il est donc essentiel d'identifier des épitopes tumoraux qui sont les meilleurs candidats pour une vaccination car ils correspondent à un répertoire CTL large et avide et de rechercher les moyens qui permettraient l'optimisation de la réponse CTL générée lors de la vaccination. Parmi ces moyens, la modification d'un ou deux acides aminés susceptibles d'optimiser l'interaction peptide-HLA et d'induire l'augmentation de l'immunogénicité du peptide sans avoir un effet sur la conformation du segment peptidique qui interagit avec le TCR et assure la spécificité antigénique.

L'approche d'immunologie inverse nécessite une présélection des peptides candidats qui ont une forte affinité pour la molécule HLA et sont immunogènes. Cette présélection ne se fait pas uniquement sur la base de la présence des résidus d'ancrage primaires spécifiques d'un HLA, mais également sur la capacité réelle des peptides à se fixer sur la molécule du CMH. En effet, 70 % des peptides ayant des résidus d'ancrage primaires appropriés ont une faible affinité pour HLA A*0201 et, inversement, des peptides sans les résidus d'ancrages primaires appropriés peuvent se fixer bien à cette même molécule. Cela est dû à la présence des résidus secondaires qui influencent l'interaction HLA-peptide [14]. Des modèles informatiques prédictifs qui tiennent compte du rôle des résidus d'ancrage primaires et secondaires ont été ainsi construits sur la base d'algorithmes et d'artificial neural networks (ANN) [15, 16]. Ces derniers modèles ont montré une spécificité assez élevée et un fort pouvoir prédictif permettant ainsi une présélection efficace de peptides candidats.

* Approche sérologique (Serex)

Une autre stratégie vient compléter les approches décrites précédemment et dédiées à la caractérisation d'antigènes tumoraux reconnus par des lymphocytes T. Pfreundschuh et al. [17] ont été les premiers à utiliser le sérum des patients atteints de certaines lésions cancéreuses pour identifier les antigènes tumoraux reconnus par des lymphocytes B. Cette approche, appelée Serex (pour serological analysis of recombinant expression libraries with autologous serum), est fondée principalement sur l'existence, chez des patients atteints de cancer, d'une réponse antitumorale de type humoral marquée par la présence dans le sérum d'un titre élevé d'anticorps spécifiques de protéines exprimées par les cellules tumorales. La technique consiste à établir une banque d'ADNc à partir de la lignée tumorale, à exprimer cette banque dans des bactéries, puis à cribler l'expression des protéines recombinantes à l'aide du sérum du patient [18]. Les antigènes tumoraux identifiés par cette technique sont soit des antigènes identifiés précédemment comme cibles des lymphocytes T, donc des antigènes impliqués à la fois dans la réponse des lymphocytes T et des lymphocytes B [19] comme la tyrosinase, MAGE-1, MAGE-3, NY-ESO-1 et SCP1 [18, 20-22], soit des antigènes reconnus uniquement par des lymphocytes B. C'est le cas de l'antigène SSX-2 [23] qui présente un profil d'expression de type MAGE (silencieux dans les tissus normaux à l'exception des testicules, et partagé par divers types histologiques de tumeurs).

L'imagerie au service de l'immunologie

L'imagerie regroupe un ensemble de méthodologies axées sur la microscopie (électronique, confocale, photonique ainsi, que la microscopie à immunofluorescence) qui ont permis de mieux appréhender les événements biochimiques, les interactions moléculaires entre le système immunitaire et le système tumoral.

Ces techniques ont permis la caractérisation de micro-domaines membranaires au sein desquels se déclenchent les cascades d'activation lymphocytaire. Ainsi, l'imagerie a permis de visualiser les interactions cellulaires en temps réel, de mettre en évidence dans les cellules vivantes l'organisation dynamique de la bicouche lipidique membranaire et d'identifier les micro-domaines protéiques qui la constituent : les radeaux lipidiques ou lipid rafts. En effet, il est actuellement possible d'apprécier la redistribution des radeaux vers le site de contact du récepteur T pour l'antigène (TCR), pour former un complexe d'activation supra-moléculaire (Smac). Ces observations ont conduit au concept de « la synapse immunologique » (figure 4), zone de contact spécialisé entre un lymphocyte T et une cellule présentatrice d'antigène qui est à l'origine de la transduction d'un signal d'activation suite à l'engagement du TCR [24]. L'observation directe des étapes séquentielles d'initiation de la signalisation lymphocytaire T (serial triggering) pourrait être la prochaine étape résultant des progrès réalisés dans le domaine de l'imagerie.

