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ARTICLE

vir.2012.0432

Auteur(s) : Angélique Campocasso¹, Bernard La Scola^1,2 bernard.lascola@univmed.fr

¹ Université Aix-Marseille, faculté de médecine, URMITE UMR CNRS-IRD 6236, IFR48, Marseille, France

² Assistance publique-Hôpitaux de Marseille, pôle des maladies infectieuses, rue Saint-Pierre, 13005 Marseille, France

Tirés à part : B. La Scola

Introduction et historique

Au cours de l’investigation d’une épidémie de pneumonie en 1992 en Angleterre, la flore microbienne d’une tour aéroréfrigérante de Bradford a été analysée à la recherche de légionelles par co-culture avec des amibes. Lors de cette étude, un microorganisme de type coque Gram positif à croissance intra-amibienne stricte a été isolé (figure 1A). Les tentatives d’identification par amplification du gène de l’ARN 16S ribosomique sont restées sans succès et c’est une analyse en microscopie électronique de cette particule au sein de l’amibe Acanthamoeba polyphaga qui permettra d’observer une structure virale caractéristique. En effet, ce microorganisme possède une capside icosaédrique, non enveloppée, avec des particules matures d’une taille de 400 nm (figure 1B). Cette taille est à rapprocher de celles de certaines petites bactéries et explique qu’il ne soit pas filtrable sur des membranes de 0,2 μm de porosité comme la plupart des virus. La particule montre aussi la présence de fibrilles d’environ 150 nm à la surface de la capside (figure 1B). Le virus est alors nommé A. polyphaga Mimivirus, Mimivirus pour mimicking microbe en référence à son aspect de bactérie à la coloration de Gram (figure 1A) [1]. Sa capacité à se répliquer dans les amibes et donc à résister à la destruction par le phagosome ainsi que les conditions de son primo-isolement ont fait suspecter son rôle comme pathogène humain, notamment dans des cas de pneumonies, selon un modèle comparable à celui de Legionella pneumophila [2, 3].

L’analyse du cycle de réplication de ce microorganisme a corroboré les observations préliminaires avec une multiplication typique des virus comprenant une phase d’éclipse [4]. De plus, Mimivirus montre un type de multiplication peu fréquent, puisqu’il forme une usine à virus dans le cytoplasme des amibes pour produire ses virions.

Le séquençage complet de son génome montre que son ADN est de type double brin et d’une taille d’environ 1,2 Mb, ce qui est plus grand que pour certaines bactéries [5]. Par l’analyse de gènes conservés, ce virus a été classé dans la famille des nucleocytoplasmic DNA viruses (NCLDV) mais représente une classe à part, distincte des Iridoviridae, Asfarviridae, Poxviridae et Phycodnaviridae [1].

À la suite de cette découverte qui a bousculé la définition établie des virus [6, 7], une étude a été menée sur l’eau des tours aéroréfrigérantes dans le but d’isoler de nouveaux microorganismes associés aux amibes. L’inoculation d’un de ces échantillons sur une culture d’amibes libres a permis l’isolement d’un deuxième virus géant morphologiquement très proche de Mimivirus, mais dont la particule présentait une taille légèrement supérieure : Mamavirus [8]. Cet isolat était en outre accompagné d’une particule virale inconnue, d’une taille d’environ 50 nm, observée dans le cytoplasme de l’amibe et en périphérie de l’usine à virus. Ce virus, incapable de se multiplier dans l’amibe sans la présence d’un virus géant, a été appelé Sputnik et qualifié de premier « virophage » connu par sa capacité à altérer la croissance de son grand virus hôte selon un modèle ressemblant à celui d’un bactériophage (figure 1D) [8].

Au cours de la même étude, les co-cultures d’un autre échantillon sur amibes ont permis d’isoler un virus géant du nom de Marseillevirus, d’une taille d’environ 250 nm et possédant de petites fibrilles de 12 nm (figure 1C) [9]. Le génome de ce virus a une taille de 368 kb. Ce nouveau virus constitue un nouvel embranchement des virus géants au sein des NCLDV, distinct des Mimiviridae. Récemment la famille des Marseillevirus s’est agrandie avec l’isolement de Lausannevirus [10] partageant 89 % de son génome avec Marseillevirus.

