Communications orales et affichées

ARTICLE

Épidémiologie, virus et environnement

Jeudi 20 avril 2006, 14 h à 15 h15

Communications orales O1 à O5
Communications affichées P6 à P16

O1
Transmission d’un lentivirus de type CAEV entre la chèvre, le bouquetin et leurs hybrides en zone de cohabitation dans les Alpes françaises

Erhouma E¹, Guiguen F¹, Greenland T¹, Durand J¹, Gauthier D², Legras-Lachuer C¹ Verdier G¹, Mornex JF¹, Chebloune Y¹, Alogninouwa T¹

¹ UMR 754 INRA/ENVL/UCBL, Rétrovirus et pathologie comparée, IFR 128 BioSciences Lyon-Gerland, Université Claude Bernard, Bât B, 50 avenue Tony-Garnier, 69366 Lyon Cedex 07 ; ²Laboratoire vétérinaire départemental, 05000 Gap
<Esadk-Ali. Erhouma@sante.univ-lyon1.fr>

Le virus de l'arthrite et de l’encéphalite de la chèvre (CAEV) infecte plus de 50 % des troupeaux de chèvres en France. Il détermine au mieux des infections chroniques chez ces animaux, si ce n’est des pathologies nerveuses chez le jeune ou des troubles mammaires et articulaires chez les adultes. La transmission se fait de la mère au jeune par ingestion de colostrum et de lait contaminés. Cependant, peu de données sont disponibles sur la possibilité de passage de ces lentivirus des petits ruminants (LVPR) chez les ongulés sauvages. Les nouvelles pratiques pastorales dans les zones de montagne, en relation avec la protection de la faune sauvage, entraînent une augmentation des contacts entre cette faune et les animaux domestiques. La possibilité du passage de agents pathogènes des uns aux autres est donc devenue une hypothèse que l’on peut opportunément envisager. Le présent travail rapporte justement l’infection naturelle par un virus de type CAEV, dans les Alpes françaises, du bouquetin (Capra ibex) cohabitant avec des troupeaux de chèvres domestiques infectées.
Les enquêtes sérologiques réalisées dans le domaine ont mis en évidence des anticorps spécifiques du CAEV dans le sérum des chèvres, des bouquetins et des hybrides chèvres/bouquetin. Le surnageant de culture des macrophages dérivés des monocytes (MDM) des bouquetins séropositifs induit, sur une culture de MDM de chèvre indemne de lentivirus, des effets cytopathiques (syncitia) caractéristiques de l’infection par les LVPR.
L’analyse génétique des différents virus a été réalisée à partir d’un fragment caractéristique du gène gag des LVPR obtenu par amplification génétique de l’ADN des cellules des animaux infectés. L’étude des séquences nucléotidiques (une région de 512 nucléotides du gène gag) montre des similarités fortes entre les séquences du virus circulant dans le troupeau de chèvres, celles des bouquetins cohabitant avec elles, ainsi qu’avec celles du virus retrouvé chez les hybrides bouquetin/chèvres infectés. L’arbre phylogénique (neighbor-joining) précise les distances relativement faibles entre les échantillons séquencés, en prenant le prototype CAEV-CO comme référence ; les valeurs bootstrap sont le résultat de centitérations et montrent que les séquences du virus du bouquetin forment un groupe distinct.
La comparaison des pourcentages de divergences entre les séquences étudiées conforte l’hypothèse d’une parenté génétique entre ces différents virus, si ce n’est le même qui s’est adapté. Il semble donc que les variations observées entre les séquences des différents clones dérivés montrent que les infections lentivirales créent des quasi-espèces, comme cela est classiquement décrit chez les petits ruminants domestiques et d’autres espèces. La voie de transmission ici pourrait procéder des voies habituelles (colostrales) pour ce qui est de la transmission de la chèvre aux hybrides, et probablement des voies génitales pour ce qui est du passage de la chèvre au bouquetin.

O2
Surveillance virologique liée à la déclaration obligatoire de séropositivité VIH : faisabilité et principaux résultats (mars 2003-décembre 2004)

Barin F, Cazein F, Plantier JC, Lot F, Pillonel J, Brand D, Brunet S, Moreau A, Desenclos JC, Semaille C.

Centre national de référence du VIH (CNR VIH), CHU Bretonneau, et EA3856, Université François-Rabelais, Tours ; Laboratoire de virologie, CHU Charles-Nicolle, Rouen ; Institut de veille sanitaire (InVS), Saint-Maurice.
<fbarin@med.univ-tours.fr>

L’objectif de l’étude est de disposer de données permettant de suivre la dynamique de l’infection à VIH au plan national.
Une surveillance virologique nationale couplée à la déclaration obligatoire de séropositivité VIH a été mise en place depuis mars 2003. Les notifications avec anonymisation sont initiées par les biologistes lors de toute découverte de séropositivité VIH confirmée. Les informations cliniques et épidémiologiques sont ensuite complétées par les cliniciens. La surveillance virologique repose sur le volontariat des biologistes et nécessite le consentement des patients. Les prélèvements de sérum ou de plasma déposés sur papier buvard sont adressés par voie postale au CNR VIH où est réalisé un test d’infection récente qui permet de déterminer si l’infection date de moins de 6 mois ou non [Barin et al., J Clin Microbiol 2005, 43 : 4441-7], ainsi qu’un sérotypage qui permet de distinguer VIH1M sous-type B ou non-B, VIH1O et VIH2. Les données cliniques, épidémiologiques et virologiques sont ensuite transmises à l’InVS pour y être analysées. Une étude nichée de génotypage (analyse phylogénétique après séquençage d’un fragment de 415 bp du gène env obtenu par RT-PCR à partir de l’ARN extrait du dépôt sur buvard) a été réalisée sur 321 échantillons afin de disposer d’informations plus précises quant à la diversité génétique des souches circulantes.
Les résultats du test d’infection récente sont disponibles pour 4 352 personnes découvertes séropositives en 2003-2004. La proportion d’infections récentes est de 25,2 % (IC95 % = 23,9-26,5). Elle est plus élevée chez les hommes (30,1 %) que chez les femmes (18,3 %, p < 0,0001) et chez les homosexuels (46,1 %) que chez les personnes contaminées par rapport hétérosexuel (18,3 %, p < 0,0001). Elle diminue avec l’âge, de 26,7 % chez les moins de 30 ans à 21,9 % chez les plus de 50 ans (p = 0,03). La proportion d’infections récentes chez les personnes d’Afrique subsaharienne (10,3 %) est moins élevée que chez les personnes de nationalité française (36,8 %, p < 0,0001). Cette différence persiste chez les personnes contaminées par rapports hétérosexuels (10 % chez les Africains versus 29 % chez les Français). La proportion de VIH2 est de 1,9 % (IC95 % = 1,5-2,2), dont 1,7 % d’infections à VIH2 seul et 0,2 % de co-infection VIH1-VIH2. Parmi les infections à VIH1, le groupe est connu dans 4109 cas ; 8 infections du groupe O et 2 co-infections M + O ont été identifiées, dont 9 concernaient des personnes d’Afrique subsaharienne (8 du Cameroun et 1 du Tchad). Parmi les 3907 cas du groupe M qui ont été sous-typés, 48,3 % (IC95 % = 46,7-49,8) sont des sous-types non-B. La proportion des sous-types non-B diffère significativement selon le sexe, l’âge, le mode de contamination, la nationalité (p < 0,0001). Elle est plus élevée chez les femmes (66,8 %) que chez les hommes (33,7 %), chez les moins de 40 ans (53,5 %) que chez les plus de 40 ans (38,0 %), chez les hétérosexuels (61,2 %) que chez les homosexuels (12,6 %) ou les usagers de drogue (16,8 %), et chez les personnes d’Afrique subsaharienne (81,6 %) que chez celles de nationalité française (22,2 %). Au sein de l’étude nichée de génotypage, 172 échantillons ont pu être amplifiés puis séquencés (53,6 %). Les souches prédominantes, après le génotype B, sont liées à la forme recombinante circulante CRF02_AG.
Les deux premières années de cette surveillance montrent la faisabilité à l’échelle nationale, y compris avec la possibilité de réaliser des typages moléculaires. La transmission du VIH se poursuit chez les homosexuels masculins. Les sous-types non-B circulent dans la population française. Les contaminations par VIH se poursuivent également dans la communauté africaine vivant en France.

O3
Présence du bocavirus humain (HBoV), un « nouveau » virus, dans les prélèvements respiratoires de jeunes enfants

Foulongne V¹, Olejnik Y¹, Rodière M², Segondy M¹

¹Laboratoire de virologie, CHU de Montpellier ; ²Service de pédiatrie III, CHU de Montpellier
<v-foulongne@chu-montpellier>

Les principales étiologies virales impliquées dans les infections respiratoires basses du jeune enfant sont le virus respiratoire syncytial (VRS), les virus influenza et parainfluenza, les adénovirus (AdV) et le métapneumovirus humain (hMPV). Toutefois, dans une proportion importante de pneumopathies, aucune étiologie virale n’est retrouvée avec les techniques actuelles. Une équipe suédoise a mis en évidence très récemment, grâce à une approche moléculaire originale, un nouveau virus respiratoire. Les analyses de séquence ainsi que l’organisation génomique de ce nouveau virus révèlent une proximité phylogénétique avec deux virus animaux, le parvovirus bovin (BPV) et le virus minute canin (MCV). Ces virus sont des membres du genre Bocavirus de la sous-famille des Parvovirinae, famille des Parvoviridae. Les auteurs ont donc proposé le nom de bocavirus humain (HBoV).
Il s’agit ici d’une étude rétrospective, sur une population d’enfants de moins de 5 ans hospitalisés pour une infection respiratoire basse. Son objectif principal est d’évaluer l’épidémiologie, la phylogénie et l’expression clinique du HBoV sur cette population.
Des prélèvements respiratoires conservés à – 80°C issus de l’ensemble des enfants hospitalisés sur une période de 1 an entre novembre 2003 et octobre 2004 ont été testés par PCR pour la présence du HBoV. Ces enfants étaient préalablement cliniquement renseignés et également testés pour la présence de la plupart des virus respiratoires par immunofluorescence, culture et PCR. Six cent deux prélèvements nasopharyngés ont été testés pour 589 enfants inclus. La prévalence des différents virus respiratoires était respectivement : VRS 28 %, hMPV 8,5 %, influenza 3 %, parainfluenza 1,5 %, adénovirus 1,4 %, entérovirus et rhinovirus 3 %. Le bocavirus humain a été détecté chez 26 enfants (4,4 %), ce qui est proche des prévalences décrites par Allander et al., ou encore Sloots et al. La médiane d’âge des enfants infectés par le HBoV est de 13 mois (4-43) avec un sex-ratio de 1,9. La médiane de durée d’hospitalisation est de 4 jours. Le HBoV fut détecté entre décembre et juin, suggérant donc une épidémiologie différente des virus respiratoires classiques et se rapprochant plus de celle constatée pour les adénovirus. Le HBoV fut détecté seul dans 17 prélèvements alors que, dans 9 prélèvements, nous observions une co-infection avec un autre virus (5 VRS, 2 AdV, 2 hMPV). L’analyse des séquences nucléotidiques de nos isolats de HBoV montre une grande homogénéité avec une conservation supérieure à 98 %. Cette forte homologie de séquence est également observée avec les deux souches de références ST1 et ST2, et cela au niveau aussi bien du gène NP1 (cible de la PCR de détection) que du gène VP2 codant pour la protéine de capside. L’analyse phylogénétique montre que l’ensemble des souches de HBoV appartient vraisemblablement à un seul génotype.
Les signes cliniques prédominants retrouvés chez les enfants infectés par HBoV sont essentiellement une toux, une dyspnée et une détresse respiratoire. Seule la moitié des enfants est fébrile. Les données biologiques associées (CRP, leucocytes) ne sont pas significativement perturbées. Les images radiologiques disponibles pour 18 enfants montrent surtout des signes de distension thoracique ou d’infiltration interstitielle. Les diagnostics retenus pour les enfants porteurs du HBov étaient essentiellement à type de bronchiolite ou d’asthme. De nombreux enfants présentaient des antécédents médicaux, notamment d’asthme ou d’épisode de bronchiolite. De plus, sept d’entre eux étaient prématurés.
Nous confirmons donc dans cette étude la présence du bocavirus humain dans les prélèvements respiratoires de jeunes enfants avec une possible implication non négligeable (environ 4 %) de ce nouveau virus comme agent pathogène respiratoire. Toutefois, devant le nombre important de co-infection que nous avons détectées (34,6 %), comme cela a également été rapporté par Allander et al. (17,6 %) et Sloots et al. (54,6 %), le rôle du bocavirus humain dans la pathogenèse des infections respiratoires mérite de plus amples études. Ces études devraient alors être conduites sur une population générale d’enfant afin d’affirmer le rôle exact de ce nouveau virus dans les infections respiratoires.

O4
Émergence de nouveaux sérotypes et de variants d’entérovirus à potentiel épidémique : exemple d’une épidémie de coxsackievirus A 24 variant

Leveque N, Cartet G, Lahlou-Amine I, Kabue JP, Dussard P, Norder H, Lina B, Chomel JJ

CNR des entérovirus, HCL, UMR CNRS 5537, Lyon ; Laboratoire de Virologie, Institut Pasteur de la Guyane ; Laboratoire de Microbiologie, Hôpital militaire d’Instruction Mohamed V, Maroc ; Laboratoire Polio de l’OMS, Université de Kinshasa, République Démocratique du Congo ; Département de Virologie, Swedish Institute for Infectious Disease Control, Suède
<nicolas.leveque@chu-lyon.fr>

La perspective de l’éradication des poliovirus entraîne un accroissement de la surveillance des entérovirus tant dans l’environnement qu’en pathologie humaine. Les techniques utilisées pour détecter puis identifier les différents sérotypes d’entérovirus se sont améliorées. L’apport considérable des techniques moléculaires permet, par des techniques consensus, de détecter l’ensemble des sérotypes connus. Toutefois, lorsqu’il s’agit de faire l’identification des souches cultivées ou détectées par RT-PCR, les outils de sérotypage (pool de Melnick) et de génotypage (séquençage des régions de la capside ou de la protéase 3C) ne permettent pas toujours de faire une identification certaine.
Depuis 2002, au moins 8 nouveaux sérotypes d’entérovirus ont été décrits (EV74, 75, 76, 77, 78, 89, 90 et 91), tous responsables de pathologies humaines parfois sévères comme des paralysies flasques par exemple. Ces nouveaux entérovirus ont été décrits en Afrique, mais aussi en Europe et en Amérique. Concomitamment, des souches variantes de sérotypes connus circulent abondamment, se substituant parfois aux sérotypes décrits initialement (CoxA24, CoxA16). Ces entérovirus variants sont capables de donner des épidémies massives, diffusant progressivement sur l’ensemble du globe. L’ensemble de ces nouveaux entérovirus échappe aujourd’hui à la caractérisation conventionnelle et n’est détecté que par la mise en place d’outils complémentaires, outils spécifiques souvent inadaptés pour les laboratoires de virologie conventionnels.
En 2003 et 2004, une épidémie de conjonctivite à entérovirus a été observée au Maroc (taux d’attaque 1 % de la population marocaine). Cette épidémie faisait suite à une épidémie observée en République démocratique du Congo (RDC). Pour ces deux épidémies, les entérovirus isolés n’étaient pas identifiés par les techniques de sérotypage utilisant les pools de Melnick. Le séquençage de la protéase 3C a permis d’identifier une souche variante pour laquelle un sérum spécifique a été développé au CNR. Ce sérum a permis l’identification de l’ensemble des virus isolés au cours des deux épidémies. L’analyse phylogénétique des virus isolés dans les deux pays et réalisée sur la base de la séquence de la protéase 3C a montré que ces deux groupes de virus étaient similaires. Ces souches étaient aussi très proches de celles isolées récemment en Asie puis aux Antilles et en Guyane. L’analyse épidémiologique complémentaire a confirmé une importation de la souche CoxA24v depuis la RDC vers le Maroc.
Cette épidémie confirme que des variants d’entérovirus émergent, qu’ils ont un réel potentiel épidémique avec un impact important, que ces virus ne sont pas identifiées par les techniques classiques et qu’ils ont tendance à se substituer aux souches d’origine. Les techniques de détection actuelles doivent être évaluées et éventuellement optimisées afin de permettre la détection et éventuellement la caractérisation de ces entérovirus émergents.