Suivi immunologique en immunothérapie

Suivre la réponse immunitaire des patients bénéficiant d'une immunothérapie s'avère essentiel pour définir des critères objectifs de choix de l'approche utilisée, déterminer l'efficacité du traitement et corréler les réponses cliniques aux réponses CTL. Ainsi, au cours des années récentes, le suivi a connu une explosion d'outils nouveaux.

La méthode Elispot

L'identification d'épitopes peptidiques dérivés d'antigènes tumoraux humains a abouti, au cours de ces dernières années, à la mise en place de multiples stratégies d'immunothérapie spécifique, en particulier dans le mélanome. L'objectif dominant de ces essais thérapeutiques de phase I-II repose sur la mise en évidence d'une réponse immune post-vaccinale spécifique de l'immunogène tumoral utilisé. Dans ce but, de nouvelles méthodes de suivi immunologique, performantes et sensibles, ont été adaptées et validées, en particulier pour la quantification des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de peptides présentés par les molécules HLA de classe I.

Parmi les méthodes de suivi des réponses immunes, en particulier antitumorale, l'Elispot constitue actuellement une méthode applicable au suivi des patients traités par immunothérapie à l'aide d'immunogènes, en particulier peptidiques [32]. Ce test reste néanmoins une méthode fonctionnelle dépendante d'une stimulation antigénique des lymphocytes et donc de leur capacité à y répondre. Les résultats obtenus par cette méthode doivent être appréciés de façon complémentaire à ceux provenant d'autres méthodes d'analyse qualitative et quantitative (immunophénotypique, fonctionnelle et moléculaire) des réponses immunes T spécifiques actuellement en cours de développement.

La méthode Elispot (enzyme-linked immunospot) est une technique fonctionnelle sensible et spécifique de détection et de quantification directe de CTL capables de former des spots de cytokine interféron gamma (IFNgamma), TNFalpha après une stimulation antigénique in vivo, comme une vaccination anti-tumorale ou in vitro [25, 26]. L'analyse par Elispot, initialement développée pour la détection d'anticorps, a été adaptée à celle des lymphocytes T stimulés sécrétant localement de fortes concentrations de cytokines comme l'IFNgamma ou le TNFalpha. Les étapes de cette technique sont les suivantes :

- les puits en membrane de nitrocellulose d'une plaque de microtitration sont recouverts d'un premier anticorps spécifique anti-cytokine, puis incubés en présence d'un sérum pour saturer les sites d'absorption non spécifiques ;

- les lymphocytes à stimuler sont déposés à différentes concentrations (en général entre 5 et 1 x 10⁵ cellules par puits) en présence de l'antigène et incubés 24 à 48 heures ;

- après lavages, un deuxième anticorps anti-cytokine biotinylé est ajouté ;

- puis un complexe de révélation avidine-phosphatase alcaline (ou peroxidase) permet, après addition de substrat, de produire les spots générés par la cytokine produite localement. Dans ces conditions, un spot formé correspond théoriquement à un lymphocyte T activé par l'antigène. Le comptage des spots s'effectue soit manuellement à l'aide d'un stéréomicroscope, soit à l'aide d'un système informatisé d'analyse d'image permettant une meilleure standardisation de la technique [27].