Les études de métagénomique dans l’environnement ont montré que des séquences de gènes de Mimivirus étaient présentes dans les milieux aquatiques de façon ubiquitaire [11]. D’autres recherches visant à les isoler ont donc été menées à partir d’échantillons d’eau de tours aéroréfrigérantes ainsi que sur les eaux issues de l’environnement : lacs, rivières, fontaines, mer et hôpitaux mais aussi à partir d’échantillons issus du sol (terre, terreaux…). Après inoculation de 105 échantillons d’origines diverses, cette étude a permis d’isoler 19 virus géants de tailles allant de 150 à 600 nm dont 16 morphologiquement et phylogénétiquement proche de Mimivirus ainsi qu’un nouveau virophage, portant à 21 le nombre total de virus géants isolés et à deux le nombre de virophages [12]. Récemment, un nouveau virus géant d’une taille de 300 nm avec un génome de 730 kb, appelé CroV (Cafeteria roenbergensis) et infectant des flagellés marins a été isolé [13], lui aussi accompagné d’un virophage [14].

Structure

Les virions de Mimiviridae ont une taille comprise entre 400 et 600 nm et sont constitués d’une capside icosaédrique (figure 1). Ce sont des virus non enveloppés entourés de fibrilles d’une taille d’environ 200 nm de long. Les gènes L829 et R135 ont été identifiés comme participant à la formation des fibrilles [15]. Celles-ci sont sensibles aux protéases seulement après traitement au lysozyme, ce qui suggère qu’elles sont entourées de peptidoglycanes et sont insensibles aux collagénases, ce qui semblait contribuer à expliquer le marquage par la coloration de Gram. La récente analyse d’un clone de Mimivirus dépourvu de fibrilles, mais répondant toujours à la coloration de Gram, suggère que c’est plutôt la structure de la capside qui est responsable de cette prise de colorant [15]. La présence de ces fibrilles densément implantées à la surface du virus rend difficile l’étude de la capside du virus. Leur apparition se fait tardivement au cours de la production du virus, elles sont fabriquées séparément puis attachées à la particule immature [16]. Ces fibrilles sont composées d’une partie ancrée à la capside et d’une tête globulaire terminant l’extrémité opposée. Les fibrilles sont attachées à des protéines d’ancrage recouvrant la capside de façon organisée mais non géométrique et chaque protéine d’ancrage peut soutenir plusieurs fibrilles. Il est possible que ces protéines d’ancrage soient en fait des boucles polypeptidiques émergeant des major capsid protein (MCP). Un autre type de fibres a été observé au cours d’une étude en microscopie à force atomique [17]. Ces fibres de 1,2 nm de diamètre sont observées après rupture des virions, ce qui suggère qu’elles sont encapsidées dans la particule virale. Elles présentent une répétition de bandes sombres et claires tous les 7 nm et sont certainement composées de protéines. Elles peuvent être observées seules ou organisées en différentes superstructures (hélices, rubans, câbles). La localisation de ces fibres et leur fonction au sein de la particule virale restent encore inconnues mais il est supposé que leur rôle est de maintenir la stabilité entre l’intérieur de la capside et le sac contenant le matériel génétique ou nucléocapside.

La membrane la plus externe de la capside a une épaisseur de 70 Å et est composée de MCP. Cette protéine possède de nombreuses similarités avec les différents virus à ADN double brin évoquant une évolution à partir d’un ancêtre commun [18].

L’organisation de la capside de Mimivirus est comparable à celle des virus à ADN double brin, composée de capsomères hexamériques. Chaque capsomère est composé de trois monomères eux-mêmes composés d’un assemblage de deux jelly-rolls, parties N-terminales et C-terminales de la MCP. Malgré la présence de quatre gènes de capside homologues dans le génome de Mimivirus, il a été montré que la MCP exprimée chez Mimivirus est codée par le gène L425 de 3430 bp [5]. La protéine de 593 acides aminés ou capsid protein I subit des modifications post-traductionnelles de type glycosylation et phosphorylation. Cependant, 190 acides aminés supplémentaires sont insérés dans une des boucles du jelly-roll, ce qui a pour conséquence de former une tour au sommet de chaque monomère, donnant une impression de triangle et maintenant une structure pseudohexamérique [17]. La suppression des fibrilles de Mimivirus par des techniques de digestion avec du lysozyme ou des protéases a permis d’analyser la structure de la capside de Mimivirus en cryomicroscopie électronique [19]. La surface du virus présente de nombreuses dépressions hexagonales en nid-d’abeilles séparées d’environ 140 Å ainsi qu’une structure en étoile de mer associée à un sommet pentamérique. Les dépressions de la capside, interprétées comme l’absence d’un capsomère, semblent en fait être liées à un conflit d’encombrement stérique causé par les 190 acides aminés supplémentaires de la MCP. Le concept de quasi-équivalence de Caspar et Klug permet de définir la conformation d’une capside icosaédrique par le nombre de triangulation T dépendant des variables h et k qui permettent de définir les relations entre chaque pentamère et les pentamères voisins. La résolution de 65 Å n’étant pas suffisante pour définir le h et le k de Mimivirus il est seulement possible de dire que T est compris entre 972 et 1 200, soit h et k valant 19 plus ou moins 1. L’absence de certains capsomères chez Mimivirus implique que, contrairement aux autres virus possédant des MCP à deux jelly-rolls où T est équivalent au nombre de jelly-roll, ici le nombre de jelly-roll est seulement de 2T/3 [19].