O5
Épidémiologie et variabilité génétique des rétrovirus HTLV1 en Mélanésie : étude dans les populations de l’archipel du Vanuatu

Cassar O^1,3, Capuano C², Bassot S³, Duprez R³, Walter H⁴, Abel M⁵, Chungue E¹, Martin PMV¹, Gessain A³

¹Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie, Nouméa ; ²OMS, Port Vila, Vanuatu ; ³Unité d’épidémiologie et physiopathologie des virus oncogènes, Département EEMI, Institut Pasteur, Paris ; ⁴Association pour la santé de la famille au Vanuatu, Port Vila ; ⁵Ministère de la Santé du Vanuatu, Port Vila ; 6) Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie
<ocassar@pasteur.fr>

Les virus de primates T lymphotropes (PTLV) appartiennent à la famille des Retroviridae qui comprend les rétrovirus humains (HTLV1, 2, 3 et 4) et leurs équivalents simiens (STLV1, 2 et 3). Le HTLV1 est l’agent étiologique de la leucémie/lymphome T de l’adulte (ATL), d’une neuromyélopathie chronique ou paraparésie spastique tropicale (TSP-HAM) et d’autres pathologies inflammatoires (uvéites, dermatite infectieuse). La grande stabilité génétique des HTLV1 et 2, liée principalement à leur mode de réplication qui s’effectue préférentiellement par expansion clonale des cellules infectées et peu par transcription inverse, peut être utilisée comme un marqueur des migrations des populations infectées [1]. Il existe plusieurs sous-types moléculaires viraux d’HTLV1 (A à F) spécifiques de régions géographiques données. Les souches virales isolées en Mélanésie (Papouasie Nouvelle-Guinée, îles Salomon et populations aborigènes d’Australie) sont parmi les plus divergentes et constituent le sous-type C [2].
En 2002, au cours d’une étude conduite dans l’archipel du Vanuatu, nous avons découvert la présence de variants moléculaires du sous-type C chez 4 femmes natives de l’île d’Ambae (nord-est du Vanuatu) [3]. Ces résultats préliminaires nous ont conduits à mener une enquête dans 10 îles de l’archipel, au cours de laquelle 2 438 individus (2 180 femmes et 258 hommes), moyenne d’âge 37 ans (5-87 ans) ont été prélevés. La recherche d’anticorps anti-HTLV1 a été réalisée par agglutination de particules et immunofluorescence et confirmée par western-blot chez 19 individus présentant des profils sérologiques complets (p19, p24, p28, GD21, rgp46-I). La séroprévalence globale est de 0,78 % (19/2438), augmente avec l’âge [(40 ans : 0,46 % versus 41 ans : 0,92 %] et présente d’importantes variations inter-îles (0-1,65 %). La comparaison des séquences nucléotidiques obtenues à partir d’un fragment de 522 pb de la gp21 (env) montre que ces 19 souches d’HTLV1 appartiennent toutes au sous-type C mélanésien et présentent une forte homologie entre eux (98,3-99,8 %).
Ces résultats confirment l’endémicité du HTLV1 au Vanuatu et suggèrent que ces souches mélanésiennes ont été introduites dans cet archipel lors de mouvements anciens de populations. Ces données virologiques et l’analyse de marqueurs génétiques, tels que l’ADN mitochondrial ou le chromosome Y actuellement en cours, permettront de mieux préciser l’origine des différentes populations de l’archipel du Vanuatu.

1. Gessain A, Gallo RC, Franchini G. Low degree of human T-cell leukemia/lymphoma virus type I genetic drift in vivo as a means of monitoring viral transmission and movement of ancient human populations. J Virol 1992 ; 66 : 2288-95
2. Gessain A, Yanagihara R, Franchini G, et al. Highly divergent molecular variants of human T-lymphotropic virus type I from isolated populations in Papua New Guinea and the Solomon Islands. Proc Natl Acad Sci USA 1991 ; 88 : 7694-8.
3. Cassar O, Capuano C, Meertens L, Chungue E, Gessain A. Human T-cell leukemia virus type 1 molecular variants, Vanuatu, Melanesia. Emerg Infect Dis 2005 ; 11 : 706-10

P6
Description de l’infection par le virus d’Epstein-Barr chez des patients atteints de carcinome indifférencié du nasopharynx

Dias M¹, Nunes R¹, Ferreira M¹, Magalhes M¹, Olias J¹, Mariame B²

¹Instituto Português de Oncologia, rua Professor Lima Basto, 1093 Lisboa Cedex ; (2) CPTP-U563 Inserm, CHU Purpan, BP3028, 31024 Toulouse Cedex 3.
<bernard.mariame@toulouse.inserm.fr>

Le carcinome indifférencié du nasopharynx (NPC) est une pathologie tumorale d’origine épithéliale associée de manière quasiment absolue au virus d’Epstein-Barr (EBV). Malgré le caractère ubiquitaire de ce virus, le NPC n’est fréquent que dans certaines parties du monde (sud de la Chine, Afrique du Nord et bassin méditerranéen, Alaska) et nous avons découvert qu’il était aussi fréquent au Portugal. Toutefois, peu de chose est connu sur les caractéristiques de l’infection virale chez les patients porteurs de cette tumeur. Récemment, plusieurs groupes ont décrit dans le sérum de ces patients la présence d’ADN viral libre dont la concentration semblait corréler avec le stade clinique de la tumeur. De ce fait, celle-ci a toujours été considérée comme la source de cet ADN. Notre but était donc de mieux caractériser l’infection chez ces patients en termes de souches virales et de vérifier l’origine de l’ADN viral sérique.
Nous avons purifié de l’ADN à partir d’échantillons de tumeur, de lymphocytes circulants et de sérum de 6 patients portugais porteurs d’un NPC, puis amplifié par PCR le 3^e exon du gène viral BNLF1. Ce gène a été choisi à cause de son très grand polymorphisme qui en fait un marqueur très précis et informatif. Les produits d’amplification ont ensuite été clonés et 3 à 8 clones par échantillon ont été séquencés. En parallèle, l’ADN viral a été dosé dans les sérums des mêmes patients et de témoins porteurs sains, par une technique de PCR semi-quantitative ciblant une séquence répétée du fragment BamHI-W du génome viral.
Les résultats des séquences confirment notre étude précédente mais apportent aussi des informations nouvelles, à savoir qu’au sein du même patient : 1) toutes les cellules tumorales sont infectées par un seul et même virus ; 2) plusieurs souches virales sont fréquemment détectées dans les lymphocytes circulants (ce qui est vrai aussi pour les témoins porteurs sains) ; 3) la souche présente dans la tumeur est toujours différente de celle(s) trouvée(s) dans les lymphocytes circulants ; 4) on trouve dans le sérum soit la souche de la tumeur, soit des souches présentes dans les lymphocytes, soit un mélange de souches provenant de la tumeur et des lymphocytes, soit encore des souches différentes de celles trouvées dans la tumeur ou dans les lymphocytes. Le dosage de l’ADN viral dans les sérums révèle une grande variabilité avec des valeurs comprises entre < 1 et > 100 copies par μL (les sérums des porteurs sains étant systématiquement négatifs). Les valeurs extrêmes corrèlent avec l’origine de l’ADN : présent en faible quantité, l’ADN viral est identique à celui trouvé dans les lymphocytes circulants alors que, lorsqu’il est présent à plus de 100 copies/μL, il est identique à celui trouvé dans les tumeurs.
Nos résultats suggèrent donc que, chez ces patients, la cellule épithéliale à l’origine de la tumeur n’a pas été infectée par un virus provenant des lymphocytes, cibles de la primo-infection. La question de l’origine du virus infectant les cellules tumorales reste donc entière. Par ailleurs, nos résultats montrent aussi que l’ADN viral présent dans le sérum ne provient pas toujours de la tumeur et qu’il doit donc exister un autre site de production qui reste à découvrir.

P7
Risque de transmission du lentivirus ovin par les biotechnologies de la reproduction

Pellerin JL, Cortez-Romero C, Fieni F

Unité propre soutien de programme 5301 DGER, Étude des risques sanitaires liés aux biotechnologies de la reproduction, École nationale vétérinaire, BP40706, 44307 Nantes Cedex 3
<pellerin@vet-nantes.fr>

Le lentivirus ovin provoque une pneumonie progressive (Maedi) et/ou une encéphalite (Visna) d’évolution lente et avec une longe période d’incubation [Carey et Dalziel, 1993 ; Watt et al., 1994 ; Martin, 1996 ; Cadoré et al., 1996]. Il possède une ADN polymérase-ARN dépendante (transcriptase inverse) et appartient à la famille des Retroviridae [Lin et Thormar, 1970].
La transmission du lentivirus ovin (MVV) par le transfert embryonnaire est une question toujours d’actualité. La Société internationale de transfert embryonnaire [IETS, Stringfellow et Seidel, 1990] recommande que les embryons avec zone pellucide intacte soient lavés 10 fois afin de prévenir les risques de transmission. Une étude réalisée par Woodall et al. (1994) chez des brebis, en appliquant les normes de l’IETS, n’a montré aucune preuve d’ARN viral, sur 16 embryons récoltés chez des brebis séropositives, avec une sensibilité de détection de 10 TCID50 par embryon. Mais cependant, chez la chèvre, Fieni et al. (2002) ont trouvé de l’ADN proviral spécifique du CAEV dans les cellules de lavages d’oviducte (11/25 chèvres infectées). Le risque de transmission par le transfert embryonnaire existe-t-il chez la brebis ?
Les échantillons d’ovaires nécessaires, à cette expérimentation, ont été prélevés chez 140 brebis de race Lacaune, provenant d’élevages du sud de la France. La détection de l’ADN proviral a été réalisée par nested-polymerase chain reaction (nested-PCR), pour la mise en évidence de l’ADN proviral, dans les cellules des tissus de l’appareil génital de la brebis. Les échantillons analysés par nested-PCR, pour la recherche d’ADN proviral du lentivirus ovin, sont considérés comme positifs lorsqu’une bande prédictive de 507 pb, correspondant à celle du témoin positif est visualisée, par électrophorèse sur un gel d’agarose, sous UV. La démonstration de la présence de l’ADN proviral du virus du Maedi-Visna dans les tissus de l’appareil génital, chez des brebis naturellement infectées, montre un risque de contamination in utero.

Cette étude montre, pour la première fois, que les cellules du cumulus oophorus sont infectées par le lentivirus ovin et apporte aussi des éléments appuyant le fait que l’ovocyte de brebis contaminé par le lentivirus ovin reste indemne d’infection virale. Cependant, il reste à étudier le mécanisme précis par lequel les ovocytes résistent à l’infection par le lentivirus ovin. Par ailleurs, nous avons démontré que l’élimination complète de l’ensemble des cellules du cumulus entourant les ovocytes, par un procédé enzymatique et mécanique, est une méthode efficace pour générer du matériel génétique indemne de lentivirus ovin, lequel pourrait être utilisé dans les différentes techniques de reproduction. Toutefois, la production d’embryons in vitro suivie par une procédure de transfert embryonnaire peut être utilisée pour introduire des éléments génétiques nouveaux dans un troupeau avec le minimum de risque possible de transmission d’une maladie. Enfin, cette conclusion devrait être confirmée in vivo sur un nombre significatif d’opérations de transferts d’embryons issus de FIV. La dernière étape de cette étude concerne la mise en évidence du rôle protecteur de la zone pellucide, autour de l’embryon, à l’infection par le lentivirus ovin et la recherche de la sensibilité des cellules embryonnaires à l’infection par le lentivirus ovin.

P8
Infection à VIH et grossesse : étude de 61 cas

Bon C¹, Givord F¹, Raudrant D (2), Mailliavin A¹, Pichot J¹

¹Service de biologie, Hôtel-Dieu, 69288 Lyon Cedex 02 ; (2) Service de gynécologie-obstétrique, Hôtel-Dieu, 69288 Lyon Cedex 02
<chantal.bon@chu-lyon.fr>

La transmission du virus de l’immunodéficience humaine (VIH), de la mère à l’enfant, est responsable de la majorité des cas de contamination pédiatrique, le passage du virus pouvant avoir lieu au cours de la grossesse, lors de l’accouchement ou juste après la naissance. La connaissance des mécanismes et des facteurs de risque de transmission a permis la mise en place de mesures préventives afin d’éviter la contamination de l’enfant. Le but du travail a été d’étudier l’évolution des moyens thérapeutiques de prise en charge des patientes enceintes séropositives, grâce à une étude de cas, réalisée sur une durée de 10 ans, en collaboration avec le service de gynécologie-obstétrique de l’Hôtel-Dieu de Lyon (D. Raudrant).
Entre les années 1990 et 2000, la sérologie VIH a été confirmée positive pour 61 patientes, suivies pour surveillance de leur grossesse. Par étude des dossiers cliniques, des informations ont pu être recueillies concernant les mères, le déroulement de la grossesse, les thérapeutiques mises en place, la contamination éventuelle de l’enfant.Au cours de la période étudiée, le nombre d’accouchements par an de femmes séropositives a régulièrement augmenté : très faible au début des années 1990 (environ 1 par an), il atteint 12 en 1999 et 15 à partir de 2000. Les mères étaient d’origine française dans 35,4 % des cas et d’origine africaine dans 45,8 % des cas. L’âge maternel moyen était de 30,4 ans (19 à 41 ans). La séropositivité maternelle était connue et ancienne dans 74 % des cas alors que, dans 23 % des cas, elle a été découverte au cours de la grossesse en cours. Les femmes auraient été contaminées soit par voie hétérosexuelle (24,9 % des cas), soit par toxicomanie (6,3 % des cas), soit par voie iatrogène (6,3 % des cas) ; le mode de contamination demeure inconnu dans 62,5 % des cas. Une coinfection virale (VIH-VHC, VIH-VHB, VIH-CMV) était présente chez environ 32 % des patientes.
La durée moyenne de gestation a été de 38 semaines d’aménorrhée (SA) (de 32 SA + 2 jours à 41 SA + 2 jours). Des pathologies gravidiques ont été rencontrées chez 65,6 % des patientes, soit complications obstétricales (menace d’accouchement prématuré, retard de croissance intra-utérin), soit complications infectieuses (fongiques ou bactériennes). Un traitement antirétroviral a été administré à la mère, soit tout au long de la grossesse (trithérapie) pour diminuer la charge virale, soit seulement au 3^e trimestre.
À partir de 1994, une perfusion d’AZT, associée éventuellement à la névirapine, a été pratiquée au moment de l’accouchement. C’est également à partir de 1994 que la césarienne programmée a été faite systématiquement. Chez l’enfant, une thérapeutique antirétrovirale est administrée en phase post-natale, le traitement par AZT demeurant le traitement de référence. Dans la série étudiée, seuls deux cas de contamination confirmée de l’enfant ont été constatés ; il s’agit de deux enfants de la même mère.
Dans les pays industrialisés, l’utilisation des antirétroviraux au cours de la grossesse, la pratique d’une césarienne programmée à 38 SA, ainsi que la suppression de l’allaitement maternel, ont contribué à la spectaculaire diminution du taux de transmission du VIH de la mère à l’enfant, estimé actuellement entre 1 et 2 %. Cependant, le risque d’infection persiste encore et la toxicité potentielle des antirétroviraux nécessite un suivi à long terme des enfants exposés.