Les avantages principaux de cette méthode sont sa sensibilité (de l'ordre de 10^{- 4} à 10^{- 5}) et surtout la possibilité d'étudier la fréquence de CTL à partir de lymphocytes périphériques ex vivo sans étape préalable d'enrichissement par des stimulations in vitro. Son inconvénient repose sur le fait qu'il s'agit d'une méthode fonctionnelle reposant sur la capacité d'un lymphocyte T à sécréter une cytokine en réponse à une stimulation antigénique. L'ampleur de cette réponse est donc dépendante de nombreux facteurs, en particulier de la nature de la stimulation antigénique et de l'état de différenciation lymphocytaire T. L'application la plus courante et simple de l'Elispot consiste à tester la réponse à un peptide en concentration muM ajouté directement dans la suspension de cellules mononucléées. Dans ce cas, le peptide est présenté aux lymphocytes T par les cellules présentatrices autologues (CPA) contenues dans la suspension. L'alternative, qui permet également d'accroître la sensibilité du test, consiste à travailler sur des sous-populations CD8⁺ (voire CD4⁺) préalablement immunopurifiées mises en coculture avec des CPA (cellules T2 en cas de peptide HLA-A2 restreint ou cellules dendritiques autologues) chargées avec le peptide antigénique à tester. La cytokine la plus largement détectée est l'IFNgamma (ou le TNFalpha) sécrétée par les lymphocytes T différenciés selon un profil de type 1. D'autres applications ont également été validées pour la détection des lymphocytes de type 2 capables de sécréter de l'IL4. À terme, des combinaisons d'anticorps et de systèmes de révélation adaptés devraient permettre de mettre au point des tests d'Elispot plus complexes (IFNgamma et IL4 en double couleur par exemple).

Par ailleurs, l'application de l'Elispot en recherche clinique a été déterminante pour l'évaluation de la fréquence des CTL spécifiques de peptides d'antigènes tumoraux ou viraux chez des patients comparativement à des sujets sains. La réponse à des antigènes HLA-A2 restreints du mélanome, comme Melan-A/MART-1, gp100, tyrosinase, MAGE-1 et MAGE-3, a été particulièrement étudiée. Dans l'ensemble des études, il a été possible de mettre en évidence des fréquences détectables de CTL spécifiques de peptides d'antigènes de différenciation mélanocytaire comme Melan-A/MART-1 et gp100 représentant de l'ordre de 10^{- 4} à 10^{- 5} des PBMC totaux [26, 28]. En revanche, celle des LTC spécifiques d'antigènes dits C/T (pour cancer/testis antigens car ils sont exprimés uniquement par les tumeurs et les testicules) comme MAGE-3 s'est avérée fréquemment négative ou très faible de l'ordre de 10^{- 6} [29, 30]. En outre, chez certains patients porteurs de cancers avancés (stade IV), la méthode Elispot a permis de montrer que la réponse à des peptides d'antigènes viraux communs comme influenza était significativement plus faible que celle de sujets sains, suggérant une immunosuppression des fonctions lymphocytaires T [31]. Ce type de données a depuis été confirmé par d'autres méthodes de quantification directe des LTC, en particulier par immunomarquage à l'aide de complexes CMH-peptide tétramériques solubles et quantification en cytométrie de flux.

Utilisation des tétramères et de l'immunoscope pour la caractérisation et le suivi de réponses lymphocytaires T spécifiques

La présence de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'antigènes tumoraux chez des patients atteints de cancer a clairement été authentifiée ces dernières années. Ainsi un certain nombre d'antigènes tumoraux ont pu être identifiés et les épitopes précis reconnus constituent autant de cibles potentielles utilisables en immunothérapie dans des protocoles de vaccination antitumorale. Ces nouvelles stratégies d'immuno-intervention dans le traitement du cancer nécessitent le développement de méthodes fiables et reproductibles afin d'identifier et de mieux connaître les réponses lymphocytaires T spécifiques de tumeurs et de pouvoir suivre leur devenir lors des protocoles de vaccination. Cependant, les méthodes classiques d'analyse en dilution limite (LDA) et les méthodes plus récentes d'énumération des cellules capables de synthétiser une cytokine donnée (marquage intracellulaire, Elispot), ne permettent d'étudier que les cellules possédant un potentiel prolifératif ou fonctionnel particulier au moment de l'analyse, négligeant ainsi les cellules incapables de proliférer, non fonctionnelles (anergiques) ou présentant d'autres types de fonctions. Deux nouvelles méthodes permettent en revanche actuellement l'analyse de l'ensemble des lymphocytes T impliqués lors de réponses lymphocytaires T. Il s'agit, d'une part de l'étude des récepteurs T pour l'antigène (TCR) par la technique de l'immunoscope [33], et d'autre part de la visualisation directe des cellules T spécifiques à l'aide de réactifs fluorescents spécifiques que sont les tétramères (figure 5).