Le sommet en étoile, aussi appelé « stargate », présente une largeur de 500 Å, une épaisseur de 400 Å et une longueur de 2 000 Å et paraît être composé de protéines différentes de la MCP [20]. Il ne contient pas de protéines d’ancrage et est donc dépourvu de fibrilles. Cette structure permet, grâce à l’ouverture de cinq faces icosaédriques, la formation d’un canal qui libère le matériel génétique du virus dans la cellule hôte [16]. Ce mode de libération de l’ADN viral rappelle celui des bactériophages. En outre, contrairement aux autres virus à ADN double brin, l’encapsidation de l’ADN semble se faire à un endroit différent de sa libération. En effet, un portail sur la face opposée à celle de la « stargate » agit comme un portail transitoire pour l’encapsidation du matériel génétique. À l’intérieur de la capside se trouve la nucléocapside, un sac composé d’une bicouche lipidique qui protège l’ADN viral. Celle-ci présente un espace entre nucléocapside et capside plus grand au niveau de la « stargate ». Cet espace contient les enzymes nécessaires pour les premières étapes de la réplication virale. De plus, la nucléocapside semble être maintenue à la capside par des fibrilles internes de 1,2 nm de diamètre avec un motif répété tous les 7 nm décrites plus haut. La nucléocapside contient l’ADN double brin du virus associé à des protéines.

Marseillevirus est un virus géant à ADN double brin dont la capside de symétrie icosaédrique mesure environ 250 nm de diamètre et possède des fibrilles de 12 nm de longueur terminées par une extrémité globulaire (figure 1). La capside mesurant 10 nm d’épaisseur est séparée de la nucléocapside par un espace de 5 nm et suit la forme de la capside. Ainsi la morphologie de ce virus appartenant à la classe des virus géants ressemble beaucoup à celle de Mimivirus hormis sa plus petite taille. Cependant, Marseillevirus de part son contenu génétique représente une nouvelle famille des NCLDV [9]. Ce virus demeure actuellement très peu étudié.

En conclusion, la structure de Mimivirus est plus complexe que celle de la plupart des virus. La présence d’une structure unique dédiée à la libération du matériel génétique rappelle les bactériophages tandis que le génome enveloppé par une pseudomembrane rappelle le noyau des cellules eucaryotes. Enfin, la présence de fibrilles composées de peptidoglycanes rappelle, quant à elle, la membrane bactérienne. Ces observations corroborent les études montrant que Mimivirus a intégré ou conservé des gènes des procaryotes, eucaryotes et Archae, posant ainsi la question de sa position au sein de l’arbre de la vie.