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Séroprévalence de l’infection à HHV8 chez des donneurs de sang et chez des sujets HIV-positifs dans le centre tunisien

Hannachi N¹, Ferjani A¹, Mhalla S¹, Gandouz R², Skouri H², Boukadida J¹

¹Laboratoire de microbiologie-immunologie, UR 16/02 CHU F. Hached Sousse TN ; ² Centre de transfusion sanguine CHU Sahloul, Sousse, Tunisie
<nhannachi@lycos.com>

Le but du travail était de déterminer la séroprévalence du HHV8 dans un échantillon de donneurs de sang et un échantillon de patients VIH-positifs.
On a recueilli 50 sérums de donneurs de sang de sexe et d’âge différents et 50 sérums de patients VIH-positifs chez qui les charges virales ont été déterminées. Les anticorps dirigés contre les protéines virales lytiques du HHV8 ont été détectés par immunofluorescence indirecte.
La séroprévalence des anticorps anti-HHV8 chez les donneurs de sang était de 14 %. Les patients HHV8-séropositifs étaient tous de sexe masculin avec une moyenne d’âge de 26 ans. La séroprévalence HHV8 était plus importante dans l’échantillon des patients VIH-positifs (54 %). Nous n’avons pas noté de corrélation entre le statut HHV8 et la charge virale VIH.
Comme les pays du bassin méditerranéen, la Tunisie est de forte endémie pour le HHV8. La forte prévalence chez les sujets séropositifs pour le VIH suggère que la transmission sexuelle est un mode d’infection important dans notre région. Il serait intéressant d’étudier cette prévalence chez les enfants.

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Évolution de la prévalence des différents génotypes du virus de l’hépatite C en Indre-et-Loire sur douze années (1994-2005)

Fournier M¹, Gaudy C^1,2 Dubois F^1,2, Barin F^1,2, Goudeau A^1,2

^1}Laboratoire de bactériologie-virologie, CHU Bretonneau, Tours ; ²EspriI Inserm EA 3856, Faculté de Médecine, Université François Rabelais, Tours.
<gaudy–c@med.univ-tours.fr>

Le virus de l’hépatite C (VHC) est caractérisé par sa grande variabilité génétique. Le manque de fonction correctrice de son ARN polymérase ARN dépendante en est en partie la cause. L’analyse phylogénétique de souches virales de VHC isolées dans les cinq continents a permis d’identifier six génotypes principaux et un grand nombre de sous-types.
Le but du travail était d’étudier l’évolution de la prévalence des différents génotypes du VHC détectés dans la région de Tours (Indre-et-Loire) sur les douze dernières années (1994-2005). Le génotype a été réalisé avec la technique Innolipa HCV^® (Innogenetics), technique utilisée pour le diagnostic de routine au laboratoire de virologie du CHU Bretonneau de Tours. Cette méthode repose sur l’amplification de la région 5’NC (région non codante du génome du VHC) suivie d’une hybridation avec des sondes nucléotidiques spécifiques des différents types et sous-types. Depuis 1994, 1 663 souches ont été génotypées au sein du laboratoire, avec une moyenne de 139 déterminations par an.
Sur ces deux dernières années (2004-2005), 267 génotypages ont été réalisés. La répartition suivante est retrouvée : génotype 1 (51,7 %), génotype 2 (10,5 %), génotype 3 (23,2 %), génotype 4 (8,6 %), génotype 5 (1,9 %). Précisons que 4,1 % des génotypes n’ont pu être déterminés par la technique d’hybridation inverse.
Depuis 1994, le génotype 1 reste majoritaire, représentant toujours plus de 50 % des génotypes circulants en Indre-et-Loire. Parmi toutes les souches de génotype 1, 698 ont pu être sous-typés (231 sous-types a, 467 sous-types b).
Depuis ces douze dernières années, une augmentation de la prévalence du génotype 4 est constatée. En 1996-1997, il représentait moins de 4 % des souches de VHC circulantes contre 9 % en 2004-2005. Ces résultats suivent la tendance nationale puisque la prévalence s’est élevée en France de 4,5 % en 1989 à environ 10 % actuellement. Cette augmentation est liée à la diffusion de souches de génotype 4 chez les usagers de drogue. Après séquençage et analyse phylogénétique portant sur la région NS5B, nous avons constaté que les sous-types 4a et 4d circulaient majoritairement, les sous-types 4f et 4k étant retrouvés plus rarement. L’analyse détaillée des modes de contamination associées à ces infections par des souches de génotype 4 sera présentée.
La prévalence du génotype 5 reste faible, fluctuant entre 2 et 4 % depuis 1994. Le nombre de génotypes « indéterminés » avec la technique Innolipa HCV^® varie d’une année à l’autre. Ces deux dernières années, 4,1 % des génotypes n’ont pu être déterminés avec la technique InnoLipa HCV^®. Dans cette situation, le séquençage de la région NS5B suivi d’une analyse phylogénétique avec des souches de référence s’impose.

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Dynamique temporelle de l’infection de colonies de chauves souris Myotis myotis par les lyssavirus

Amengual B¹, Serra-Cobo J², Abellan C³, Bourhy H¹

¹Unité postulante de recherche et d’expertise Dynamique des lyssavirus et adaptation à l’hôte. Institut Pasteur. 25, rue Docteur-Roux. 75015 Paris ; ²Instituto Pirenaico de Ecologϊa (CSIC), av. Montañana, 177, apdo. 202, 50080 Zaragoza and Department de Biologia Animal, Universitat de Barcelona, av. Diagonal 645, 08028 Barcelona, Epagne ; ³ Ministerio de Sanidad y Consumo. Dirección General de Salud Pública. Paseo del Prado, 18-20, 28071 Madrid, Espagne.
<blanca@areambiental.com>

La rage est une zoonose due à l’infection par les lyssavirus. Ces virus neurotropes infectent l’homme et de nombreuses autres espèces de mammifères. Les chauves-souris, qui comportent de nombreuses espèces (plus de 1000), ne font pas exception. Six parmi les 7 génotypes de lyssavirus décrits infectent les chauves-souris. En Europe, 773 cas de rage ont été identifiés ches les chauves-souris de 1977 à 2004 (http ://www.who-rabies-bulletin.org). Des études moléculaires distinguent 2 génotypes de lyssavirus parmi les chauves-souris européennes, les génotypes 5 et 6 correspondant respectivement à European Bat Lyssavirus 1 (EBLV1), et à EBLV2. Quatre cas humains (2 dus à EBLV1 et 2 dus à EBLV2) ont été répertoriés depuis 1985. Cette enzootie rabique atteint de nombreux pays européens. L’écologie de l’infection des chauves-souris par les lyssavirus en Europe fut initiée il y a une vingtaine d’années. Cependant la dynamique de l’infection dans les colonies et ses implications restent encore aujourd’hui inconnues.
Ce travail présente les résultats d’un suivi longitudinal d’un écosystème localisé dans les îles Baléares durant 9 ans. De 1995 à 2003, 530 sérums analysés par séroneutralisation, 308 culots de sang et 17 cerveaux analysés par RT-PCR ont été obtenus à partir de deux colonies de Myotis myotis. Un modèle épidémiologique simple à trois classes a été utilisé pour décrire la dynamique de l’infection par EBLV1 au sein de ces colonies. Il démontre le caractère cyclique de l’infection par EBLV1 correspondant à des variations périodiques du nombre de chauves-souris sensibles, immunes et infectées. Après l’introduction du virus dans la colonie, la périodicité des cycles décroît progressivement jusqu’à ce qu’un équilibre soit atteint entre les différentes classes de la population. Des sessions de capture-recapture de chauves-souris baguées (n = 1079) ont aussi permis de déterminer la taille des colonies et de mesurer la mortalité apparente selon les modèles de Cormak-Jolly-Seber. Ces études montrent que l’infection des chauves-souris Myotis myotis par EBLV1 est caractérisée par un taux basique de reproduction faible (Ro = 1,69) et une période infectieuse (6,9 jours) comparable à celle des autres espèces de carnivores non volants. Cependant la proportion élevée de chauves-souris immunes (environ 60 %), l’absence de symptômes et surtout l’absence de mortalité suite à l’infection différencie l’infection des Myotis myotis par EBLV1 de celle observée chez les autres espèces animales. Cela démontre que la circulation de lyssavirus dans une population animale n’est pas systématiquement associée à la mort des animaux infectés, en particulier chez les chauves-souris.

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Évolution génotypique des Pneumovirinae humains : virus respiratoire syncytial et métapneumovirus

Freymuth F, Vabret A, Dina J, Legrand L, Leroux M, Cuvillon D, Gouarin S, Petitjean J, Brouard J

Laboratoire de virologie humaine et moléculaire et Service de pédiatrie, CHU Caen
<freymuth-f@chu-caen.fr>

Le virus respiratoire syncytial (VRS) humain et le métapneumovirus humain (hMPV) sont des agents majeurs de la bronchiolite du nourrisson. Cette maladie est en augmentation régulière et il pourrait exister un lien avec une évolution de la structure génétique virale. Le but de cette étude est de comparer l’évolution dans le temps des génotypes G du VRS humain groupes A et B, et des génotypes M du hMPV.
Trois cent cinquante-trois souches de VRS A, 135 souches de VRS B ont été obtenues d’aspirations nasales (AN) d’enfants hospitalisés. Les VRS A proviennent des hivers 1986-1987, 1991-1992, 1993-1994, 1995-1996, 1997-1998 et de ceux de 1999-2000 à 2003-2004 ; les VRS B sont isolés au cours des hivers de 1999-2000 à 2003-2004. 88 AN positives pour le hMPV ont été obtenues au cours des hivers de 2000-2001 à 2003-2004. L’ARN viral est extrait, soit des cultures MRC5 infectées pour le VRS, soit directement des AN pour le hMPV. Pour le VRS on utilise une RT-PCR nichée. Les amorces sont situées dans l’ectodomaine du gène G (nucléotides correspondant aux acides aminés 88 à 186 pour le VRS A et 57 à 170 pour le VRS B). Les amorces de la première PCR sont VGE1 (5’GGG CAA ATG CAA ACA TGT CCA AA 3’] et VGE2 [5’ATC ACT GAA GAA TTT TA 3’) [Zambon MC, Lancet, 2001]. Les amorces de la PCR nichée sont Sg2 (5’ACA AGA TGC AAC AAG CCA GAT CA 3’) et Sg3 (5’CCT GCT GGG CTA TCT GCA AAA G 3’). Pour le VRS B, ce sont VGI1 (5’TTG CAA TGA TAA TCT CAA C 3’) et VGI2 (5’TTT GAA GTG TTC AAC TT 3’) [Zambon MC, Lancet, 2001 ; 358 : 1410-6]. Une PCR semi-nichée est utilisée pour amplifier le gène de la protéine M du hMPV. Les premières amorces ont été récemment publiées : hmpv1 (CCCTTTGTTTCAGGCCAA) et hmpv2 (GCAGCTTCAACAGTAGCTG) et l’amorce semi-nichée est (AGGCCAACACACCACCAG) [Bellau-Pujol S. J Virol Meth 2005]. Après séquençage des amplicons, l’analyse phylogénétique est faite à l’aide de la méthode du neighbor-joining et du logiciel PAUP 4.0b10.
L’analyse phylogénétique des 353 VRS du groupe A révèle 7 clusters, qui sont Ga1, Ga2, Ga3, Ga4, Ga5, Ga6, Ga7. Les clusters Ga1 to Ga5 contiennent 14 à 149 souches. La plupart des VRS A sont des génotypes Ga4 et Ga2 : 42,2 % et 37,1 % respectivement. Plusieurs génotypes circulent dans chaque épidémie et 2 dominent dans 8 des 10 épidémies. Dans les 5 épidémies successives, de 1999 à 2003, les génotypes dominants sont les mêmes, Ga2 et Ga4. Sur de plus longues périodes, de 1986 à 2003, certains génotypes disparaissent (Ga1 et Ga3), tandis que d’autres émergent (Ga2 par exemple). Le génotype Ga4 est présent tout au long de la période d’étude. L’analyse phylogénétique des 135 VRS du groupe B révèle 6 clusters, qui sont Gb1, Gb2, Gb3, Gb4, Gb5, Gb6. Trois clusters sont les plus fréquents sur les 5 hivers de l’étude : Gb1, Gb2, Gb6. Plusieurs génotypes cocirculent dans chaque épidémie, mais un génotype est dominant dans 4 des 5 épidémies. Pour le hMPV il a été décrit dans le gène F, 2 groupes A et B comprenant chacun 2 sous-groupes A1 et A2, B1 et B2 [Boivin G. Emerg Inf Dis 2004 ; 10 : 1154]. Notre étude retrouve cette diversité dans le gène M. Elle montre aussi le changement progressif des génotypes circulants. Au cours des 4 hivers successifs, les génotypes de hMPV sont 7 A1 en 2000-2001, 17 A1 et 2 A2 en 2001-2002, 39 A2 et 1 B1 en 2002-2003 et 4 A1, 6 A2, 4 B1 et 8 B2 en 2003-2004.
Comme cela a déjà été suggéré dans d’autres infections virales respiratoires, l’évolution moléculaire des génotypes G du VRS et des génotypes M du hMPV suggère l’existence de changements progressifs dans la structure (et peut être la fonction) de certains gènes (et des protéines correspondantes) en relation avec la pression de sélection immunitaire.

