ARTICLE
L'information génétique de l'espèce humaine, le
génome, est codée par 46 molécules
d'ADN contenues dans chaque noyau cellulaire. Associé à
de l'ARN et des protéines, organisées en sous-ensembles
de chromatine, cet ADN forme les chromosomes qui maintiennent leur unité
tout au long du cycle cellulaire, à travers des modifications morphologiques
et fonctionnelles considérables. C'est ainsi que le classique chromosome
métaphasique avec ses deux chromatides se réorganise en
domaine chromosomique pendant l'interphase, tout en conservant son organisation
générale comme le montrent des résultats récents
de biologie cellulaire.
L'hypothèse de Boveri, selon laquelle le cancer serait une maladie
génétique (chromosomique) de la cellule, a été
abondamment démontrée au cours des vingt dernières
années. La grande majorité des tumeurs présente des
anomalies génomiques de toute nature, souvent multiples, acquises
car observées uniquement dans les cellules tumorales, et en général
monoclonales. En effet, la survenue d'une anomalie dans une cellule unique
d'où dérivera toute la population maligne est l'explication
la plus simple à la présence de cette anomalie dans toutes
les cellules d'une tumeur donnée. La complexité souvent
observée, en particulier dans les carcinomes, est due à
la récurrence du processus qui donne naissance à un foisonnement
de sous-clones.
De nombreuses translocations chromosomiques, souvent spécifiques
d'un type de prolifération, ont été individualisées.
Dans un premier groupe, représenté dans la pathologie lymphoïde
[1], il s'agit de gènes qui expriment une protéine intacte
mais qui sont dérégulés par une fusion avec un membre
de la super-famille des immunoglobulines. La t(8;14)(q24;q32), typique
du lymphome de Burkitt, en est le prototype : MYC, oncogène localisé
en 8q24, prend la place de la partie variable du gène des chaînes
lourdes des immunoglobulines en 14q32, subissant ainsi une dérégulation
pathologique. Ce remaniement a permis de démontrer le rôle
essentiel des translocations dans la tumorigenèse [2]. Ces translocations
ont aussi été à l'origine de la découverte
de gènes majeurs pour la destinée cellulaire, tel BCL2,
inhibiteur d'apoptose isolé à partir de la t(14;18), spécifique
des lymphomes non hodgkiniens d'origine centro-folliculaire.
Dans un second groupe, observé dans d'autres hémopathies
malignes, mais aussi dans des sarcomes [3-5], les translocations chromosomiques
induisent la création d'un nouveau gène formé par
la juxtaposition de séquences des deux gènes impliqués
dans le remaniement. Du fait de la structure découpée en
exons des gènes eucaryotes, le résultat est un gène
de fusion, transcrit puis traduit en une protéine chimérique
spécifique des cellules malignes. Un exemple classique est celui
de la leucémie myéloïde chronique où la t(9;22)(q34;q11),
formant le chromosome Philadelphie (Ph), entraîne la fusion entre
les gènes BCR et ABL. Le gène résultant BCR-ABL code,
selon le point de cassure, pour une des trois protéines de fusion
p190, p210 ou, plus rarement, p230. Ces protéines sont des tyrosine
kinases ayant de très fortes activités de phosphorylation
constitutives, alors que la protéine p145 ABL normale est une tyrosine
kinase spontanément peu ou pas active [6]. On conçoit aisément
l'ampleur des perturbations induites dans la fine homéostasie de
la prolifération cellulaire. La récente démonstration
de l'efficacité thérapeutique d'un inhibiteur spécifique
de la tyrosine kinase BCR-ABL, le STI571, apporte une preuve éclatante
du rôle que jouent ces remaniements génomiques dans la carcinogenèse
[7]. Les malades traités par STI571 sont mis en rémission
clinique et cytogénétique, car les cellules ayant la translocation
s'orientent vers l'apoptose. Un autre exemple, celui des leucémies
M3 à promyélocytes, caractérisées par une
translocation t(15;17) entraînant la fusion des gènes PML
et RARA, mises en rémission par l'acide rétinoïque
[8], est là pour nous démontrer la validité de ce
concept de thérapeutique ciblée sur des oncogènes.