Cycle réplicatif

Mimivirus a un cycle de réplication particulier, qui, s’il présente des analogies avec celui d’autres NCLDV, et notamment les Poxviridae, n’est identique à aucun autre (figure 2). L’entrée de Mimivirus dans les amibes se fait par phagocytose [4]. Il a été démontré que l’entrée de Mimivirus dans les macrophages se fait aussi par phagocytose, renforçant encore l’analogie entre capacité à infecter des amibes et capacité à infecter les macrophages [21]. C’est la première fois que ce mode d’entrée dans une cellule hôte, typique des bactéries, est décrit pour un virus. Les fibrilles à la surface de Mimivirus pourraient être impliquées dans l’attachement du virus à son hôte de prédilection : les amibes du genre Acanthamoeba [22]. L’entrée de Mimivirus dans l’amibe par phagocytose est définie comme le H0 du cycle réplicatif. Le virus est alors contenu dans une vacuole. À partir d’une heure post-infection, le vertex du virus s’ouvre et semble fusionner avec la membrane de la vacuole afin de libérer le matériel génétique dans le cytoplasme de la cellule. Des expériences de microscopie électronique en transmission ont montré que les particules de virus géants ayant libéré leur matériel génétique ne possèdent plus ce sommet en étoile de mer. Il semblerait donc que la première étape de multiplication de Mimivirus consiste en le relargage de la structure en étoile de mer permettant ainsi l’ouverture des faces icosaédriques de la capside et la fusion de la membrane interne du virus avec celle du phagosome. Cette fusion forme un canal propice à la sortie du matériel génétique par le vertex [16, 19]. Après une première hypothèse supposant que le matériel génétique libéré par le virus passe ensuite dans le noyau de l’amibe pour se répliquer une première fois, la réplication du matériel génétique a été élucidée grâce à des marquages des acides nucléiques et des acides nucléiques néosynthétisés. La libération du matériel génétique dans la cellule hôte marque l’activation de la transcription qui libère des ARN messagers à différents endroits du cytoplasme. L’ADN libéré commence à se répliquer pour former les prémices des usines à virus déjà décrites. La croissance rapide de ces pôles de réplication entraîne leur fusion pour constituer l’usine à virus uniforme [23]. La totalité du cycle de réplication de Mimivirus prend donc place dans le cytoplasme (figure 2), ce qui est à rapprocher du cycle réplicatif des poxvirus, mécanisme unique à cette famille jusque-là [24].

Le virus entre alors dans une phase d’éclipse où les particules virales ne sont plus visibles. À quatre heures post-infection, une structure dense aux électrons et entourée de mitochondries mais dénuée de membrane commence à être observable en périphérie du noyau de l’amibe. Plusieurs de ces structures peuvent être observées à proximité les unes des autres. La taille de cette structure, qui semble être le lieu de réplication de l’ADN viral, augmente rapidement entre cinq et huit heures post-infection, entraînant la fusion des structures proches pour former une structure plus grande et plus uniforme : l’usine à virus (figure 3A). C’est à partir de ce temps que de nouvelles particules virales commencent à être visibles en périphérie de l’usine. Celle-ci grandit pour finir, autour de H12, par occuper la majeure partie du cytoplasme de la cellule hôte. L’usine peut atteindre environ 250 μm², ce qui en fait l’une des plus grandes jamais décrite, et est dépourvue de membrane. Un grand nombre de mitochondries peuvent être observées à proximité de ce centre de réplication. La grande majorité des amibes infectées ne possèdent qu’une usine. L’usine à virus peut paraître désorganisée au premier abord, mais elle répond en fait à une structure constante. En effet, le centre de l’usine est le lieu de la réplication du matériel génétique proprement dit. Il présente une structure hétérogène où sont observées des masses très denses aux électrons. La deuxième partie de l’usine, plus à l’extérieur, sert de lieu d’assemblage des virus géants. On peut y observer l’apparition de capsides encore incomplètes. Enfin, la dernière partie de l’usine, la plus externe, est la partie où les particules complètes reçoivent le matériel viral. Cette entrée de l’ADN dans la particule se fait par la face opposée au vertex permettant la sortie du matériel génétique au début du cycle. En effet, un canal conique, de 35 nm de diamètre à l’extérieur de la particule et de 20 nm de diamètre à l’intérieur, se forme au centre de la face opposée au sommet de la structure en étoile de mer, traversant toutes les membranes virales et permettant le transport du matériel génétique au sein de la particule virale. Ce canal est ensuite refermé puisqu’il n’est plus visible sur les particules matures [16]. La façon dont ce canal se forme puis se referme reste encore à déterminer. Enfin, la particule virale acquiert ses fibrilles. Après environ 24 heures d’infection, l’amibe est lysée par le virus et se morcelle, libérant ainsi les particules virales produites durant le cycle. Les mécanismes par lesquels le virus module l’activité cellulaire de son hôte restent encore obscurs.

Le cycle de réplication de Marseillevirus suit les mêmes étapes que celui de Mimivirus. Les virus entrent dans l’amibe en une heure, puis l’usine virale est mise en place à trois heures post-infection. Cependant, à partir de cinq heures post-infection les virions sont produits et libérés par la lyse de l’amibe hôte à 19 heures post-infection, ce qui représente un cycle beaucoup plus rapide que ce qui a pu être observé pour les autres virus géants [9]. De plus, l’usine à virus des Marseilleviridae est beaucoup plus grande et diffuse que celle produite par les Mimiviridae (figure 3) [9].