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Caractéristiques d’isolats français récents d’influenzavirus aviaires faiblement pathogènes appartenant à divers sous-types H5

Cherbonnel M¹, Lamande J¹, Allee C¹, Schmiz A¹, Ogor K¹ Le Gall-Reculé G¹, Guillemoto C¹, Pierre I¹ Le Bras MO¹, Morin Y², Amelot M², Picault JP¹, Jestin V¹

Afssa, Agence française de sécurité sanitaire des aliments, Laboratoire d’étude et de recherche avicole et porcine, BP53, 22440 Ploufragan ; ¹Laboratoire national de référence pour l’Influenza aviaire et la maladie de Newcastle, Unité de virologie, d’immunologie et de parasitologie aviaires et cunicoles ; ²Service d’élevage et d’expérimentation en pathologie aviaire.
<m.cherbonnel@ploufragan.afssa.fr>

Plusieurs dispositifs complémentaires permettent d’exercer, au plan vétérinaire, une surveillance des infections à influenzavirus aviaires (de sous-types H5 et H7 en particulier) chez les volailles et les oiseaux sauvages. Dans ce cadre, six isolats (1 H5N1, 3 H5N2 et 2 H5N3) provenant de volailles infectées obtenus entre fin 2002 et début 2005, dans l’ouest de la France (Fr), ont fait l’objet d’une caractérisation approfondie. Leur pathogénicité pour les volailles a d’abord été évaluée selon les standards internationaux in vivo et in vitro. Tous les 6 isolats sont faiblement pathogènes avec un indice de pathogénicité par voie intraveineuse de 0 et l’absence d’acides aminés multibasiques au niveau du site de clivage de l’hémagglutinine.
L’étude a été poursuivie au plan génétique par le séquençage et la caractérisation de la lignée d’appartenance des 8 gènes viraux, l’étude phylogénique des gènes H5, N1, N2 et N3, l’établissement des caractéristiques des divers marqueurs de virulence et de passage de la barrière d’espèce disséminés sur les différents gènes. Les 4 virus dont les 8 gènes ont été caractérisés (isolats de début 2005) sont intégralement aviaires. Les gènes H5 des 6 isolats appartiennent à la lignée eurasienne, mais sont différents des gènes H5 des virus asiatiques, H5N1 HP notamment ; ces mêmes gènes H5 Fr présentent une homologie de 89,7 à 97,7 % et se distribuent en plusieurs sous-groupes ; de plus, ils ne présentent pas de sites additionnels de glycosylation. Ces propriétés suggèrent plusieurs introductions différentes du virus et non pas la circulation d’une souche dominante. Le gène de la neuraminidase N1 est proche de celui d’un virus italien aviaire H7N1 responsable de l’épizootie de 1999-2000 mais, contrairement à celui-ci, il ne possède pas de délétion. Le pourcentage d’homologie entre ces deux gènes, hors zone délétée, est de 96,3 %. Concernant les trois gènes de la neuraminidase N2, seul l’isolat récolté en 2003 de poulets possède une délétion. Le pourcentage d’homologie entre les trois gènes, hors zone délétée, est compris entre 90,8 et 91,4 %. Une des deux souches isolée de canards se place dans un groupe formé par une souche isolée d’un faisant en Irlande en 1997 et de trois souches françaises isolées en 2000 et 2002 de canards sentinelles placés dans des zones situées sur les couloirs de migration Manche-Atlantique et Rhin-Rhône. Les trois isolats se regroupent dans un grand ensemble comprenant les souches aviaires eurasiennes et nord-américaines ainsi que des souches humaines et porcines. Ce groupe est cependant distinct de celui constitué des souches H9N2 isolées à Hong Kong et au Pakistan à partir de 1997. L’étude phylogénique des gènes N3 est en cours de réalisation.
Au plan antigénique, ces souches ont été aussi comparées entre elles et avec des souches de référence par inhibition croisée de l’hémagglutination. Des évolutions et des différences sont observées ; leurs implications en termes de choix des antigènes pour les enquêtes sérologiques nationales et européennes sont soulignées.
Enfin, le tropisme respiratoire et/ou digestif de certains de ces isolats a été précisé après infection expérimentale de canards.
Ces données sont très utiles pour surveiller, au plan de la santé animale et de la santé publique, l’évolution des virus de sous-types H5 susceptibles de circuler en France et choisir de manière pertinente une souche vaccinale, dans l’hypothèse où cette option serait retenue pour protéger certaines productions avicoles plus réceptives.

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Transmission intrafamiliale d’une hépatite E en France

Ducancelle A¹, Payan C², Nicand E³, Le Guillou H¹, Cales P⁴, Lunel-Fabiani F¹

¹Laboratoire de bactériologie-virologie, CHU Angers ; ²Laboratoire de bactériologie-virologie, CHU Brest ; ³Laboratoire de biologie clinique, CNR virus des hépatites à transmission entérique, Hôpital d’Instruction des Armées Val-de-Grâce, Paris ; ⁴Service d’hépatologie et de gastro-entérologie, CHU Angers.
<alexandra.ducancelle@wanadoo.fr>

L’infection par le virus de l’hépatite E (VHE) est endémique dans les pays en voie de développement où elle est responsable d’une mortalité importante, notamment chez la femme enceinte. Elle est responsable de cas sporadiques dans les pays industrialisés chez les voyageurs de retour de zones d’endémie. Des cas autochtones chez des patients n’ayant jamais séjourné à l’étranger ont été récemment décrits. Nous rapportons trois cas familiaux d’hépatite aiguë E dont l’évolution a été favorable.
En octobre 2004, un homme (cas index), âgé de 41 ans, s’est présenté aux urgences du CHU d’Angers pour ictère, prurit et asthénie. Le bilan biochimique réalisé à l’admission a révélé une cytolyse hépatique majeure (transaminases 100 N) associée à une cholestase. Le diagnostic d’une hépatite E a été évoqué devant la négativité des sérologies des hépatites A, B et C et des sérologies des herpès virus (cytomégalovirus et virus d’Epstein-Barr). Une recherche des IgG et des IgM anti-VHE a été entreprise sur des sérums prélevés entre octobre 2004 et mars 2005 chez le cas index et les cas contacts (la femme et deux enfants). Parallèlement à l’étude sérologique, la détection de l’ARN du VHE par une méthode de PCR en temps réel a été réalisée sur des prélèvements séquentiels de plasma et de selles.
Une forte réactivité des IgG anti-VHE a été détectée, chez le cas index, dès le quatorzième jour après le début des symptômes cliniques. La séroréactivité des IgG a persisté pendant plus de 5 mois après l’épisode aigu, alors que les IgM anti-VHE et les marqueurs virologiques étaient restés négatifs (ARN-VHE négative dans les selles et virémie faiblement positive sur un seul échantillon). En octobre 2004, l’épouse (cas contact 1) s’est plainte d’une asthénie. Le bilan biochimique réalisé a montré une cytolyse hépatique modérée. Malgré l’absence des marqueurs sérologiques, l’ARN-VHE a été détecté précocement dans le sérum et les selles suggérant une infection débutante. La réactivité des IgG est restée importante pendant plus de 4 mois alors que l’ARN du VHE est devenu indétectable. L’un des enfants, âgé de 5 ans (cas contact 2), a présenté de la fièvre, une asthénie et une anorexie. Les anticorps anti-VHE et l’ARN sérique du VHE ont été positifs dès l’apparition des signes cliniques alors que les transaminases étaient subnormales. L’excrétion du virus dans les selles a été transitoire. L’autre enfant, âgé de 1 an (cas contact 3), qui présentait une fièvre intermittente, n’a pas développé d’anticorps anti-VHE et l’ARN du VHE était indétectable dans le plasma et les selles. L’interrogatoire médical a permis d’identifier deux facteurs de risque dans la transmission du VHE : la consommation de coquillages lors d’un séjour en Vendée 2 mois avant l’apparition des symptômes cliniques et une baignade dans le lac Saint-Ferréol situé dans le sud-ouest de la France.
Les données suggèrent qu’il existe probablement une circulation du virus de l’hépatite E en France. Ainsi, devant toute hépatite aiguë avec marqueurs sérologiques des hépatites A, B et C négatifs, le diagnostic d’hépatite E doit être évoqué. Dans notre étude, le mode de contamination n’est pas clairement établi. Il peut s’agir soit d’une contamination orofécale simultanée de tous les membres de la famille, soit d’une transmission intrafamiliale à partir du cas index. Même si la transmission par contact direct est rarement observée dans l’hépatite E, l’excrétion du virus dans les selles, notamment chez les cas contacts, a pu contribuer à maintenir la circulation du virus au sein de la famille. Plusieurs cas autochtones d’hépatite E ont été récemment décrits sans que le mode de contamination n’ait été clairement établi, ce qui suggère que le VHE est un virus émergent en France.

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Épidémie, persistance et dissémination d’une souche de virus de l’hépatite A de génotype III en France

Mackiewicz V¹, Roque-Afonso AM¹, Cotterel B², Lebraud P¹, Santa-Ollala P³, Henquell C⁴, Delarocque-Astagneau E³, Dussaix E¹

¹Centre national de référence du virus de l’hépatite A, Laboratoire de virologie, hôpital Paul Brousse, AP-HP, Villejuif ; ²Cellule interrégionale d’épidémiologie, DRASS Auvergne, Clermont-Ferrand ; ³Institut national de veille sanitaire, Saint-Maurice ; ⁴Laboratoire de virologie, CHU de Clermont-Ferrand, Clermont-Ferrand
<vincent.mackiewicz@pbr.ap-hp.fr>

Au mois de novembre 2004, 6 cas d’infections par le virus de d’hépatite A (VHA) ont été notifiés dans une école primaire du centre de la France. La Cellule interrégionale d’épidémiologie Auvergne et le Centre national de référence du VHA ont mené une étude pour préciser l’étendue de cette épidémie et mettre en évidence l’origine de ces cas groupés. De juin à décembre 2004, 18 diagnostics d’hépatite A aiguë ont été réalisés dans les laboratoires d’analyses du secteur par mise en évidence d’IgM anti-VHA dans le sérum. Quinze des sera correspondaient à des cas épidémiques et 3 à des cas préépidémiques. L’ARN du VHA a été recherché dans ces 18 sera après extraction et amplification de la région conservée 5’ non codante et de la région variable VP1-2A. Une étude phylogénétique des séquences VP1-2A obtenues a été réalisée. L’ARN du VHA a été détecté dans 12/15 sera de l’épidémie et dans 3/3 sera préépidémiques. Pour les 15 souches détectées, un fragment de 416 pb de la région VP1-2A a été analysé. Toutes les souches étaient totalement identiques entre elles et correspondaient à un VHA de génotype IIIA. Une des souches préépidémiques provenait d’une personne revenue d’un séjour à Madagascar en juin 2004 et qui habitait le même village où est survenue l’épidémie. Les souches de génotype IIIA, déjà étudiées par le CNR à partir de cas isolés de retour de zone d’endémie (Inde, Pakistan et Madagascar), se sont montrées différentes de la souche épidémique. Par la suite, entre février et juillet 2005, 9 souches de VHA, isolées dans la région Auvergne, se sont montrées totalement identiques à la souche épidémique. Enfin en octobre 2005, 2 souches isolées dans les villes de Limoges et Angers se sont révélé être également identiques à la souche épidémique. C’est la première description d’une épidémie de VHA de génotype IIIA en France. La personne revenue de Madagascar est probablement le cas index ayant introduit cette souche en France, sa souche étant identique à l’ensemble des souches isolées par la suite. La surveillance des souches circulant sur le territoire national a permis de montrer la persistance et la dissémination de cette souche exotique. L’étude de cohorte rétrospective concernant l’épidémie et la persistance à long terme de cette souche sont en faveur d’une transmission interpersonnelle. Cette description souligne la susceptibilité de la population générale française vis-à-vis du VHA. La mise en place prochaine de la déclaration obligatoire de l’hépatite A permettra de mieux cerner l’épidémiologie du VHA en France et de guider le cas échéant un changement de politique vaccinale.

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L’impact de co-infections virales dans l’évolution clinique des nourrissons atteints des bronchiolites graves

Komurian-Pradel F¹, Richard N², Perret M¹, Rajoharison A¹, Billaud G³, Lina B³, Vernet G¹, Floret D², Paranhos-Baccala G¹

¹bioMérieux, Département de Pathogènes émergents, IFR 128 BioSciences Lyon-Gerland, Lyon ; ²Département de pédiatrie, Hôpital Édouard-Herriot, Lyon ; ³Laboratorie de virologie, Domaine Rockefeller, Hospices Civils, Lyon
<baccala@cervi-lyon.inserm.fr>

Les infections aiguës respiratoires d’origine virale sont responsables d’une forte mortalité et morbidité chez le jeune enfant. Une étude épidémiologique rétrospective, pendant les deux dernières saisons hivernales, a été réalisée chez 180 nourrissons hospitalisés dans les services d’urgence (n = 88) et de réanimation pédiatrique (n = 92). Des techniques de biologie moléculaire (NASBA, multiplex-RT-PCR et PCR) et cellulaire ont été utilisées pour diagnostiquer le virus syncytial respiratoire (VRS) A et B, le virus de la grippe A et B, le rhinovirus (RV), l’adénovirus (ADV), l’entérovirus (EV), les parainfluenza (PIV) 1, 2, 3 et 4 (A et B), le métapneumovirus humain (hMPV) et les coronavirus humains (hCoV) NL63, OC43, 229E dans les sécrétions nasopharyngées. Les paramètres cliniques, les facteurs de risque et la prévalence virale ont été comparés chez les enfants admis ou non en réanimation. Les résultats ont montré que l’âge à l’admission, la prématurité, la grossesse gémellaire et la malacie représentaient un facteur de risque pour l’admission dans le service de réanimation. Parmi les 180 échantillons examinés, seulement 2 restent sans diagnostic. Les tests moléculaires sont beaucoup plus sensibles que la culture cellulaire et permettent un rattrapage d’environ 30 % d’échantillons restés négatifs après diagnostic par culture cellulaire. Aucune différence significative n’a été observée au niveau de la répartition et de la prévalence virale entre les deux populations étudiées. VRS et RV sont les virus les plus fréquemment détectés dans les deux populations. Nous avons également détecté, mais avec un pourcentage moins élevé, le PIV3, le hMPV, le hCoV-NL63, l’ADV et le virus de la grippe A. De façon intéressante, les co-infections virales diffèrent significativement entre les enfants hospitalisés en service d’urgences et en réanimation (p = 0,005 avec le test du chi2). Cependant, aucune différence entre les mono et co-infections virales n’est observée en ce qui concerne les paramètres cliniques (durée de ventilation et d’oxygénation, durée d’hospitalisation, hyponatrémie, surinfection, transfusion, échec d’extubation) au sein de la population admise en réanimation.
En conclusion, la co-infection virale est un facteur de risque d’hospitalisation en réanimation pédiatrique chez le nourrisson souffrant de bronchiolites.

Interaction virus-cellule 1

Jeudi 20 avril 2006, 14 h à 15 h 15

Communications orales O17 à O21
Communications affichées P22 à P45

O17
Caractérisation des voies de signalisation impliquées dans l’apoptose induite par le poliovirus dans des cellules humaines d’origine neuronale

Autret A¹, Martin-Latil S¹, Wirotius A¹, Petit F², Mousson L¹, Arnoult D², Estaquier J², Colbère-Garapin F¹, Blondel B¹

¹Laboratoire des virus entérotropes et stratégies antivirales, Institut Pasteur, ²5 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; ²Unité de recherche et d’expertise physiopathologie des infections lentivirales, Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15.
<autret@pasteur.fr>

Le poliovirus (PV), l’agent étiologique de la poliomyélite paralytique aiguë (PPA), est un entérovirus de la famille des Picornaviridae. La PPA se caractérise par des paralysies flasques dues à la destruction des neurones moteurs de la moelle épinière suite à la multiplication du PV. La destruction des motoneurones pourrait être associée à un processus apoptotique, comme cela a été démontré dans un modèle murin [Girard S. et al, J Virol, 1999]. Le laboratoire a montré que les interactions du PV avec son récepteur cellulaire (CD155) peuvent moduler l’apoptose viro-induite [Gosselin AS. et al, J Virol, 2003], et ainsi jouer un rôle dans le maintien et/ou l’établissement d’infections persistantes du PV dans des cellules d’origine neuronale (cellules de neuroblastome). Notre objectif est de caractériser les voies de signalisation proapoptotiques induites par le PV dans ces cellules (lignée IMR5).
L’apoptose viro-induite a été mise en évidence en analysant la condensation chromatinienne et la chute du potentiel transmembranaire mitochondrial par cytométrie en flux. Les protéines engagées dans la signalisation proapoptotique ont ensuite été étudiées en immunoprécipitation et en western immunoblot après fractionnement subcellulaire. Les molécules impliquées dans l’apoptose ont également été caractérisées par des techniques d’immunofluorescence indirecte.
Nos résultats indiquent que la voie apoptotique mitochondriale est impliquée dans l’apoptose des cellules IMR5 induite par le PV. Nous avons notamment mis en évidence un dysfonctionnement mitochondrial, associé à une libération du cytochrome C apoptogène. De plus, la caspase 9 initiatrice et la caspase 3 exécutrice sont activées au cours de l’infection par le PV. Nous avons également montré que l’activation de la voie mitochondriale est Bax-dépendante. Enfin, nos résultats suggèrent que la molécule proapoptotique BH3-only BimEL (Bcl2-interacting mediator of cell death extra-long), qui est séquestrée dans les cellules saines au niveau des microtubules du cytosquelette, par son interaction avec la dynéine, est libérée dans le cytosol suite à l’infection par le PV.
Ce résultat est particulièrement intéressant car la dynéine interagit également avec la région intracytoplasmique de CD155. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse que BimEL pourrait être libérée dans le cytosol suite à l’interaction du PV avec CD155. La protéine BimEL pourrait ainsi activer la molécule proapoptotique Bax indirectement, en séquestrant la molécule anti-apoptotique Bcl2, mais également directement en interagissant avec Bax [Hutcheson J. et al., J Exp Med, 2005].
En conclusion, nos travaux sur les voies de signalisation apoptotique induite par le PV dans les cellules de neuroblastome devraient nous permettre de mieux comprendre le rôle de BimEL, impliquée dans notre modèle. Par ailleurs, la protéine proapoptotique BimEL étant surexprimée dans les neurones du SNC [Putcha GV et al. Neuron, 2001], cette étude pourrait également contribuer à révéler les voies spécifiques d’induction de l’apoptose des cellules neuronales.