* Analyse des récepteurs T pour l'antigène (TCR) exprimé par des populations lymphocytaires T par la technique d'immunoscope

Chaque lymphocyte T présente à sa surface un récepteur unique pour l'antigène (TCR) qui lui confère sa spécificité à travers la capacité de reconnaissance d'un complexe MHC-peptide donné. Chaque TCR est constitué de deux chaînes, elles-mêmes résultat de la juxtaposition particulière de segments de gènes (Vbeta, Dbeta et Jbeta pour la chaîne beta par exemple) qui constitue une région hypervariable (région CDR3) responsable de la spécificité fine du récepteur. Cette région CDR3, qui varie en taille de 8 à 9 acides aminés chez l'homme, constitue la signature du récepteur d'une cellule T donnée. La technique d'immunoscope a révolutionné, par sa flexibilité, les différentes méthodes visant à analyser la nature des TCR exprimés par des populations polyclonales. Elle consiste à analyser des ADNc issus de populations lymphocytaires T par amplification spécifique des différentes familles de segments Vbeta suivie d'une réaction d'extension à l'aide de sondes fluorescentes à travers la région CDR3. Les produits amplifiés, représentatifs de l'ensemble de la diversité de la région CDR3 présente dans l'échantillon, sont ensuite visualisés sur un séquenceur automatique et analysés par un logiciel adapté [33]. Cette méthode a permis ces dernières années de mieux caractériser, à la fois chez l'homme et chez la souris, le répertoire normal ou celui mis en jeu lors de réponses lymphocytaires T dirigées contre des antigènes précis [33]. Ainsi, en pathologie tumorale chez l'homme, cette technique a permis de montrer que les infiltrats lymphocytaires tumoraux étaient constitués in vivo d'expansions de nature oligoclonale (c'est-à-dire exprimant un nombre restreint de TCR distincts) avec dans certains cas la présence de clones largement prédominants [34]. L'immunoscope permet en effet d'identifier un clone prédominant au sein d'une population polyclonale lorsque celui-ci est représenté par au moins 1 000 exemplaires au sein de 10⁶ cellules. La mise en place récente de l'immunoscope de deuxième génération, ou immunoscope II, permet d'accéder aux séquences présentes au sein d'une taille de région CDR3 donnée.

Cependant, malgré sa puissance analytique, l'immunoscope ne permet pas de définir la part des réponses spécifiques d'antigènes tumoraux au sein de populations par ailleurs polyclonales, ni de préciser la nature des antigènes reconnus par les réponses oligoclonales éventuellement identifiées. L'utilisation des tétramères, qui permet l'étude de réponses dirigées contre des antigènes précis, apporte des réponses à ces questions.

* Visualisation directe des cellules T spécifiques d'un antigène donné à l'aide de tétramères