La formation d’usines à virus pour réaliser la production de virions au sein de la cellule hôte est couramment utilisée par les virus et notamment par les membres des NCLDV, mais aussi par d’autres virus [25]. Cependant, certaines caractéristiques sont uniques aux Mimiviridae. La première particularité observable chez ces virus est la taille de l’usine à virus qui peut occuper la majeure partie de cytoplasme de la cellule infectée. De plus, les dernières études menées sur le cycle de Mimivirus dans l’amibe montrent que sa réplication se déroule uniquement dans le cytoplasme, indépendamment du noyau de la cellule hôte [23].

Génomique

Mimivirus est un virus à ADN double brin linéaire de 1,2 Mb, ce qui est plus gros que pour certaines bactéries [26]. Le génome est probablement circularisé grâce à deux séquences répétitives inversées de 900 pdb à chaque extrémité, comme c’est le cas pour certains NCLDV [5]. La totalité du génome a été séquencée en 2004 [5] et se compose de 72 % de A + T. Le génome présente une asymétrie des brins qui est souvent retrouvée dans les génomes bactériens au niveau de l’origine de réplication. Les gènes de Mimivirus sont donc transcrits le plus souvent à partir de cette origine. Le génome de Mimivirus compte 1 262 cadres de lecture (open reading frame, ORF) et code pour 911 protéines dont 298 ont été reliées à une fonction, soit une densité codante de 90,5 % [27]. De nombreuses interrogations sont donc posées par la présence de ce grand nombre de gènes de fonction inconnue, notamment quant à leur utilité et leur origine. Cent quatre-vingt-quatorze ORF correspondent à 108 clusters of orthologs groups (COG) dans 17 classes différentes, notamment le métabolisme, le transport des amino-acides, la traduction et les modifications post-traductionnelles qui sont surreprésentées en comparaison des autres NCLDV. Le génome de Mimivirus contient aussi bien des caractéristiques communes aux autres virus, bactéries et même cellules, que des caractéristiques qui lui sont propres et uniques au sein des virus.

Mimivirus contient neuf gènes de classe I (communs à toutes les familles de NCLDV) sur neuf, six gènes de classe II (absents d’une des familles de NCLDV) sur huit et 11 gènes de classe III (conservés dans trois ou quatre familles de NCLDV) sur 14. Des transcrits du gène de la capside et de l’ADN polymérase (classe I) ainsi que du facteur de transcription TFII-like (classe II) ont été observés dans la particule virale. Les gènes manquants sont impliqués dans la synthèse des précurseurs de l’ADN, la réplication ou la transcription. Ces données définissent Mimivirus comme une nouvelle branche des NCLDV : les Mimiviridae.

Cependant, 80 % des ORF de Mimivirus n’ont pas d’homologues connus, mais certains de ces transcrits sont retrouvés dans la particule virale et doivent donc être impliqués dans les prémices du cycle réplicatif du virus. Des gènes uniques à Mimivirus ont été retrouvés tels que facteur d’élongation, d’initiation, de traduction et des enzymes de modification des ARNt. L’analyse en pyroséquençage des ARN polyadénylés de Mimivirus au cours de l’infection a permis d’identifier 75 nouveaux transcrits et de confirmer la présence des séquences palindromiques au niveau des sites de polyadénylation. De plus, cette étude montre que les gènes de Mimivirus sont exprimés et régulés au cours du temps. Enfin, un promoteur de gènes tardifs présent chez Sputnik a aussi été observé chez Mimivirus [28]. De plus, des gènes codant pour des enzymes de réparation de l’ADN ont été observés pour la première fois chez un virus, de même que la présence de la topo-isomérase IA. Comme les autres NCLDV, Mimivirus possède des gènes impliqués dans le métabolisme des sucres, des lipides et des acides aminés. Cependant, certains gènes, comme ceux impliqués dans le métabolisme de la glutamine et la synthèse des oligosaccharides, sont uniques à Mimivirus. La présence de ces gènes ainsi que de ceux de la glycosyl-transférase peut expliquer le marquage de la particule virale à la coloration de Gram. De plus, des gènes codant pour des transporteurs mitochondriaux de dATP et de dTTP, observés seulement chez les eucaryotes, ont été retrouvés chez Mimivirus [29]. Les auteurs pensent que ce gène sert à cibler les mitochondries de l’hôte afin de se servir de ses dNTP pour sa propre réplication. Enfin pour la première fois, une nucléoside diphosphate kinase est observée dans le génome d’un virus à ADN double brin.