O18
Adressage mitochondrial de la protéine L* du virus de Theiler

Sorgeloos F, Michiels T

Université catholique de Louvain, Ch. de Duve Inst of Cellular Pathology (ICP), Mipa-Viro 74-49, 74 avenue Hippocrate, B-1200 Bruxelles
<frederic.sorgeloos@mipa.ucl.ac.be>

Le virus de Theiler est un virus murin appartenant à la famille des Picornaviridae. Certaines souches de ce virus (BeAn, DA) ont la capacité de persister au niveau de la substance blanche de la moelle épinière de souris infectées, et cela malgré une importante réponse immunitaire spécifique. Cette persistance virale est accompagnée de lésions de démyélinisation semblables à celles retrouvées chez les malades souffrant de la sclérose en plaques.
La protéine L* du virus de Theiler est un exemple unique, chez les picornavirus, de protéine traduite par un cadre de lecture alternatif chevauchant les régions codant pour les protéines L, VP4 et VP2. Il a été montré que cette protéine joue un rôle important dans la persistance du virus DA dans le système nerveux central.
Le mécanisme d’action de cette protéine, qui autorise le virus de Theiler à persister dans le système nerveux central, reste obscur. Il a été montré in vitro que l’expression de cette protéine augmente la réplication virale au sein de macrophages infectés.
Afin de mieux comprendre le mode d’action de cette protéine, nous avons développé un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine L* et utilisé celui-ci afin de localiser cette protéine dans des cellules infectées. De manière étonnante, cette protéine est adressée aux mitochondries et colocalise avec celles-ci dans les différentes lignées cellulaires testées, y compris la lignée de macrophages RAW264.7. Des protéines de fusion L*-EGFP et EGFP-L* exprimées à partir de vecteurs plasmidiques colocalisent également avec les mitochondries, indiquant l’absence d’influence d’autres protéines virales dans la localisation mitochondriale de la protéine L*.
De manière à préciser la localisation de cette protéine par rapport aux compartiments mitochondriaux, nous avons réalisé, d’une part une digestion sélective des protéines de la membrane mitochondriale externe et, d’autre part, une extraction alcaline des membranes mitochondriales au carbonate de sodium. Les résultats de ces expériences ont montré que la protéine L* est une protéine transmembranaire, située à la membrane mitochondriale externe et dont la partie N-terminale est orientée vers le cytosol. La localisation mitochondriale de la protéine de fusion EGFP-L* suggère que le signal d’adressage de la protéine L* n’est pas un signal d’adressage N-terminal classique. Pour isoler la région de la protéine responsable de sa localisation, nous avons introduit une série de délétions internes et terminales dans la partie L* des protéines de fusion L*-EGFP et EGFP-L*. La localisation de ces protéines fluorescentes montre que la région nécessaire et suffisante à l’adressage mitochondrial est située dans sa partie C-terminale. Le mode d’adressage de cette protéine ainsi que sa topologie membranaire suggère que la protéine L* appartient à une famille de protéine appelée tail-anchored proteins dont fait partie la famille de protéines Bcl2 régulatrices de l’apoptose.
Finalement, nous avons conduit une série d’expériences visant à confirmer le caractère antiapoptotique de cette protéine dans plusieurs lignées cellulaires. Les résultats de ces expériences montrent en effet que la protéine L* influence les processus apoptotiques des cellules exprimant cette protéine.

O19
L’interaction de la protéine Vpr du VIH1 avec la nucléoporine hCG1, un composant du complexe du pore nucléaire, est nécessaire à la réplication du virus dans des macrophages primaires

Jacquot G¹, Le Rouzic E¹, David A², Pancino G², Benichou S¹

¹Institut Cochin, Département des maladies infectieuses, Inserm U567, CNRS-UMR8104, 27 rue du Faubourg Saint-Jacques 75014 Paris ; ²Institut Pasteur, Département de virologie, Unité biologie des rétrovirus, 28 rue du Docteur-Roux 75015 Paris
<jacquot@cochin.inserm.fr>

Nous avons récemment caractérisé une interaction moléculaire entre la protéine Vpr du VIH1 et la nucléoporine hCG1, un constituant du complexe du pore nucléaire. Alors que nos résultats précédents ont montré que cette interaction est nécessaire à l’accumulation de Vpr au niveau de l’enveloppe nucléaire, nous avons cherché à évaluer l’impact de cette interaction sur la réplication virale à l’aide de mutants ponctuels de Vpr. Deux mutants ponctuels, substitués respectivement sur les résidus Leu23 et Lys27 (VprL23F et K27M), ont pu être sélectionnés à partir d’une banque de mutants aléatoires de Vpr pour leur incapacité à interagir avec hCG1. Leur conformation globale ne semble pas affectée puisque leur interaction avec l’UNG2 ou HHR23A, deux autres partenaires cellulaires connus de Vpr, n’est absolument pas affectée. Contrairement à la protéine sauvage, les mutants VprL23F et K27M ne sont pas capables de s’accumuler au niveau de l’enveloppe nucléaire. Ces deux mutations affectent également la capacité de Vpr à induire un arrêt du cycle cellulaire en phase G2, suggérant un lien fonctionnel entre cette propriété et l’accumulation de Vpr au niveau de l’enveloppe nucléaire. Chacune des mutations, L23F et K27M, a finalement été introduite dans le gène Vpr du clone viral moléculaire YU2, afin d’analyser les capacités réplicatives de virus mutés dans des cellules différenciées cibles du VIH1.
Après infection de macrophages primaires dérivés de monocytes circulant, les résultats montrent clairement que les deux virus mutés présentent un défaut significatif de réplication par rapport au virus sauvage. L’ensemble de nos résultats indiquent que l’accumulation de Vpr au niveau de l’enveloppe nucléaire, résultant de son interaction avec la nucléoporine hCG1, est nécessaire pour permettre une réplication efficace du VIH1 dans des cellules différenciées de type macrophages, qui représentent des cibles majeures du VIH1 au cours de l’infection naturelle.

O20
Identification d’un motif et de son effecteur cellulaire associé impliqués dans le trafic et l’assemblage d’une glycoprotéine rétrovirale

Sandrin V, Bouard D, Boson B, Negre D, Granier C, Cosset FL

LVRTG-U412 ENS Lyon, 46 allée d’Italie, 69007 Lyon
<david.bouard@ens-lyon.fr>

Les particules rétrovirales sont composées d’un core protéique contenant le matériel génétique enveloppé d’une bicouche lipidique dans laquelle sont enchâssées les glycoprotéines d’enveloppes (Gp), responsables du tropisme du virus. L’assemblage des Gp sur les virions peut prendre place à la membrane plasmique ou de façon intracellulaire, en fonction du type de cellule et du virus considéré. Chez les rétrovirus, la formation de nouvelles particules dépend uniquement de l’expression des protéines du core ; lequel forme ainsi le « moteur » du bourgeonnement viral. Cependant, les protéines du core viral et les Gp sont synthétisées dans des compartiments cellulaires différents, impliquant l’existence d’un mécanisme de régulation du trafic de ces composants pour assurer ultimement leur rencontre. Deux mécanismes d’assemblage des Gp sur les virions ont été décrits. Le mécanisme passif est défini comme l’incorporation de toute glycoprotéine à la surface virale, à condition que cette glycoprotéine soit présente au lieu de bourgeonnement et soit stériquement compatible avec le core viral. En revanche, l’incorporation active relève d’une interaction directe ou indirecte entre le core et la Gp virale, favorisant ainsi l’incorporation des glycoprotéines.
L’utilisation au laboratoire de particules rétrovirales, appelées pseudo-types, portant des Gp hétérologues, est un outil particulièrement utile pour démasquer et étudier les mécanismes de trafic des glycoprotéines et/ou des cores rétroviraux. Nous nous sommes particulièrement intéressés à un couple de Gp, celles de MuLV-A et de RD114, et un couple de core rétroviraux, celui de MLV et de SIV. Alors que les deux Gp pseudo-typent efficacement les cores MLV, seule la Gp de MuLV-A pseudo-type efficacement les cores SIV. Nous avons montré que ces différences de pseudo-typages sont corrélées à des différences de colocalisation avec les cores rétroviraux, une forte colocalisation dans les endosomes tardifs menant à une bonne incorporation de la Gp et à un fort titre infectieux. Cela indique d’une part que le core MLV est capable de relocaliser la Gp de RD114 dans les endosomes, cette dernière ne s’y trouvant pas en l’absence de core ou en présence du core SIV. D’autre part qu’une localisation des Gp dans les endosomes tardifs est requise pour l’assemblage sur le core SIV celui recrutant passivement les Gp. L’étude détaillée de ces événements a permis de proposer que des motifs particuliers de la queue cytoplasmiques soient responsables de la localisation de l’enveloppe dans un compartiment intracellulaire favorable à l’assemblage [Sandrin et al. 2004].
Nous avons alors investigué plus avant les motifs de la queue cytoplasmique responsables de leur localisation subcellulaire ainsi que les effecteurs cellulaires impliqués dans la régulation de leur trafic. Nous avons réalisé différents mutants de destruction ou de complémentation de ces deux Gp. Les mutants des motifs putatifs de trafic des Gp ont été caractérisés par détermination du titre infectieux et par quantification de l’incorporation de la Gp sur les particules. Les mutations affectant un motif acide de la queue cytoplasmique de la Gp de RD114 confèrent une meilleure incorporation de cette Gp mutante sur les cores SIV ainsi qu’une augmentation du titre infectieux des particules ainsi produites. Nous avons alors montré par des techniques d’imagerie confocale que les mutations diminuant la force de ce domaine acide modifient la localisation de la Gp dans les compartiments intracellulaires, au profit d’une localisation endosomale tardive où l’assemblage peut alors prendre place. Cet effet semble directement corrélé à la force du motif acide et, réciproquement, l’ajout de motif acide dans l’enveloppe de MuLV-A réduit drastiquement son incorporation et les titres infectieux associés. Dans un second temps, nous avons montré par des expériences de surexpression ou d’extinction par SiRNA que PACS1, un effecteur cellulaire impliqué dans le transport rétrograde des furines, est engagé dans le trafic rétrograde de la Gp de RD114 de manière dépendante de l’intégrité et de la force acide du motif acide. C’est la première fois que la voie de trafic rétrograde médiée par PACS1 est impliquée dans le trafic d’une Gp rétrovirale ; de même, la fonctionnalité d’un motif acide dans une Gp rétrovirale n’avait jusqu’alors jamais été montrée. Cela suggère une implication importante du core homologue de RD114 pour le recrutement de sa Gp.

O21
La protéine de matrice du VSV recrute la dynamine au cours de l’étape de bourgeonnement

Raux H¹, Richard N¹, Harper F², Blondel D¹, Gaudin Y¹

¹Laboratoire de virologie moléculaire et structurale, unité mixte CNRS-INRA, avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette ; ²Laboratoire de génétique moléculaire et intégration des fonctions cellulaires, unité CNRS, Institut Lwoff, 7 rue Guy-Moquet, 94801 Villejuif
<nicolas.richard@vms.cnrs-gif.fr>

La protéine de matrice du virus de la stomatite vésiculaire (M) joue un rôle important au cours des étapes d’assemblage et de bourgeonnement du virus. Dans cette dernière étape, elle peut s’associer à la face interne des membranes plasmique et provoquer leur déformation. Elle possède des motifs riches en proline dans son extrémité N-terminale appelés « domaines tardifs », retrouvés chez de nombreux virus enveloppés, qui lui permettent de recruter des partenaires cellulaires dans le cadre du bourgeonnement viral. Ces partenaires sont impliqués dans la formation et la maturation des corps multivésiculaires (TSG101) et dans l’adressage des protéines à ces structures (Nedd4).
Afin de mieux comprendre les mécanismes à l’origine du bourgeonnement viral, nous avons effectué un crible double hybride pour identifier de nouveaux partenaires cellulaires de la M. Nous avons mis en évidence une interaction entre M et la dynamine 2. Cette protéine est une grande GTPase multidomaine impliquée dans le détachement des vésicules à manteau de clathrine lors de l’endocytose. In vitro, il a été montré que la dynamine 2 possède aussi la capacité de déformer les membranes.
Nous avons tout d’abord déterminé les domaines d’interactions sur les deux protéines : il s’agit de l’extrémité N-terminale de M et du domaine PH de la dynamine. En particulier, la mutation du résidu leucine en alanine en position 4 sur M abolit complètement l’interaction dans le système double hybride. Bien qu’aucune association entre M et la dynamine n’ait pu être démontrée in vitro par co-immunoprécipitation, le système double hybride indiquait que cette interaction était conservée à travers le genre vésiculovirus, ce qui suggérait qu’elle jouait un rôle dans le cycle viral.
Pour valider cette hypothèse, nous avons construit par génétique inverse le mutant VSV ML4A dans le génome duquel nous avons introduit la mutation conduisant au remplacement de la leucine par une alanine en position 4 de la protéine de matrice. Ce mutant est affecté dans sa multiplication et nous avons pu montrer que le blocage avait lieu dans une phase tardive du cycle viral (assemblage ou bourgeonnement). La microscopie électronique nous a montré que ce blocage avait lieu avant la déformation de la membrane plasmique. Nous avons facilement sélectionné des révertants qui retrouvaient une cinétique de multiplication comparable au sauvage et dont la protéine de matrice (bien que n’ayant pas retrouvé sa séquence en acides aminés d’origine) interagissait de nouveau avec la dynamine 2. Cela prouvait définitivement que cette interaction jouait un rôle lors d’une étape tardive du cycle infectieux.
Nous avons ensuite cherché à préciser ce rôle. Dans les cellules infectées, nous avons montré une colocalisation de la protéine de matrice avec la dynamine. Par ailleurs, nous avons observé une localisation différente de la protéine de matrice et plus encore de la nucléoprotéine dans les cellules infectées par le VSV MLA4 par rapport à celles observées lors de l’infection par le virus sauvage. L’ensemble de nos résultats suggère donc un rôle qui reste à identifier de la machinerie d’endocytose dans l’assemblage ou le bourgeonnement du VSV.