Le TCR permet aux lymphocytes T de reconnaître l'antigène présenté sous forme peptidique par les molécules du CMH des cellules présentatrices. Ainsi, l'utilisation d'un complexe MHC-peptide donné sous forme soluble devrait permettre de repérer l'ensemble des lymphocytes T qui lui sont spécifiques. En fait, du fait de la faible avidité des TCR pour leur ligand, les complexes MHC-peptides sous forme monomérique ne se fixent pas sur les lymphocytes T. Récemment, Altman et al. [35] ont résolu ce problème en utilisant des formes tétramériques de complexes CMH-peptides, obtenues après biotinylation et fixation sur avidine, qui, en augmentant l'avidité du système, permettent la visualisation directe par cytométrie de flux des lymphocytes T spécifiques. Les tétramères permettent ainsi d'identifier ex vivo et sans manipulation in vitro l'ensemble des lymphocytes T spécifiques d'un complexe MHC-peptide donné au sein des lymphocytes circulants sans préjuger des TCR qu'ils expriment. Ces réactifs ont été largement utilisés ces dernières années dans différents systèmes pour suivre l'évolution de réponses immunitaires dirigées contre des agents infectieux viraux (cytomégalovirus, virus de l'immunodéficience humaine, virus d'Epstein-Barr) ou bactériens (Listeria) ainsi que contre des antigènes tumoraux. Ainsi, par exemple, le groupe de J.-C. Cerottini et P. Romero à Lausanne [36] les a utilisés pour démontrer et caractériser l'existence de réponses dirigées contre l'antigène MelanA/Mart1 dans le sang périphérique ou les ganglions métastatiques de patients atteints de mélanome. L'utilisation des tétramères peut aussi être couplée à une analyse phénotypique multiparamétrique en cytométrie de flux ainsi qu'à une analyse fonctionnelle par la détection de cytokines intracellulaires. De plus, les cellules tétramères positives peuvent être triées et testées par Elispot ou pour leurs capacités cytotoxiques ex vivo. Ainsi, M. Davis et al. [37] ont pu montrer que, chez certains patients atteints de mélanome, les lymphocytes T circulants spécifiques des antigènes étudiés présentaient le phénotype de cellules non fonctionnelles ou anergiques. L'utilisation récente de monomères MHC de classe I mutés, ayant une capacité réduite de fixer la molécule CD8, couplés à des billes magnétiques, a encore amélioré la sensibilité de détection et facilité le tri [38]. Enfin, la possibilité récente de pouvoir utiliser les tétramères in situ sur des coupes tissulaires offre des perspectives tout à fait passionnantes en pathologie tumorale pour suivre topographiquement les lymphocytes T spécifiques et étudier leur relation avec les cellules tumorales [39].

* Intérêt de l'utilisation conjointe des technologies des tétramères et de l'immunoscope dans le cadre d'une station d'immunoscopie avancée

Finalement, l'utilisation conjointe des tétramères et de l'immunoscope pourrait augmenter encore grandement le potentiel de ses approches. Ainsi, une station d'immunoscopie avancée permettra l'étude et le suivi clinique des réponses lymphocytaires T chez l'homme. Celle-ci regroupe les immunoscopes I et II, qui s'articulent avec la technologie de purification des cellules T à l'aide des tétramères, la technologie de PCR quantitative de type TaqMan et le séquençage automatique. Le répertoire des lymphocytes T spécifiques triés à l'aide de billes multimères CMH-peptide est analysé par PCR quantitative et immunoscope. Les séquences des régions CDR3 d'éventuels clones prédominants peuvent être identifiées par immunoscope II et permettre l'élaboration de sondes clonotypiques, c'est-à-dire spécifiques d'une région CDR3 donnée (figure 6). L'utilisation de telles sondes clonotypiques augmente grandement la sensibilité de la méthode en permettant la détection d'une cellule parmi 10⁵. Il est alors possible de suivre et de quantifier par PCR quantitative la présence de ces clones dans des sous-populations particulières (cellules mémoires CD45RO⁺ par exemple) ainsi que de manière prospective mais aussi rétrospective dans les échantillons issus de patients cancéreux. La sensibilité et la précision de cette approche ont déjà été validées sur le plan expérimental et s'avèrent extrêmement prometteuses pour le suivi immunologique détaillé de patients traités par divers protocoles d'immunothérapie.

CONCLUSION

REFERENCES

1. Robbins PF, Kawakami Y. Human tumor antigens recognized by T cells. Curr Opin Immunol 1996 ; 8 : 628-36.

2. Rosenberg SA. A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigens. Immunity 1999 ; 10 : 281-7.

3. Van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, Van den Eynde B, et al. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 1991 ; 254 : 1643-7.

4. Van den Eynde B, Lethe B, Van Pel A, De Plaen E, Boon T. The gene coding for a major tumor rejection antigen of tumor P815 is identical to the normal gene of syngeneic DBA/2 mice. J Exp Med 1991 ; 173 : 1373-84.

5. De Plaen E, Lurquin C, Lethe B, van der Bruggen P, Brichard V, Renauld JC, et al. Identification of genes coding for tumor antigens recognized by cytolytic T lymphocytes. Methods 1997 ; 12 : 125-42.

6. Cox AL, Skipper J, Chen Y, Henderson RA, Darrow TL, Shabanowitz J, et al. Identification of a peptide recognized by five melanoma-specific human cytotoxic T cell lines. Science 1994 ; 264 : 716-9.