De plus, Mimivirus possède la plus grande part de gènes dupliqués, à savoir 43 % [30]. Ces dupliquas au cours du temps peuvent avoir donné des pseudogènes, des gènes tronqués mais aussi des gènes ayant des fonctions nouvelles et ont grandement participé au processus d’évolution de Mimivirus.

Une part significative du génome de Mimivirus, plus que pour la plupart des autres virus, est la conséquence du transfert latéral de gènes. Cela est probablement dû à la colonisation de son hôte, les amibes, par quantités d’autres microorganismes (bactéries, champignons) [31], faisant ainsi de l’amibe un carrefour pour l’échange de gènes [32]. En effet, Mimivirus tire 9,6 % de ses gènes de bactéries, ce qui est la plus forte proportion chez les virus (généralement en dessous de 2 %), et a contrario seulement 0,7 % de son hôte. En effet, 8,3 % des ORF de Mimivirus ont des homologues dans les autres domaines de la vie contre seulement 4,4 % pour les autres NCLDV [26, 33]. D’autres études utilisant les ORF reliés à des COG (126), montrent que les ORF les plus représentés sont communs aux bactéries et eucaryotes seulement pour 37 %, 23 % sont communs aux trois domaines de la vie et, enfin, 17 % sont propres aux eucaryotes [34]. Dix pour cent des ORF ayant une origine cellulaire proviennent des amibes. Il semblerait que les gènes issus des bactéries soient localisés à l’extrémité du génome des NCLDV, plus précisément avant et après les 250 premiers et derniers Kb du génome de Mimivirus, quand les core genes et les gènes de provenance eucaryote sont placés au centre du génome. Mimivirus possède aussi des éléments mobiles incluant des séquences d’insertion facilitant les transferts latéraux de gènes propres jusque-là aux eucaryotes [35].

Des segments protéiques catalysant des réactions d’autoépissage protéique appelés intéines, rares chez les virus d’eucaryotes, sont aussi retrouvés chez Mimivirus. Découvertes chez les bactéries, archées et eucaryotes unicellulaires, elles seraient transmises par les virus aux différents organismes [36].

Les analyses phylogénétiques intégrant les génomes de Mimivirus, Marseillevirus et ceux des autres NCLDV ont montré que les NCLDV possèdent comme ancêtre commun un virus possédant au moins 41 gènes [37] impliqués notamment dans la réplication et la structure de la capside (jelly-rolls). La découverte récente d’un nouveau virus géant, Megavirus chilensis, corrobore encore cette hypothèse [38]. Si Mimivirus contient de nombreux gènes communs aux NCLDV, il possède aussi de nombreux gènes provenant des trois domaines de la vie composant un génome chimérique, contenant de nombreux ORFans et un large répertoire de gènes, composé au cours du temps par transfert latéral de gènes et duplication. Cela est principalement dû à la co-infection des amibes par une multitude de microorganismes d’origines différentes. Les amibes sont donc considérées non seulement comme un réservoir pour les virus géants, mais aussi comme l’origine de leur existence [32]. La présence des gènes codant pour des « protéines universelles », c’est-à-dire présents dans les trois domaines de la vie, a conduit au placement de Mimivirus comme une branche unique de l’arbre de la vie placée entre les Archae et les eucaryotes [5]. Mais la complexité inhabituelle du génome de Mimivirus a conduit à de nombreuses discussions sur son origine : issu d’un ancêtre commun selon les uns [27], chimérique expliquant la taille de son génome par une extraordinaire capacité à « voler » des gènes pour les autres [39], et a remis en question la définition même des virus [6]. C’est pourquoi Mimivirus se place actuellement au sein des NCLDV et qu’une nouvelle dénomination particulière : les « girus », a été proposée dans le but de marquer leur différence face aux virus « classiques » qui n’ont ni la taille ni la diversité du génome de ces microorganismes parfois plus comparables à des procaryotes [40]. Récemment un article de Boyer et al. [41] suggère de placer Mimivirus ainsi que les NCLDV à la racine de l’arbre entre les eucaryotes et les Archae en se basant sur l’analyse de huit gènes impliquées dans les processus liés à l’ADN, soulevant l’hypothèse que le core génome des NCLDV est donc aussi ancien que les trois actuels domaines de la vie (figure 4). Cependant, la polémique continue puisqu’un article publié en juin 2011 contredit de nouveau cette théorie [42].