P22
Le transforming growth factor beta 1 provoque la réactivation du virus d’Epstein-Barr par des mécanismes impliquant les voies des signalisations ERK1/2 MAPK et NF kappa B

Ramirez V, Cochet C, Arbach H, Joab I

Inserm U716, IUH, IFR Saint-Louis, 27 rue Juliette-Dodu, 75010 Paris
<Irene.Joab@stlouis.inserm.fr>

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est un virus ubiquitaire appartenant à la famille des Herpesviridae. Dans les cellules B infectées, son génome persiste sous forme épisomale et l’expression et restreinte : 3 protéines membranaires (LMP1, 2A et 2B), 6 antigènes nucléaires (EBNA1, 2,3A, 3B, 3C, LP) et des petits ARN non polyadénylés (EBER). Le virus peut aussi entrer dans un cycle lytique avec production de virions. Sa réactivation est déclenchée par l’expression du gène BZLF1 qui code pour la protéine ZEBRA. Il a été montré que son expression est nécessaire et suffisante pour induire un cycle productif complet.
L’EBV est associé à des pathologies tumorales, notamment des lymphomes (lymphome de Burkitt, maladie de Hodgkin, lymphomes non hodgkiniens des sujets immunodéprimés). Chez les patients immunodéprimés (transplantés ou atteints du sida), sa réactivation provoque une augmentation très importante du risque de développer un lymphome B non hodgkinien EBV-positif. Le contrôle du passage de la latence virale au cycle réplicatif semble essentiel dans le développement tumoral.
Il est important de caractériser les stimuli physiologiques et de préciser les mécanismes menant à ce phénomène. Les facteurs impliqués dans la réactivation in vivo de l’EBV ne sont pas identifiés. In vitro, de nombreux agents exogènes, tels que le PMA, l’acide butyrique, l’anti-IgG, les ionophores de calcium et le transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) activent le cycle lytique. In vivo, il pourrait être déclenché par des molécules surexprimées au cours des immunodépressions, tel que le TGFβ1.
L’objectif de l’étude était d’identifier les voies de signalisation menant à la réactivation de l’EBV par le TGFβ1.
Les effets du TGFβ1 sur la réactivation virale sont étudiés dans de lignées portant l’EBV en latence I telles que MutuI, SavI, KemI. L’analyse de l’expression du produit du gène BZLF1 (ZEBRA) et la modulation de cette expression en réponse au TGFβ1 est estimée en western-blot. L’activité NFκB est estimée par retard sur gel d’une sonde spécifique correspondant au site de fixation de NFκB sur le promoteur Ig ; les sous-unités de NFκB mises en jeu sont identifiées par supershift.
L’utilisation des inhibiteurs des voies MAPK (U0126) et NFκB (BAY11-7082, triptolide et IKK2 inhibitor V), montre que ces voies sont impliquées dans la signalisation de l’effet du TGFβ1 menant à l’expression de ZEBRA. Nos résultats indiquent une activation transitoire de la voie canonique NFκB sous l’effet de TGFβ1. Cette activation est suivie de l’activation de la voie ERK1/2 MAPK et d’une activité de la sous-unité p52 laissant soupçonner l’utilisation de la voie non canonique de NFκB. La caractérisation de chaque voie signalisation sous l’effet de TGFβ1 en présence des inhibiteurs nous permettra de cibler les éléments permettant une action pharmacologique propre à moduler cette action.

P23
Interactions physiques et fonctionnelles de la protéine HBx avec les coactivateurs CBP/p300 dans l’activation transcriptionnelle de CREB

Cougot D, Wu Y, Caramel J, Buendia MA, Neuveut C

Unité d’oncogenèse et virologie moléculaire (Inserm U579), Institut Pasteur, Paris.
<dcougot@pasteur.fr>

Le virus de l’hépatite B est un petit virus à ADN qui induit des hépatites aiguës et persistantes ; il représente un facteur de risque majeur pour le développement du carcinome hépatocellulaire. La protéine régulatrice virale HBx a été impliquée dans le processus tumoral à cause de sa capacité à modifier l’expression de gènes cellulaires et à interagir avec de nombreux partenaires cellulaires. Nous avons étudié l’activité transactivatrice d’HBx dans le cadre de son interaction avec CREB, un facteur de transcription inductible par l’AMPc qui joue un rôle important dans le métabolisme hépatique et l’hépatocarcinogenèse. CREB se fixe à l’ADN au niveau de séquences CRE. Il est activé par phosphorylation de la sérine 133 par la PKA. Cette phosphorylation permet le recrutement des coactivateurs CBP/p300 qui sont essentiels à l’activité transcriptionnelle de CREB.
Le but de notre étude est de rechercher le rôle d’HBx dans l’activation de la transcription dépendante de CREB. Dans un premier temps, nous avons confirmé qu’HBx activait fortement CREB via un rapporteur CRE cellulaire et de plus, nous avons observé qu’HBx synergise avec CBP/p300 sur l’activité de CREB. Par ailleurs, nos résultats démontrent que la phosphorylation de CREB est essentielle à son activation par HBx, car HBx n’active CREB que lorsque celui-ci est préalablement activé par la PKA, et le mutant CREB Ser133-Ala non phosphorylable n’est pas activé par HBx. Ainsi, contrairement à Tax d’HTLV1, HBx est incapable d’induire le recrutement de CBP/p300 en l’absence de phosphorylation de CREB. Des travaux antérieurs avaient montré qu’HBx interagit directement avec CREB et augmente son affinité pour l’ADN. Nous avons alors recherché si l’activation par HBx et la synergie entre HBx et p300 étaient conservées dans un contexte indépendant de la liaison de CREB à l’ADN, en utilisant une construction GAL4-CREB dans laquelle la protéine CREB sauvage est fusionnée au domaine de liaison à l’ADN de GAL4 et un rapporteur GAL4. Dans ce contexte, HBx est également capable d’activer CREB et de coopérer avec p300, suggérant l’existence d’un autre mécanisme. La mise en évidence d’une interaction directe entre HBx et CBP/p300, in vitro et in vivo, suggère qu’HBx pourrait faciliter et stabiliser la formation du complexe CRE-CREB-CBP/p300. Nous cherchons actuellement à valider cette hypothèse par des expériences de retard sur gel et de ChIP. De plus, afin de mieux comprendre le rôle de CREB et CBP/p300 dans la réplication virale, nous étudions les effets d’HBx sur la transcription via la séquence CRE virale située dans l’enhancer 1 de l’HBV, et le rôle des interactions d’HBx avec CREB et CBP/p300 sur la transcription virale et la production de virus dans les cellules HepG2.

P24
Dialogue entre PML et p53 au cours de l’infection par le poliovirus

Pampin M¹, Simonin Y², Blondel B², Percherancier Y¹, Chelbi-Alix M¹

¹CNRS, Institut Lwoff, Villejuif ; ²Institut Pasteur, Paris
<mchelbi@infobiogen.fr>

PML (promyelocytic leukemia), protéine induite par l’interféron, est impliquée dans la régulation de nombreux processus cellulaires tels que l’inhibition de la croissance, l’apoptose et la défense antivirale. Dans le noyau, PML est localisée dans le nucléoplasme et sur une structure de fonction inconnue appelée corps nucléaire (CN) dont PML est l’organisatrice. La SUMOylation de PML est indispensable à la formation des CN. Selon les conditions de traitement, des protéines cellulaires (p53, CBP, SUMO, HIPK2, Sp100) peuvent être associées aux CN-PML. Du fait d’épissages alternatifs, il existe plusieurs isoformes de PML (PMLI à PMLVII) ayant des extrémités C-terminales différentes.
Nous avons montré que l’expression de l’isoforme III de PML rend les cellules résistantes au virus de la stomatite vésiculaire, au virus de la grippe ou à un rétrovirus complexe, le HFV (human foamy virus). Nos résultats placent PML parmi les protéines induites par l’interféron (IFN) ayant un pouvoir antiviral. Cependant, d’autres virus (herpès, adénovirus, virus de la rage) peuvent modifier ou détruire les PML-NB. De fait, certaines protéines virales s’y accumulent et entraînent leur désorganisation.
Nous avons montré que PML III n’a pas de pouvoir antiviral contre le poliovirus. Par contre, ce virus réorganise les CN-PML et induit le recrutement de PML sur ces structures. Ce transfert de la forme diffuse de PML vers les NB a été confirmé par le fait que le poliovirus virus induit la conjugaison de PML à SUMO, ce qui entraîne le recrutement de Sp100, p53 et du composant 20S du protéasome. Le fractionnement cellulaire indique que le poliovirus provoque d’abord le recrutement de p53 sur la matrice nucléaire puis sa dégradation par un processus dépendant du protéasome. La diminution de l’expression de PML par ARN interférence montre son rôle dans la dégradation de p53 et l’apoptose induites par ce virus.

P25
Expression différentielle et activité des interférons de type I

Paul S, Sommereyns C, Delhaye S, Michiels T

Université catholique de Louvain, Ch. de Duve Inst of Cellular Pathology (ICP), Mipa-Viro 74-49, 74 avenue Hippocrate, B-1200 Bruxelles <sophie.paul@mipa.ucl.ac.be>

Les interférons de type I (IFNα et β) constituent une famille multigénique de cytokines qui jouent un rôle primordial dans la défense de l’hôte contre les infections virales. Le génome de l’homme et celui de la souris comptent une vingtaine de gènes codant les IFN1 (1, 2 et 3). Si les divers sous-types d’IFNα présentent entre eux près de 90 % d’identité, ils ne présentent pas plus de 30 % d’identité avec les autres IFN1 (IFNβ, κ, , omega/limitine). De plus certains IFN sont glycosylés alors que d’autres ne le sont pas. En dépit de ces divergences, tous les IFN1 semblent se lier au même récepteur cellulaire, ce qui pose la question de leur spécificité d’action.
L’objectif général de ce travail est d’apporter un éclairage nouveau à la question de la raison de la multiplicité des IFN1. Le premier volet de notre étude vise à tester l’hypothèse selon laquelle l’acquisition de profils d’expression différents pourrait expliquer la multiplicité des IFN1. Le second volet du travail consiste à déterminer l’impact de la glycosylation sur l’activité des sous-types d’IFN1 in vivo.
Lors de l’infection du système nerveux central de la souris par le virus de Theiler (picornavirus) ou par le virus La Crosse (bunyavirus), les IFNα et β sont fortement induits. En accord avec ces résultats, nous observons une forte augmentation de la transcription d’IRF7 dans les cerveaux infectés. À l’échelle cellulaire, les expériences d’hybridation in situ et d’immunofluorescence montrent que les neurones sont d’importants producteurs d’IFNα et β. Les IFNα4, 5, 2 et 8/6 représentent la majorité des IFNα exprimés, quel que soit le virus inducteur.
En ce qui concerne l’étude de l’impact de la glycosylation sur l’activité des IFN1, nous avons observé que la glycosylation ne modifiait pas de manière significative l’activité de l’IFNα6T in vitro. Nous voulons donc tester si la glycosylation des IFN joue un rôle important, in vivo. Pour cela, l’ADN plasmidique codant l’IFNα6T sauvage (naturellement non glycosylé) ou son mutant glycosylé sont exprimés chez la souris après injection intramusculaire. Nous testons la production d’IFN en mesurant l’induction de l’expression de la 2’, 5’-oligoadénylate synthétase (OASl2) dans différents organes. Des résultats préliminaires indiquent que 4 et 6 jours après l’injection, le taux d’expression de l’OASl2 augmente dans les souris ayant reçu les plasmides codant les IFN par rapport aux souris témoins. Ce travail sera poursuivi pour tester dans quelle mesure la glycosylation de certains IFN influence leur dispersion et leur activité in vivo.
Ces deux approches nous permettent d’explorer les différences subtiles qui existent dans l’expression et l’activité des IFN1 in vivo, en vue de comprendre la raison de leur multiplicité.

1. Diaz et al., 1994, Genomics 22 : 540-52
2. Van Pesch et al., 2004, J Virol 78 : 8219-28
3. Van Pesch and Michiels, J Biol Chem, 2003, 278 : 46321-8.

P26
Mécanismes de restriction de la multiplication des virus grippaux aviaires

Labadie K, van der Werf S, Naffakh N

Unité de génétique moléculaire des virus respiratoires, URA CNRS 1966, Institut Pasteur, Paris
<klabadie@pasteur.fr>

La progression actuelle de l’épizootie de grippe aviaire A (H5N1) souligne le risque pandémique lié à la transmission et l’adaptation à l’homme d’un virus grippal aviaire de sous-type antigénique nouveau. Face à une telle menace, il apparaît essentiel de développer, en complément de l’approche vaccinale, des méthodes de surveillance du potentiel pandémique des virus aviaires circulants et des stratégies antivirales adaptées. Nos études portent, selon ces deux axes, sur les mécanismes de restriction de la multiplication des virus grippaux aviaires.
Notre premier objectif est de préciser les mécanismes moléculaires impliquant les protéines du complexe polymérase dans les phénomènes de restriction d’hôte et de transmissibilité inter-espèce des virus grippaux. Un système de reconstitution des ribonucléoprotéines virales (RNP) in vivo est utilisé : des plasmides d’expression codant la nucléoprotéine (NP) et les trois sous-unités du complexe polymérase (PB1, PB2 et PA) sont cotransfectés transitoirement dans les cellules humaines 293T avec un plasmide permettant la synthèse d’un ARN pseudo-viral rapporteur sous le contrôle du promoteur de l’ARN polymérase I humain. L’utilisation du promoteur de l’ARN polymérase I de poulet, récemment identifié et cloné dans l’unité, permet de réaliser en parallèle le même type d’expériences dans des cellules DF1 d’origine aviaire. Les résultats obtenus établissent que : 1) dans les cellules humaines, les complexes polymérase d’origine aviaire assurent la transcription/réplication de l’ARN pseudo-viral avec une efficacité significativement plus faible que celle des complexes d’origine humaine, alors que l’efficacité des deux types de complexes est comparable dans les cellules aviaires ; 2) l’activité des complexes polymérase d’origine aviaire est réduite à 33 °C (la température du tractus respiratoire chez l’homme) par rapport à 37 °C, ou 40 °C (la température corporelle des oiseaux), de manière plus marquée dans les cellules humaines que dans les cellules aviaires. L’activité des complexes polymérase d’origine humaine est peu modifiée par l’abaissement de la température. C’est aussi le cas du complexe polymérase dérivé du virus d’origine aviaire A (H5N1) responsable du premier cas humain mortel à Hong Kong en 1997 ; 3) la nature de l’acide aminé 627 de PB2 (lysine chez les virus humains, acide glutamique chez les virus aviaires) a un effet très significatif sur l’activité des complexes polymérase dans les cellules humaines, mais non dans les cellules aviaires. Ces résultats suggèrent que les phénomènes de restriction d’hôte chez les virus grippaux mettent en jeu l’interaction de la protéine PB2 avec un ou plusieurs facteurs cellulaires, et/ou la stabilité du complexe polymérase. Nous cherchons à tester cette hypothèse par des expériences de co-immunoprécipitations, dans le système d’expression transitoire des RNP ou dans le contexte de l’infection virale.
Notre second objectif est d’évaluer le potentiel d’inhibition de la multiplication des virus grippaux aviaires par l’expression stable de siRNA ciblant les protéines NP et PB1 des RNP. Une stratégie originale d’expression des siRNA, reposant sur l’utilisation du promoteur de l’ARN polymérase I aviaire, est développée. Cette stratégie a dans un premier temps été validée dans les cellules 293T par l’expression stable de siRNA anti-NP sous la dépendance du promoteur de l’ARN polymérase I humain, mais elle s’est révélée peu efficace en cellules aviaires. Nous envisageons donc la production de lignées exprimant les siRNA de façon stable par transduction à l’aide de vecteurs lentiviraux (en collaboration avec D. Bohl, Institut Pasteur). Ce type d’approche pourrait déboucher sur la mise au point de nouvelles stratégies antivirales, notamment dans le domaine vétérinaire.