De nombreux gènes essentiels ont été découverts
par leur implication dans ces translocations ou d'autres remaniements
chromosomiques (inversions, délétions, duplications, etc.)
visibles à l'échelle microscopique. Il existe des remaniements
chromosomiques infracytogénétiques, trop petits pour être
visibles, comme par exemple les duplications d'une partie du gène
MLL observées dans des leucémies secondaires à une
chimiothérapie par les inhibiteurs de la topo-isomérase
II, ou du gène FLT3 dans d'autres hémopathies [9]. D'autres
méthodes d'investigation sont alors nécessaires. Des anomalies
quantitatives peuvent être observées dans les hémopathies
tant myéloïdes que lymphoïdes : trisomie 8, pertes du
5 et/ou du 7, hyperdiploïdie, etc. Elles s'additionnent souvent à
des remaniements préexistants, témoignant ainsi de la multiplication
des réarrangements génomiques au cours de la progression
de la maladie.
Dans les tumeurs solides mésenchymateuses [3] et neuroectodermiques,
le schéma d'ensemble reste assez similaire à celui des hémopathies
: translocation donnant naissance à une protéine de fusion,
remaniements additionnels quantitatifs. Il s'y rajoute un autre type de
remaniement, les amplifications de gènes (plus de 5 copies par
génome haploïde). Elles se font par la multiplication de chromosomes
acentriques (sans centromères) minuscules appelés «
doubles-minutes » dont le nombre varie considérablement d'une
cellule à l'autre. Les amplifications peuvent aussi prendre la
forme d'HSR (homogeneously staining region), régions de
coloration homogène faites de duplications de la séquence
amplifiée mais intégrées en bloc dans un ou des chromosomes
anormaux. Les amplifications peuvent impliquer toute une série
d'oncogènes, dont la séquence ne semble pas altérée,
mais aussi des gènes de fusions comme dans certains rhabdomyosarcomes
alvéolaires avec translocation t(1;13) [10]. Ce dernier point est
une autre démonstration de la transformation en oncogènes
de gènes anodins au cours d'une fusion avec un partenaire ad
hoc.
Les tumeurs solides non mésenchymateuses, en particulier les
carcinomes, ont fréquemment des réarrangements
extensifs, y compris des translocations souvent déséquilibrées,
mais il semble que les translocations générant des gènes
de fusion soient rares. La question reste cependant ouverte car, dans
les tumeurs papillaires de la thyroïde, des gènes de fusion
impliquant RET ou TRK sont observés [11].
En revanche, les anomalies quantitatives de matériel génétique
sont la règle. Les pertes de segments chromosomiques de tailles
très diverses sont fréquentes. Les mécanismes mis
en jeu sont très variés, monosomie, délétion,
translocation non équilibrée, perte d'hétérozygotie
ou même perte de fonction par mutation ponctuelle. On considère
actuellement qu'elles correspondent à la perte de gènes
suppresseurs de tumeur, dont le modèle est le gène RB [12].
Les gains de matériel génétique, sur-représentations
totales ou partielles, sont encore plus fréquents, mais sont bien
moins connus au niveau moléculaire [13, 14]. Ils entraînent
une surexpression de la protéine impliquée (ou effet de
dose). Par exemple, l'oncogène MET est sur-représenté
dans les tumeurs papillaires du rein sporadiques à l'occasion de
la trisomie 7 [15]. Les amplifications [16] sont-elles une dérive
extrême de cette catégorie d'anomalie ?
La génomique est l'ensemble des moyens d'étude qui contribuent
à explorer globalement le génome dans ses différents
aspects : ADN, ARN et même protéines. Nous nous bornerons
à l'étude de l'ADN qui est stable. Avant de décrire
les nouvelles approches en développement, rappelons qu'il existe
déjà un moyen global d'exploration du génome, en
l'absence de toute orientation diagnostique, la cytogénétique.
Les cellules tumorales sont mises en culture en suspension ou en mono-couche.
Par des traitements adaptés des préparations de métaphases,
on fait apparaître sur les chromosomes de 300 à 600 bandes,
soit de type R (riches en gènes et en séquences GC, de synthèse
précoce), soit de type G (riches en AT mais plus pauvres en gènes
et de synthèse tardive). La nomenclature des bandes et la description
des anomalies font l'objet d'une convention internationale [17]. Puis
le caryotype, classement et appariement des chromosomes selon leur taille
et la disposition de leurs bandes, est effectué, métaphase
par métaphase. On considère qu'une vingtaine de cellules
analysées est le chiffre optimum pour l'échantillonnage
d'une prolifération maligne. Il faut trois mitoses avec la même
anomalie pour qu'une perte soit considérée comme significative,
deux mitoses pour les autres anomalies.