La découverte de Mimivirus a bouleversé la vision archaïque des virus comme des organismes filtrables à la limite du vivant et au génome limité à sa plus simple expression. Au contraire, certains le considèrent presque comme un organisme cellulaire parasite lors de la formation de l’usine à virus (commune à de nombreux virus à ADN double brins et certains virus à ARN) gommant ainsi la limite entre virus et virions [6].

Virus géants et pathologie humaine

L’analogie entre la physiologie des amibes et celle des macrophages a conduit à penser que les microorganismes résistants aux amibes seraient aussi capable de résister à la lyse par les macrophages et par là même, seraient capables de provoquer des maladies notamment chez l’homme. Cette théorie s’est vérifiée lors d’épidémies de légionelloses où, en plus d’abriter la multiplication des légionelles, les amibes ont servi de vecteur ou de « cheval de Troie » pour l’infection des sujets [43]. Les amibes étant très résistantes grâce à leur forme kystique, elles permettent aux microorganismes de survivre à de nombreuses formes de désinfection [44]. Toutes ces particularités réunies en font un hôte de prédilection pour des pathogènes potentiels. De nombreux microorganismes résistants aux amibes ont déjà été isolés dans des amibes, dont certains sont pathogènes pour l’homme, tels que Legionella spp., Mycobacterium spp. [44]. La découverte de Mimivirus grâce à la co-culture sur amibes, sa taille et la diversité de son génome font donc de lui un pathogène humain potentiel. De plus, les virus sont considérés comme des agents potentiels de pathologies nosocomiales, notamment au sein des unités de soins intensifs et semblent constituer une part certaine des pneumonies dont on ne connaît pas l’agent responsable soit entre 20 et 50 % [2]. L’infection à Mimivirus d’un technicien, au sein d’un laboratoire, a confirmé le pouvoir pathogène de ce virus, les auteurs préconisant de le classer dans les pathogènes de classe II [3]. Des moyens de détection de l’infection à Mimivirus ont donc été développés : biologie moléculaire, western blot, immunofluorescence, culture et sérologie [45].

Dans le but d’établir le pouvoir pathogène de Mimivirus, un modèle expérimental de souris a été mis en place [46]. Cette étude montre des images histologiques de pneumonie aiguë chez 75 % des souris. Parmi les souris infectées, 91,7 % présentaient des antigènes Mimivirus (immunofluorescence sur les tissus pulmonaires) et/ou une culture positive de Mimivirus à partir des tissus pulmonaires. Cette étude montre donc que Mimivirus est capable de provoquer des pathologies pulmonaires dans des conditions expérimentales. Des études ont aussi été menées sur des échantillons cliniques [2] montrant que les patients atteints de pneumonie avaient un taux significatif d’anticorps contre Mimivirus significativement plus nombreux que le groupe témoin (9,66 % contre 2,3 %, respectivement). De plus, les patients présentant une pneumonie associée à Mimivirus montrent un taux de ré-hospitalisation supérieur par rapport aux autres, probablement à cause d’un traitement inadapté. Enfin, l’ADN de Mimivirus a été détecté dans le lavage broncho-alvéolaire (LBA) d’un patient. Une autre étude, menée dans une unité de soins intensifs sur des patients atteints de pneumonie communautaire [47], a montré l’existence d’un contact avec Mimivirus par des techniques de sérologie. Pourtant, les études menées par PCR en temps réel ne montrent pas de preuves de la pathogénicité de Mimivirus. En effet, l’étude menée par Dare et al. [48] montre 0 PCR positive sur 496 échantillons respiratoires malgré l’utilisation de deux nouvelles techniques, suggérant que Mimivirus n’est pas un agent commun de pathologies respiratoires. Cependant, les échantillons de cette étude proviennent du tractus respiratoire supérieur (sécrétions nasales) alors que les PCR positives à Mimivirus ont été effectuées sur des échantillons provenant du tractus respiratoire inférieur (LBA) [2].

La diversité des résultats obtenus par PCR peut être due au fait que ces études sont basées sur la connaissance de deux virus d’une famille probablement très diversifiée, ce que tend à prouver la description de 19 autres virus de cette famille [12].