P27
Adaptation du virus de l’encéphalomyocardite à des cellules d’une lignée de foie de rat (BRL)

Guy M¹, Chilmonczyk S², Bakkali-Kassimi L¹, Hammoumi S¹, Crucière C¹

¹UMR 1161 (INRA, AFSSA, ENVA), École nationale vétérinaire, Maisons-Alfort Cedex ; ²Unité de virologie et immunologie moléculaires, INRA, 78350 Jouy-en-Josas Cedex
<mguy@vet-alfort.fr>

Le virus de l’encéphalomyocardite (EMCV) appartient à la famille des Picornaviridae et au genre Cardiovirus. Il présente une large distribution et peut infecter de nombreuses espèces, particulièrement les rongeurs, les primates et le porc. Il est pathogène chez les primates et surtout chez le porc, où il peut provoquer des myocardites et des troubles de la reproduction. Les rongeurs seraient le réservoir. Des anticorps dirigés contre l’EMCV ont été mis en évidence chez des animaux domestiques, des oiseaux et même dans des populations humaines.
Dans le but de comprendre les bases moléculaires de la virulence du virus de l’EMC et leurs implications dans l’émergence de la maladie, nous avons adapté la souche 1086c, isolée à partir de rat, à des cellules d’une lignée de foie de rat (BRL) et analysé les modifications qui sont intervenues, au niveau du virus, lors de cette adaptation.
La souche 1086c ne produit pas de lyse cellulaire lorsqu’elle est inoculée aux cellules BRL, contrairement à son inoculation sur un système cellulaire sensible, comme la lignée de cellules de rein de hamster (BHK21). Les analyses de l’efficacité des différentes étapes du cycle viral ont montré qu’elle présente un plus faible attachement sur les cellules BRL que sur les cellules BHK21. L’adaptation du virus aux cellules BRL a été réalisée, en inoculant alternativement, cette souche, sur cellules BRL et sur cellules BHK21. À partir du quatrième passage alterné BRL-BHK21, un effet cytopathique (ECP) a été observé sur BRL à partir du virus produit sur BHK21 mais a nécessité un nouveau passage sur BHK pour redonner de l’ECP sur BRL. Au trentième passage alterné, un ECP a pu être reproduit lors d’un passage direct BRL-BRL mais le virus produit a dû être amplifié de nouveau sur BHK21 pour donner un ECP sur BRL. Après 33 passages alternés, le virus a induit une lyse des cellules BRL en 24 heures et a pu être multiplié sur ces cellules sans recourir aux cellules sensibles. Contrairement au virus d’origine, le virus adapté est capable de former des plages de lyse et de se multiplier efficacement sur les cellules BRL. Cette adaptation s’accompagne d’une augmentation de l’efficacité d’attachement du virus. La comparaison de la séquence génomique du virus avant et après adaptation, a permis de mettre en évidence des mutations au niveau de la protéine de capside VP1.
L’adaptation de la souche 1086c du virus de l’EMC aux cellules BRL a permis la sélection de virus capables d’induire une lyse des cellules et de se propager d’une cellule à l’autre. Le virus adapté présente un pouvoir d’attachement plus élevé que le virus d’origine. Ces variations du phénotype viral sont probablement dues à des mutations au niveau de la protéine de capside VP1.

P28
Un nouveau partenaire cellulaire de la protéine Gag du VIH1

Perugi F¹, Muriaux D², Chopin C¹, Decroly E³, Darlix JL², Blot V¹, Pique C¹

¹CNRS UMR 7151, hôpital Saint-Louis, 1 avenue Claude-Vellefaux, 75010 Paris et CNRS, UMR8104, Département biologie cellulaire, Institut Cochin, 22 rue Méchain, 75014 Paris ; ²Inserm U412 ENS de Lyon 46, allée d’Italie, 69364 Lyon Cedex 07 ; ³Inserm U372, Université de la Méditerranée, 163 avenue de Luminy, 13276 Marseille Cedex 09.
<fperugi@voila.fr>

La compréhension des différentes étapes conduisant à la production des particules virales est un axe majeur dans la recherche sur le VIH1 (virus de l’immunodéficience humaine de type 1). Bien que la polyprotéine Gag soit la seule protéine virale nécessaire au déroulement de ces étapes, l’intervention de cofacteurs cellulaires est indispensable. Lorsqu’il est clivé par la protéase virale, le précurseur Gag donne les protéines de matrice, capside et nucléocapside qui s’assemblent pour former la coque virale ainsi que les peptides non structuraux, SP1, SP2 et p6. La sortie des particules nécessite en outre l’accrochage et la multimérisation de Gag aux niveaux des membranes cellulaires. De manière intéressante, nous avons montré que hDlg, une protéine impliquée dans la formation de complexes protéiques membranaires, est capable de s’associer avec le précurseur Gag du VIH1. Nous tentons de caractériser l’importance de cette interaction dans le cycle réplicatif du VIH1 et d’identifier les mécanismes impliqués.
Nous avons étudié l’association Gag/hDlg d’abord in vitro, puis dans un contexte cellulaire. Nous avons également analysé la maturation de Gag et défini sa localisation intracellulaire, en regard de celle de hDlg. Enfin, nous avons mesuré la production des particules dans des conditions où hDlg est soit surexprimée, soit déplétée.
Nous avons montré que l’interaction hDlg/Gag implique un des domaines C-terminaux de hDlg (I3) et, de manière originale, la région NC de la protéine Gag du VIH1. Des complexes entre Gag et hDlg endogène sont formés dans des cellules 293T transfectées, mais également dans des lymphocytes T infectés par le VIH1. En outre, dans ces deux types cellulaires, Gag et hDlg sont colocalisées dans des sous-domaines de la membrane plasmique, notamment au niveau des points de contact cellulaires. Au niveau fonctionnel, la surexpression de hDlg augmente la production de nouveaux virions et, à l’inverse, la suppression de hDlg endogène diminue massivement cette production. Enfin, le taux de hDlg dans la cellule productrice module la maturation de la polyprotéine Gag.
Nos résultats suggèrent que la protéine hDlg intervient dans l’adressage et/ou la stabilité de la polyprotéine Gag à la membrane plasmique, favorisant ainsi la formation et la sortie des particules. Ce nouveau mécanisme, qui confirme la complexité des processus gouvernant la production du VIH1, ouvre de nouvelles pistes de recherche pour le développement de stratégies antivirales.

P29
Modulation transcriptionnelle des gènes de cytokines et chimiokines par la protéine L du virus de Theiler

Ricour C, Delhaye S, Michel B, Michiels T

Université catholique de Louvain, Ch. de Duve Inst of Cellular Pathology (ICP), Mipa-Viro 74-49, 74 avenue Hippocrate, B-1200 Bruxelles
<celine.ricour@mipa.ucl.be>

Le virus de Theiler est un picornavirus murin neurotrope. Il a la capacité de persister et de se multiplier dans le système nerveux central (SNC) de la souris, malgré une réponse immunitaire spécifiquement dirigée contre lui. Il provoque donc chez son hôte une pathologie démyélinisante chronique ressemblant de très près à la sclérose en plaque. Sa protéine leader (L*) est indispensable à sa persistance dans le SNC de l’hôte [1, 2]. Nous avons montré que cette protéine était capable d’inhiber la transcription des gènes codant pour les interférons (IFN) de type I et de perturber le trafic nucléocytoplasmique des protéines de la cellule infectée [3].
Puisque de nombreux gènes impliqués dans la réponse immune précoce dépendent de la translocation nucléaire de facteurs de transcription, nous avons examiné si l’inhibition transcriptionnelle par la protéine L* était restreinte aux seuls gènes des interférons. Par des expériences de micro-damiers et de PCR en temps réel, nous avons montré que la transcription de nombreux gènes induits par l’infection virale était également bloquée par la protéine L du virus de Theiler. Ces gènes codent pour des cytokines, des chimiokines et des protéines impliquées dans la voie d’activation de la transcription des interférons. Nous citerons comme exemple les gènes codant pour l’interleukine 6 (IL6), RANTES et NIK, une kinase essentielle pour l’activation de NFκB. Cette inhibition transcriptionnelle des gènes des cytokines et chimiokines par la protéine L est indépendante du blocage de production des interférons puisqu’elle se produit également dans des macrophages déficients pour le récepteur des interférons de type I. Par ailleurs, au du cycle viral, la protéine L* se localise préférentiellement dans le noyau des cellules infectées. Cette localisation subcellulaire s’accorde avec les fonctions de la protéine au niveau de la transcription et de la perméabilisation de la membrane nucléaire.
In vivo, l’inhibition transcriptionnelle des gènes des cytokines et chimiokines est moins nette. On observe cependant une inhibition de la transcription des gènes codant pour IFNβ, RANTES et NIK après 4 à 5 jours d’infection de souris possédant le récepteur aux interférons de type I quand on normalise les résultats par rapport à la charge virale présente après ces 4 à 5 jours d’infection.

1. Van Pesch et al., 2001, J Virol, 75 : 7811-7.
2. Calenoff et al., 1995, J Virol, 69 : 5544-9.
3. Delhaye et al., 2004, J Virol, 78 : 4357-62.

P30
Etude de l’évolution génomique du virus de l’hépatite A : émergence et caractérisation de variants en présence de ribavirine

Berthome M, Caroff N, Rodallec A, Billaudel S, Ferré V.

JE 2437 Génétique des interactions hôte-micro-organismes, IFR26, Laboratoire de virologie, CHU Nantes
vferre@chu-nantes.fr

Le virus de l’hépatite A (VHA) est un virus à ARN linéaire appartenant à la famille des Picornaviridae dans le genre Hepatovirus. Comme de nombreux virus à ARN, il présente une variabilité biologique et moléculaire très étendue. En effet, les virus à ARN sont particulièrement sujets à des mutations ponctuelles aléatoires pouvant être à l’origine de leur variabilité génétique et de leur adaptabilité. Le taux de mutations des virus est proche du seuil d’erreur « catastrophe » défini par la théorie de la quasi-espèce qui témoigne de la stratégie pour les virus à ARN d’augmenter leur capacité évolutive. Lorsque la fréquence d’erreurs ne dépasse pas un seuil critique (1 erreur par génome et par cycle de réplication), l’apparition de mutants est partiellement compensée par des mécanismes de sélection. Toutes contraintes appliquées au virus entraîne un déséquilibre dans la quasi-espèce qui peut conduire à l’évolution du virus.
Afin d’améliorer la compréhension de l’évolution du VHA, notre travail a consisté à exercer une pression de sélection grâce à la ribavirine (antiviral à large spectre, analogue nucléosidique de la guanosine) sur une souche particulière de VHA : l’HM175. Cette souche est capable de se répliquer relativement rapidement sur une lignée cellulaire (cellules FrhK4). Il s’agissait de caractériser les mutations induites par cette drogue in vitro. Après 3 à 4 semaines de culture du virus en présence de différentes concentrations de ribavirine, les surnageants sont collectés, extraits, amplifiés par une longue PCR VP1/2A, quantifiés par PCR en temps réel (technologie TaqMan) et séquencés sur la région codante pour la protéine VP1 et la jonction VP1/2A. Les surnageants recueillis sont également remis en culture en présence d’une forte concentration de ribavirine et subissent jusqu’à 11 passages successifs afin d’accentuer ce phénomène d’évolution virale. À cette étape, ils sont extraits, amplifiés, quantifiés, clonés (utilisation d’un vecteur pGEM T Easy) et de nombreux clones sont séquencés.
Soixante-huit surnageants de culture, mis en contact avec des concentrations de ribavirine de 150 à 500 μm et présentant un retard dans le délai d’apparition de l’ECP, sont analysés. La diminution des titres génomiques sont respectivement de 0,5 et 1 log pour des concentrations de 150-200 μm et 300-500 μm. Dans ces conditions de fortes concentrations, la ribavirine exerce une pression sur la réplication virale tout en laissant la possibilité au virus de se multiplier. L’analyse des séquences des 68 souches a mis en évidence que 38 % des séquences étaient identiques à la souche de départ, on retrouve 91 % de transitions et 9 % de transversions. Seules ces dernières substitutions sont capables d’entraîner un changement dans la séquence en acides aminés donc d’induire une éventuelle résistance à la ribavirine. Le taux de mutation est de 0,91 ‰ confirmant l’importante stabilité phénotypique du VHA. Dès l’obtention de ces premiers résultats, 11 passages successifs en présence de 500 μm de ribavirine ont été effectués. La quantification réalisée sur les surnageants du premier au dixième passage montre une stabilité du titre génomique. La réplication virale n’a pas été modifiée : il n’y a pas eu de perte réplicative des souches au cours des passages successifs. L’identification des variants sur la région codante pour la protéine VP1, par clonage moléculaire, a permis l’analyse de 5 clones au neuvième passage, 32 au dixième et 38 au onzième. Les différents résultats obtenus montrent des taux de mutations de 9,7 ‰ au passage 9, 8,1 ‰ au passage 10 et 10,3 ‰ au passage 11. Le pourcentage de mutations non synonymes, responsables d’un changement dans la séquence en acides aminés, est également en augmentation au cours des passages successifs : 15, 26 et 34 % respectivement. Lors de l’analyse, la présence de clones présentant des délétions a été détectée : 1 clone avec une délétion pour le passage 9, 4 clones dont 2 identiques pour le passage 10 et 10 clones dont 2 identiques pour le passage 11. La traduction de la séquence nucléotidique de ces clones a conduit à une séquence en acides aminés codante. Nos résultats témoignent d’une capacité d’adaptation du virus en présence de ribavirine. Malgré tout le taux de mutations de ce virus reste relativement faible.

P31
Rôle de la boucle antigénique des protéines d’enveloppe du virus de l’hépatite B à l’étape d’infection : utilisation du modèle du virus de l’hépatite delta

Abou-Jaoudé G, Sureau C

Institut national de la transfusion sanguine, 6 rue Alexandre Cabanel, 75739 Paris Cedex 15
<gaboujaoude@ints.fr>

Le virus de l’hépatite delta (HDV) est un virus enveloppé par les protéines d’enveloppe du virus de l’hépatite B (HBV). Ses protéines, nommées L (large), M (medium) et S (small), jouent un rôle essentiel dans les processus de maturation et d’infectiosité des virions. La protéine S a une capacité d’auto-assemblage qui peut conduire à la formation de particules vides. Elle est, par ailleurs, suffisante pour la maturation des virions HDV. La protéine L, quant à elle, est nécessaire à l’infection car sa région N-terminale (domaine préS1) constitue un ligand du récepteur primaire sur l’hépatocyte humain.
En utilisant le système HDV pour étudier le rôle des protéines d’enveloppe HBV à l’étape d’entrée virale, nous avons démontré qu’un deuxième déterminant d’infectiosité réside dans la boucle antigénique (BAG) des protéines d’enveloppe [Jaoude GA, Sureau C. J Virol 2005 ; 79 : 10460-6].
Dans la présente étude, nous avons effectué des substitutions d’acides aminés entre les résidus 119 et 164 de la BAG, et nous avons examiné leur effet sur l’infectiosité des particules HDV dans un système de cultures primaires d’hépatocytes humains ou dans la lignée sensible HepaRG. Nous avons étudié également le rôle des 8 résidus cystéine de la BAG et l’implication des ponts disulfure sur la stabilité et l’infectiosité des virions.
Les résultats montrent que : 1) les mutations G119A, P120A, C121S, R122A, T123A, C124S, P153A, K141A et W156A de la BAG sont délétères pour l’infectiosité ; 2) la substitution de chaque résidu cystéine de la BAG par une sérine est permissive pour la production d’HDV mais toujours inhibitrice à l’étape d’infection ; 3) les cystéines en position 121 et 124 forment un motif de type CXXC que l’on retrouve généralement au site catalytique des protéines isomérases des ponts disulfure. À l’appui d’une isomérisation des ponts disulfure de la BAG lors de l’entrée virale, nous montrons qu’un alkylateur du groupement sulfhydryl et qu’un agent réducteur sont capables de bloquer l’infection HDV.
En résumé, les données présentées démontrent que la BAG des protéines d’enveloppe de HBV participe à l’entrée virale à travers un déterminant probablement structuré par les résidus cystéines et par les Pro120, Pro153, Lys141 et Trp156.