Le génome haploïde humain est estimé à 3 000
mégabases (Mb), une bande chromosomique moyenne correspond donc
à une dizaine de Mb. Si, à première vue, cette résolution
exclut la détection d'anomalies géniques, la mise en évidence
de translocations accompagnées de remaniements spécifiques
entre des gènes a montré que l'approche morphologique était
un outil puissant pour orienter la recherche et le clonage de gènes
impliqués dans les tumeurs. Cependant, l'analyse caryotypique classique
reste dépendante de l'obtention de cellules en métaphases.
L'émergence, depuis dix ans, de la cytogénétique
moléculaire, dont les principales méthodes sont l'hybridation
in situ fluorescente (Fish), la synthèse in situ
amorcée (Prins) et l'hybridation génomique comparative (CGH),
éventuellement associées à des techniques d'étirement
(peignage) d'ADN et à la microdissection chromosomique, a considérablement
élargi le domaine d'investigation de la cytogénétique.
La disposition de ces nouveaux outils qui permettent des analyses in
situ d'une résolution élevée jointe aux concepts
et méthodes d'approche classiques de la cytogénétique,
essentiellement structuraux, laisse entrevoir une métamorphose
en cytogénomique. L'association avec l'immunohistochimie débute
et permettra de coupler génotype moléculaire et phénotype
cellulaire in situ. Ces investigations peuvent être conduites
tant sur métaphases que sur noyaux interphasiques, et certaines
d'entre elles permettent de s'affranchir totalement des cultures comme
l'hybridation sur fibres étirées d'ADN (halo, peignage),
qui a une résolution de 1 à 3 kb.
La CGH permet de quantifier l'ADN en tout point du génome. Décrite
par Kallionemi et al. [18], son principe est simple. De l'ADN tumoral
purifié est marqué par des nucléotides portant un
haptène ou, mieux, un fluorochrome émettant dans le vert
(par exemple, la fluorescéine). De l'ADN témoin, provenant
d'un sujet normal, sera marqué dans les mêmes conditions
par un fluorochrome émettant, lui, dans le rouge. Le choix des
couleurs est arbitraire et peut être inversé. Un mélange
équimoléculaire de ces deux ADN est hybridé sur une
préparation de chromosomes humains issue d'un individu normal,
eux-mêmes dénaturés selon les procédures de
la Fish. Les séquences répétées seront saturées
par de l'ADN compétiteur et n'interviendront pas dans la réaction.
En revanche, les séquences uniques des chromosomes seront la cible
de l'ADN tumoral et de l'ADN témoin, et, compte tenu de la fragmentation
de la sonde (600-800 bases en moyenne), chaque segment de chromosome sera
hybridé proportionnellement à la concentration de sondes
spécifiques de ce segment dans l'ADN tumoral et l'ADN témoin.
Après lavage et coloration au DAPI pour générer des
bandes permettant l'identification des chromosomes, on observe au microscope
à fluorescence équipé de filtres adéquats
et d'un système d'imagerie numérisée. Un chromosome
normal apparaîtra ainsi en ocre, un chromosome, ou segment de chromosome,
manquant dans la tumeur sera rouge, un chromosome excédentaire
sera vert. L'amplification d'une région chromosomique sera indiquée
par une intense coloration verte. La quantification s'effectue sur le
calcul, pris en charge par le logiciel d'analyse, du rapport entre fluorescences
verte et rouge tout le long de chaque chromosome, ce qui se traduit par
la fluctuation d'une courbe autour d'une valeur moyenne vert/rouge = 1.
Les déviations de cette courbe dessinent, pour chaque mitose analysée,
un profil reflétant les gains et les pertes de segments chromosomiques.
On augmente la puissance de l'analyse en sommant les résultats
provenant d'un minimum de 10 mitoses. Il en résulte l'obtention
de profils caractéristiques des déséquilibres chromosomiques
présents dans la tumeur étudiée. Les déséquilibres
détectés peuvent être vérifiés en cas
de doute par Fish interphasique.