7. Celis E, Tsai V, Crimi C, DeMars R, Wentworth PA, Chesnut RW, et al. Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes. Proc Natl Acad Sci USA 1994 ; 91 : 2105-9.

8. Van der Bruggen P, Bastin J, Gajewski T, Coulie PG, Boel P, De Smet C, et al. A peptide encoded by human gene MAGE-3 and presented by HLA-A2 induces cytolytic T lymphocytes that recognize tumor cells expressing MAGE-3. Eur J Immunol 1994 ; 24 : 3038-43.

9. Herman J, van der Bruggen P, Luescher IF, Mandruzzato S, Romero P, Thonnard J, et al. A peptide encoded by the human MAGE3 gene and presented by HLA-B44 induces cytolytic T lymphocytes that recognize tumor cells expressing MAGE3. Immunogenetics 1996 ; 43 : 377-83.

10. Chaux P, Luiten R, Demotte N, Vantomme V, Stroobant V, Traversari C, et al. Identification of five MAGE-A1 epitopes recognized by cytolytic T lymphocytes obtained by in vitro stimulation with dendritic cells transduced with MAGE-A1. J Immunol 1999 ; 163 : 2928-36.

11. Manici S, Sturniolo T, Imro M, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, et al. Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11. J Exp Med 1999 ; 189 : 871-6.

12. Valmori D, Gileadi U, Servis C, Dunbar PR, Cerottini JC, Romero P, et al. Modulation of proteasomal activity required for the generation of a cytotoxic T lymphocyte-defined peptide derived from the tumor antigen MAGE-3. J Exp Med 1999 ; 189 : 895-906.

13. Miconnet I, Servis C, Cerottini JC, Romero P, Levy F. Amino acid identity and/or position determines the proteasomal cleavage of the HLA-A*0201-restricted peptide tumor antigen MAGE-3271-279. J Biol Chem 2000 ; 275 : 26892-7.

14. Ruppert J, Sidney J, Celis E, Kubo R, Grey HM, Sette A. Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A* 0201 molecules. Cell 1993 ; 74 : 929-37.

15. Parker KC, Bednarek MA, Coligan JE. Scheme for ranking potential HLA A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side chains. J Immunol 1994 ; 152 : 163-75.

16. Gulukota K, Sidney J, Sette A, DeLisi C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules. J Mol Biol 1997 ; 267 : 1258-67.

17. Pfreundschuh M, Shiku H, Takahashi T, Ueda R, Ransohoff J, Oettgen HF, et al. Serological analysis of cell surface antigens of malignant human brain tumors. Proc Natl Acad Sci USA 1978 ; 75 : 5122-6.

18. Sahin U, Tureci O, Schmitt H, Cochlovius B, Johannes T, Schmits R, et al. Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host. Proc Natl Acad Sci USA 1995 ; 92 : 11810-3.

19. Jager E, Chen YT, Drijfhout JW, Karbach J, Ringhoffer M, Jager D, et al. Simultaneous humoral and cellular immune response against cancer-testis antigen NY-ESO-1 : definition of human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-A2-binding peptide epitopes. J Exp Med 1998 ; 187 : 265-70.

20. Stockert E, Jager E, Chen YT, Scanlan MJ, Gout I, Karbach J, et al. A survey of the humoral immune response of cancer patients to a panel of human tumor antigens. J Exp Med 1998 ; 187 : 1349-54.

21. Chen YT, Scanlan MJ, Sahin U, Tureci O, Gure AO, Tsang S, et al. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening. Proc Natl Acad Sci USA 1997 ; 94 : 1914-8.

22. Tureci O, Sahin U, Zwick C, Koslowski M, Seitz G, Pfreundschuh M. Identification of a meiosis-specific protein as a member of the class of cancer/testis antigens. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 95 : 5211-6.

23. Tureci O, Sahin U, Schobert I, Koslowski M, Scmitt H, Schild HJ, et al. The SSX-2 gene, which is involved in the t(X;18) translocation of synovial sarcomas, codes for the human tumor antigen HOM-MEL-40. Cancer Res 1996 ; 56 : 4766-72.

24. Grakoui A, Bromley SK, Sumen C, Davis MM, Shaw AS, Allen PM, et al. The immunological synapse : a molecular machine controlling T cell activation. Science 1999 ; 285 : 221-7.