Virophage

Lors de l’isolement du deuxième virus géant connu, Mamavirus, une structure virale icosaédrique a été observée dans le cytoplasme de l’amibe ainsi qu’au sein de l’usine à virus (figure 1D) [8]. Cette particule de 50 nm a par la suite été isolée par filtrations différentielles et a été nommée Sputnik en raison de son association avec Mamavirus. L’inoculation de ce virus sur une culture d’A. polyphaga a permis de montrer qu’il était incapable de se multiplier seul au sein de l’amibe. Les observations de microscopie électronique et d’immunofluorescence ont montré que Sputnik se multiplie au sein de l’usine à virus créée par le virus géant qui l’accompagne, et possède sa propre cinétique de réplication [8]. L’entrée des particules virales se fait à 30 minutes post-infection, probablement par association des particules de virophage aux fibrilles des virus géants. À quatre heures post-infection, l’usine à virus du virus géant se forme, s’ensuit une phase d’éclipse du virus géant après laquelle débute la production de Sputnik (six heures post-infection). À huit heures post-infection, les virions de Sputnik sont visibles et localisés à un pôle de l’usine à virus (figure 3C). À 16 heures post-infection, les Sputnik et Mamavirus néosynthétisés remplissent la plus grande part du cytoplasme de l’amibe. Les particules de Sputnik produites peuvent parfois être observées au sein de vacuoles. Enfin cette cinétique aboutit à la lyse de la cellule infectée et la libération des particules virales.

La présence de Sputnik entraîne la formation de particules anormales de Mamavirus (figure 5), notamment des membranes plus épaisses ou une accumulation de membranes surnuméraires à un pôle de la particule ainsi qu’une lyse plus tardive des amibes infectées.

Plus rarement des virus géants contenant une ou plusieurs particules de Sputnik ont été observés. Ces deux caractéristiques permettent de penser que ce virus est un véritable parasite, ce qui a conduit à changer le terme « satellite » pour le terme « virophage » qui semble mieux convenir à son mode de réplication : un virus infectant un autre virus [49]. En effet, Sputnik parasite l’usine servant à la production des virus géants pour en détourner la machinerie et ainsi servir sa propre réplication. Cependant, l’existence de la nouvelle classe des virophage est remise en cause par certains auteurs qui considèrent que Sputnik ne constitue qu’une autre forme de virus satellite [50].

Les observations en immunofluorescence montrent que la production de Sputnik se fait souvent avant celle du virus géant et que les usines montrent une séparation spatiale des zones de production de virus géant et de virophage, suggérant une compétition entre les deux virus (figure 3C). Ces caractéristiques particulières font de Sputnik une nouvelle entité biologique. De plus, celui-ci joue un rôle important au sein des écosystèmes aquatiques puisqu’il entre dans la régulation des interactions hôte-virus [51].

Les tentatives de co-infection entre Sputnik et Marseillevirus n’ont montré aucune multiplication du virophage suggérant qu’il y a une spécificité d’hôte. Cependant, le cycle de Marseillevirus a montré un ralentissement [49].

Le génome de Sputnik est un ADN double brin de 187 kb et est caractéristique des génomes viraux. Trois protéines sont majoritairement représentées : la MCP (ORF 20) et deux protéines de capside minoritaires (ORF 19 et 08). Treize des 21 protéines codées sont des ORFans tandis que les huit autres ont des homologues viraux, bactériens ou eucaryotes. Trois ORF (6, 12, 13) sont très proches de Mimivirus. De plus Sputnik contient les 16 structures en épingle à cheveux qui sont le signal de polyadénylation propre à Mimivirus [52], ce qui corrobore l’utilisation de l’usine virale de Mimivirus pour la réplication du virophage. De plus, Sputnik possède dans ses virions des ARN prêts à être utilisés, probablement dans le but de débuter sa réplication plus rapidement que le virus géant parasité.

Sputnik est le premier virophage découvert, dévoilant ainsi une partie encore inconnue des virus géants.

Conclusion

La découverte de Mimivirus, il y a moins de dix ans, a remis en question la définition même des virus non seulement de par sa taille, mais aussi de par la taille et le contenu de son génome ainsi que son mode de réplication. Plus récemment la description des virophages a encore contribué à brouiller la frontière entre virus et cellules parasites. L’étude de plus en plus poussée de ces nouveaux virus aussi bien du point de vue génomique que morphologique a même suggéré pour certains qu’ils puissent former un domaine de la vie distinct et qu’il faut désormais considérer les virus comme des organismes vivants à part entière et ainsi prendre en compte leur participation à l’évolution de la vie. Les études de métagénomique montrent que nous venons à peine d’effleurer le monde des virus géants et que beaucoup reste encore à faire pour en appréhender toute la complexité et la diversité.

Conflits d’intérêts: aucun.

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