Cette technique est très puissante et elle a permis de caractériser
des anomalies quantitatives, notamment des gains et amplifications dans
des tumeurs quasiment exclues de la cytogénétique morphologique
en raison de l'absence de mitose ou de la complexité des caryotypes
[19-23]. La CGH a cependant des limitations. Elle ne détecte pas
les translocations équilibrées et leurs équivalents,
pas plus que les variations globales de ploïdie (triploïdie,
tétraploïdie) du fait même de son principe [24]. La
t(11;22) d'une tumeur d'Ewing ne sera pas détectée mais,
en revanche, des anomalies additionnelles le seront. Heureusement, les
tumeurs solides semblent avoir une abondance de remaniements quantitatifs.
Paradoxalement, la CGH simplifie grandement l'interprétation des
anomalies par sa présentation standardisée. Par ailleurs,
la CGH est sensible à la présence de cellules normales dans
l'échantillon analysé, qui auront un effet de dilution de
l'ADN tumoral. On peut enrichir le matériel analysé par
des microdissections suivies de DOP PCR, en sachant les risques d'hyper-interprétation
inhérente à l'extrême amplification d'un échantillon
très restreint. L'ADN tumoral peut être préparé
à partir de matériel frais, congelé, et même
de coupes en paraffine, mais la fixation introduit là aussi un
biais possible.
La résolution est un facteur limitant de la technique sur chromosomes.
Ne sont détectables que les pertes ou les gains de quelques mégabases
ainsi que des amplifications de 100 kb [25]. Inversement, les chromosomes
sont des « micropuces » naturelles avec un très haut
niveau d'intégration, que nous sommes incapables d'exploiter dans
leur intégralité, et couvrant la totalité du génome.
Le développement actuel des micromatrices d'ADN a permis de démontrer
l'efficacité de la CGH sur ce support [26, 27]. Des bac (bacterial
artificial chromosomes) de 100 kb environ sont déposés
en spots homogènes. Cette cible remplace les chromosomes et ce
concept permet d'envisager à court terme un pas de 1 Mb le long
de l'ensemble des chromosomes, et à moyen terme un pas de 100 kb,
c'est-à-dire une couverture complète. Cette technique a
déjà permis de séparer différentes zones dans
un amplicon [28] et elle est en plein développement. Elle ouvre
une voie majeure dans l'établissement de la carte d'identité
génétique des tumeurs [29].
Les anomalies génomiques connues ne sont que la partie émergée
de l'iceberg, car de nombreux petits remaniements passent inaperçus.
Cependant, des classifications, des pronostics et des choix thérapeutiques
majeurs sont effectués quotidiennement en fonction d'altérations
du génome de cellules malignes. Au-delà des leucémies
et lymphomes, le caryotype ou, selon un terme actuel, la carte d'identité
des tumeurs, est essentiel aujourd'hui pour la prise en charge des sarcomes
et des neuroblastomes, demain pour celle des tumeurs de prostate, vessie,
rein, etc. La thérapeutique ciblée émerge à
peine mais l'action de l'acide rétinoïque sur son récepteur
altéré par la t(15;17), celle du STI 571, inhibiteur spécifique
de la tyrosine kinase chimérique BCR-ABL, celle enfin des anti-HER2
humanisés dans les cancers du sein amplifiant le gène HER2/neu,
montrent la possibilité réelle d'agir de façon ciblée
sur les dysrégulations génétiques des cellules cancéreuses.
Nombreuses et complexes dans les tumeurs solides, variant d'une cellule
à l'autre, les altérations du génome doivent faire
l'objet d'un inventaire le plus exhaustif possible, prélude indispensable
à l'approche physiopathologique rationnelle des futures thérapeutiques
adaptées à chaque malade.
CONCLUSION
Dans cette perspective, le Groupe français de cytogénétique
oncologique et le Bulletin du Cancer ont pris l'initiative de publier
une série d'articles sur les données cytogénétiques
connues de différents types de cancer. Destinés essentiellement
aux cliniciens et aux biologistes, ils n'ont pas pour vocation d'être
une revue exhaustive, mais de faire le point sur l'état actuel
de la cytogénétique et, au-delà, de la cytogénomique
dans ces pathologies. L'essentiel, sous une forme un peu différente,
sera repris en langue anglaise sur le site internet du GFCO, l'Atlas
de génétique et de cytogénétique en oncologie
et hématologie [9].
Remerciements. L'auteur remercie vivement les docteurs J. Bosq
(IGR, Villejuif) et J. Couturier (Institut Curie, Paris) pour l'attention
critique et constructive qu'ils ont bien voulu porter à ce manuscrit.
Article reçu le 30 juillet 2001, accepté le 7 novembre
2001.
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