25. Herr W, Schneider J, Lohse AW, Meyer Zum Büschenfelde KH, Wölfel T. Detection and quantification of blood-derived CD8⁺ T lymphocytes secreting tumor necrosis factor alpha in response to HLA- A2.1-binding melanoma and viral peptide antigens. J Immunol Methods 1996 ; 191 : 131-42.

26. Scheibenbogen C, Lee KH, Stevanovic S, Witzens M, Willhauck M, Waldmann V, et al. Analysis of the T cell response to tumor and viral peptide antigens by an IFNgamma-Elispot assay. Int J Cancer 1997 ; 71 : 932-6.

27. Herr W, Linn B, Leister N, Wandel E, Meyer zum Buschenfelde KH, Wolfel T. The use of computer-assisted video image analysis for the quantification of CD8⁺ T lymphocytes producing tumor necrosis factor alpha spots in response to peptide antigens. J Immunol Methods 1997 ; 203 : 141-52.

28. Pittet MJ, Valmori D, Dunbar PR, Speiser DE, Lienard D, Lejeune F, et al. High frequencies of naive Melan-A/MART-1-specific CD8(+) T cells in a large proportion of human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-A2 individuals. J Exp Med 1999 ; 190 : 705-15.

29. Dunbar PR, Ogg GS, Chen J, Rust N, van der Bruggen P, Cerundolo V. Direct isolation, phenotyping and cloning of low-frequency antigen-specific cytotoxic T lymphocytes from peripheral blood. Curr Biol 1998 ; 8 : 413-6.

30. Chaux P, Vantomme V, Coulie P, Boon T, van der Bruggen P. Estimation of the frequencies of anti-MAGE-3 cytolytic T-lymphocyte precursors in blood from individuals without cancer. Int J Cancer 1998 ; 77 : 538-42.

31. Scheibenbogen C, Lee KH, Mayer S, Stevanovic S, Moebius U, Herr W, et al. A sensitive Elispot assay for detection of CD8⁺ T lymphocytes specific for HLA class I-binding peptide epitopes derived from influenza proteins in the blood of healthy donors and melanoma patients. Clin Cancer Res 1997 ; 3 : 221-6.

32. Scheibenbogen C, Romero P, Rivoltini L, Herr W, Schmittel A, Cerottini J, et al. Quantitation of antigen-reactive T cells in peripheral blood by IFNgamma-Elispot assay and chromium-release assay : a four-centre comparative trial. J Immunol Methods 2000 ; 244 : 81-9.

33. Pannetier C, Even J, Kourilsky P. T-cell repertoire diversity and clonal expansions in normal and clinical samples. Immunol Today 1995 ; 16 : 176-81.

34. Puisieux I, Even J, Pannetier C, Jotereau F, Favrot M, Kourilsky P. Oligoclonality of tumor-infiltrating lymphocytes from human melanoma. J Immunol 1994 ; 153 : 2807-18.

35. Altman JD, Moss P, Goulder P, Barouch DH, McHeyzer WM, Bell JI, et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 1996 ; 274 : 94-6.

36. Romero P, Dunbar PR, Valmori D, Pittet M, Ogg GS, Rimoldi D, et al. Ex vivo staining of metastatic lymph node by class I major histocompatibility complex tetramers reveals high numbers of antigen-experienced tumor-specific cytolytic lymphocytes. J Exp Med 1998 ; 188 : 1641-50.

37. Lee P, Yee C, Savage PA, Fong L, Brockstedt D, Weber JS, et al. Characterization of circulating T cells specific for tumor-associated antigens in melanoma patients. Nature Med 1999 ; 5 : 677-85.

38. Bodinier M, Peyrat MA, Tournay C, Davodeau F, Romagne F, Bonneville M, et al. Efficient detection and immunomagnetic sorting of specific T cells using multimers of MHC class I and peptide with reduced CD8 binding. Nature Med 2000 ; 6 : 707-10.

39. Haanen JBA, van Oijen MG, Tirion F, Oomen L, Kruisbeek AM, Vyth-Dreese FA, et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nature Med 2000 ; 6 : 1056-60.