P32
L’oncoprotéine LMP1 du virus d’Epstein-Barr inhibe l’activité de divers promoteurs cellulaires ou viraux sans induire l’apoptose ou la cytostase

Narbonnet S, Mariame B

CPTP-U563 Inserm, CHU Purpan, BP 3028, 31024 Toulouse Cedex 3
<bernard.mariame@toulouse.inserm.fr>

La protéine LMP1 du virus d’Epstein-Barr (EBV) est considérée comme l’oncoprotéine majeure de ce virus car elle peut transformer in vitro des fibroblastes de rongeurs et car elle est exprimée dans de nombreuses tumeurs humaines associées à l’EBV. Sur le plan biochimique, elle est surtout connue pour sa capacité à activer diverses voies de signalisation et facteurs de transcription comme NFα B, AP1, certains STAT ainsi que des kinases comme la PI3K ou la p38MAPK. Parallèlement à ce potentiel activateur, nous avons observé que la LMP1 inhibait aussi l’activité de divers promoteurs. Nous nous sommes donc fixés pour but d’identifier les régions de la protéine responsables de cette capacité inhibitrice et de déterminer s’il existait un lien entre cette fonction et la capacité de la LMP1 à induire la cytostase ou l’apoptose, comme décrit par différents auteurs.
Les tests d’inhibition ont été réalisés par cotransfection dans des cellules DG75 d’un vecteur exprimant le gène BNLF1, codant la LMP1, et de différents vecteurs contenant le gène de la luciférase sous le contrôle des promoteurs dont nous voulions tester la sensibilité à cette inhibition. Cette première approche nous a permis de montrer que des promoteurs constitutifs forts, comme les promoteurs IE-CMV ou du gène codant le facteur d’élongation des protéines EF1α, étaient très fortement inhibés, alors que le promoteur E-SV40 ne l’était pas. Pour localiser les régions de la protéine impliquées dans cette activité, nous avons construit un premier mutant délété de toute la région carboxyterminale intracytoplasmique de la protéine, qui contient les domaines d’activation (CTAR). Ce mutant, qui conservait la même capacité inhibitrice que la protéine sauvage, nous a donc orientés vers les domaines transmembranaires (TM) de la protéine et nous avons réalisé des mutants délétés de 2 ou 4 des 6 domaines TM de la protéine. Parmi ces mutants, seul un mutant n’ayant conservé que les domaines TM 1et 2 avait perdu la capacité inhibitrice de la protéine sauvage, ce qui situait les régions impliquées dans les domaines TM 3-4 et 5-6.
Pour vérifier ensuite si cette inhibition de divers promoteurs induisait l’apoptose ou la cytostase, nous avons cotransfecté des cellules DG75 avec un vecteur exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur E-SV40 (insensible à l’inhibition par la LMP1) et différents vecteurs exprimant la protéine LMP1 sauvage ou divers mutants, inhibiteurs ou non. Les cellules ont ensuite été marquées avec le colorant fluorescent CMTMR qui se fixe de manière irréversible dans les cellules et permet de suivre leur division. Nous avons ainsi pu montrer que les cellules exprimant simultanément la GFP et la LMP1 ou n’importe lequel des mutants testés, se divisaient au même rythme que les cellules de la même expérience, non transfectées et n’exprimant donc ni la GFP ni la LMP1. Ces résultats indiquaient donc que ni la LMP1 ni aucun de ses mutants conservant son pouvoir inhibiteur, n’induisait de cytostase.
Cette expérience a été répétée pour analyser l’éventuelle induction d’apoptose dans les mêmes conditions. Mais dans ce dernier cas, les cellules ont été triées afin de séparer les cellules exprimant la GFP de celles ne l’exprimant pas. Nous avons montré par western-blot que seules les cellules exprimant la GFP exprimaient aussi la LMP1. Par contre, ni les cellules exprimant la LMP1 ni les cellules ne l’exprimant pas, ne montraient une quelconque augmentation du clivage de la protéine PARP, considéré comme un marqueur sensible et précoce de l’apoptose.
En conclusion, nous avons montré que l’oncoprotéine LMP1 du virus d’Epstein-Barr est capable d’inhiber l’activité de divers promoteurs cellulaires ou viraux. Cette capacité réside dans les domaines TM 3-4 et 5-6. Toutefois, en dépit de cette capacité à inhiber de nombreux promoteurs, la LMP1 n’induit ni cytostase ni apoptose, au moins dans le modèle des cellules DG75. Nos résultats suggèrent donc que l’apoptose et la cytostase que divers auteurs associent à l’expression de la LMP1, dépendent de mécanismes différents de celui utilisé par cette protéine pour inhiber différents promoteurs.

P33
Caractérisation de la régulation post-transcriptionnelle par la protéine IE4 du virus de la varicelle et du zona (VZV)

Ote I, Bontems S, Piette J, Sadzot-Delvaux C

Université de Liège, Service de virologie et d’immunologie, Tour de Pathologie B23, B-4000 Liège, Belgique.
<iote@student.ulg.ac.be>

Bien que les mécanismes demeurent inconnus, la protéine IE4 du virus de la varicelle et du zona (VZV), un alphaherpesvirus humain, agirait au niveau post-transcriptionnel [Defechereux et al. 1993, 1997 ; Baudoux et al. 2000]. Dans notre étude, nous avons donc entrepris de mettre en évidence des protéines interagissant avec la protéine IE4 et pouvant être associées à ses propriétés de régulation post-transcriptionnelle.
Nous avons réalisé une expérience de double hybride en levures, système développé chez Saccharomyces cerevisiae pour détecter de nouvelles interactions protéiques. La région de la protéine IE4 que nous avons choisie pour réaliser ce double hybride contient les domaines Rb et Rc, domaines qui semblent importants pour les interactions protéiques de la protéine [Moriuchi et al. 1995 ; Defechereux et al. 1998]. La banque que nous avons criblée est une banque d’ADNc de cellules humaines HeLa.
Lors de cette expérience de double hybride en levures, nous avons pu mettre en évidence des interactions avec différentes protéines ayant un rôle dans le métabolisme des ARNm. Ces résultats appuient l’hypothèse selon laquelle la protéine IE4 posséderait des propriétés de régulation post-transcriptionnelle. Parmi ces protéines, nous avons identifié les trois facteurs d’épissage ASF/SF2, SFRS7 et SRp20. Ces trois protéines riches en sérine/arginine (SR) sont essentielles pour l’assemblage du splicéosome et l’épissage alternatif de certains pré-ARNm [Graveley 2000]. Toutes les protéines SR possèdent de nombreux résidus sérine phosphorylables de façon réversible et leur niveau de phosphorylation régule leurs interactions avec l’ARN et leur activité d’épissage [Misteli and Spector 1997]. Ainsi une hypophosphorylation de ces protéines SR les empêche de jouer leur rôle dans l’assemblage du splicéosome et inhibe l’épissage des ARNm cellulaires.
Ces résultats suggèrent que la régulation des propriétés d’épissage des protéines SR puisse être une cible de l’interférence virale sur la machinerie de l’hôte, défavorisant l’expression protéique cellulaire au profit d’une propagation virale. Nous avons donc entrepris d’étudier l’influence de la protéine IE4 sur l’état de phosphorylation de ces trois facteurs et leur rôle dans l’épissage des ARNm cellulaires dans un contexte d’infection.

1. Baudoux L, Defechereux P, Rentier B, Piette J. J Biol Chem 2000 ; 275 : 32822-31.
2. Defechereux-de Maisieres PD, Baudoux-Tebache L, Merville MP, Rentier B, Bours V, Piette J. J Biol Chem 1998 ; 273 : 13636-44.
3. Defechereux P, Debrus S, Baudoux L, Rentier B, Piette J. J Virol 1997 ; 71 : 7073-9.
4. Defechereux P, Melen L, Baudoux L, Merville-Louis MP, Rentier B, Piette J. J Virol 1993 ; 67 : 4379-85.
5. Graveley BR. RNA 2000 ; 6 : 1197-211.
6. Misteli T, Spector DL. Nat Biotechnol 1997 ; 15 : 961-4.
7. Moriuchi M, Moriuchi H, Debrus S, Piette J, Cohen JI. Virology 1995 ; 208 : 376-82.

P34
Amélioration du transfert de gènes à la muqueuse intestinale par des vecteurs adénoviraux portant des fibres du sous-groupe B et D

Lecollinet S¹, Gavard F¹, Havenga M², Spiller B³, Eloit M¹, Richardson J¹

¹UMR1161 de virologie ENVA/INRA/AFSSA, École nationale vétérinaire d’Alfort ; ²Crucell, Leiden, Pays-Bas ; ³Virus Receptor and Immune Evasion Group, Cardiff University, Royaume-Uni.
<slecollinet@vet-alfort.fr>

Le développement de vaccins administrés par voie orale à la fois sûrs et efficaces demeure un objectif important. Les vecteurs adénoviraux (Ad) non réplicatifs, dérivés des adénovirus humains du sous-groupe C, sont capables d’induire des réponses immunitaires humorales et cellulaires intenses et durables après administration parentérale, mais s’avèrent peu efficaces après administration orale. Cette inefficacité pourrait découler du faible transfert de gènes à l’épithélium intestinal différencié, en relation avec une faible disponibilité au pôle apical des récepteurs de haute affinité reconnus par la fibre de l’adénovirus. À ce jour, 51 sérotypes d’adénovirus humains, dont les fibres reconnaissent différents récepteurs cellulaires aux distributions tissulaires variées, ont été identifiés. Cette diversité naturelle a été mise à profit dans notre étude afin d’identifier des vecteurs adénoviraux efficaces pour le transfert génique à l’épithélium intestinal. Nous avons comparé le comportement de vecteurs dérivés de l’Ad5 (sous-groupe C) pseudo-typés avec les fibres de plusieurs sérotypes humains différant dans leur tropisme naturel, dans des modèles humain et murin de culture d’épithélium intestinal différencié. Un épithélium intestinal polarisé a été reconstitué in vitro et les capacités en termes de transduction, liaison ou transport au pôle basolatéral des différents Ad pseudo-typés ont été mesurées. Des expériences d’inhibition faisant appel à des anticorps ou des ARN interférents nous ont permis de comprendre les interactions moléculaires nécessaires à un attachement efficace. Nous avons trouvé que des vecteurs différant seulement par leur protéine fibre présentaient des capacités très diverses de transfert de gènes à l’épithélium intestinal différencié humain. Ces différences provenaient essentiellement d’efficacités variables dans l’attachement des vecteurs à la surface de l’épithélium polarisé, mais aussi dans les étapes ultérieures de l’entrée en particulier pour les vecteurs portant les fibres du sous-groupe B. Ainsi, les vecteurs portant les fibres du sous-groupe B et la fibre du sérotype 32 (AdF32, sous-groupe D) ont transduit l’épithélium humain depuis le pôle apical avec une bien meilleure efficacité que l’Ad5 (> 42, 92,2 et 9,8 ULR/mg de protéines, respectivement). Une telle efficacité pouvait être corrélée avec leur capacité à utiliser la molécule CD46 ou des groupements sialylés, respectivement, comme récepteur d’attachement au lieu de CAR. Ces résultats suggèrent que le transfert de gènes à l’épithélium digestif pourrait être fortement amélioré en exploitant le tropisme de sérotypes existants d’adénovirus humains.

P35
Diminution du nombre des cellules dendritiques circulantes au cours de la virémie dengue : rôle dans la pathogenèse ?

De Carvalho Bittencourt M¹, Haug D1, Verlaeten O¹, Martial J¹, Lagathu G¹, Cabie A², Thomas L³, Césaire R¹

¹Laboratoire de virologie-immunologie ; ²Service des maladies infectieuses et tropicale ; ³Service d’accueil des urgences, CHU, 97200 Fort-de-France
<mcarvalhob@gmail.com>

L’évolution clinique de la dengue est variable, allant de l’absence de symptômes jusqu’à la forme hémorragique, voire au syndrome de choc. Les mécanismes impliqués dans sa pathogenèse restent méconnus. La forme hémorragique est associée à des virémies plus élevées que la fièvre dengue classique. L’intensité de la réplication virale pendant les phases initiales de l’infection pourrait donc influencer l’évolution clinique : il est important d’évaluer l’impact sur les cellules dendritiques. Ces cellules ont un rôle prépondérant dans la modulation des réponses immunes antivirales spécifiques. Le but de cette étude est d’évaluer l’impact de la virémie de la dengue sur le nombre des deux principales sous-populations de cellules dendritiques (CD) circulantes (myéloïdes-Cdmy et plasmacytoïdes-CDp).
Les patients inclus se sont présentés du 19 septembre au 24 novembre 2005 au service des urgences avec un tableau clinique compatible avec une virémie dengue (fièvre datant de moins de 5 jours). Le diagnostic virologique a été effectué par RT-PCR nichée, avec des amorces communes puis spécifiques de chaque génotype. Le nombre absolu de CDmy et CDp dans le sang périphérique a été déterminé par cytométrie en flux avec des anticorps anti-Lin, anti-CD123, anti-CD11c, anti-CD45 et anti-HLA DR sur sang total frais anticoagulé, en utilisant des tubes Trucount^® (avec des billes fluorescentes) pour la détermination du nombre absolu des CD par millilitre de sang. L’analyse en cytométrie a été réalisée dans les 24 heures suivant le prélèvement. Les comparaisons statistiques ont été réalisées avec les tests de Student’s t ou de Mann-Whitney Rank Sum. Les moyennes sont présentées avec leurs erreurs standards.
Deux groupes de patients ont été établis en fonction du résultat de RT-PCR : groupe dengue (n = 35) et groupe témoin maladie (suspicion clinique de dengue non confirmée en RT-PCR, n = 14). Un groupe témoin de 23 sujets sains a été également inclus. L’âge ne différait pas entre les trois groupes : dengue (34 + 2 ans, 17-71 ans), témoin maladie (36 + 5 ans, 15-90 ans), sujets sains (31 + 2 ans, 19-62 ans). Le nombre des Cdmy circulantes dans le groupe dengue était réduit à un tiers de celui du groupe témoin sujets sains (5 000 + 700 versus 16 800 + 1 200 cellules/mL respectivement, p < 0,001) et la moitié de celui du groupe témoin maladie (10 700 + 1 500 cellules/mL, p < 0,001). Le nombre des CDmy du groupe témoin maladie était également réduit significativement par rapport au groupe sujets sains (p = 0,005). Les CDp du groupe dengue était réduit à la moitié de celui du groupe témoin sujets sains (4 600 + 600 versus 11 000 + 1 000 cellules/mL respectivement, p < 0,001). Les CDp étaient également moins nombreuses dans le groupe dengue que dans le groupe témoin maladie (9 300 + 1 200 cellules/mL, p < 0,001). Cependant, la réduction du nombre des CDp semble être spécifique de la dengue, puisqu’il n’y avait pas de différence significative entre le nombre de CDp dans le groupe témoin maladie par rapport au groupe sujets sains (p = 0,31). Au sein du groupe dengue, il n’y avait pas de différence du nombre des CDmy circulantes entre les patients infectés par les génotypes DEN2 (n = 17) et DEN4 (n = 16) du virus (5 100 + 1 200 versus 4 800 + 1 000 cellules/mL respectivement, p = 0,81), ni des CDp circulantes (4 700 + 900 versus 4 200 + 1 000 cellules/mL pour les DEN2 et 4 respectivement, p = 0,81). Seuls deux patients étaient infectés par le DEN3.
En conclusion, le nombre des CDmy et CDp est fortement diminué au cours d’une virémie dengue comparativement au nombre observé dans un groupe de sujets sains et de patients atteints par une maladie fébrile aiguë autre. Ces résultats seront corrélés à la charge virale en cours d’analyse et à l’évolution clinique afin d’établir si cette mesure peut être utilisée comme un marqueur pronostique au regard de la sévérité de la fièvre dengue. L’analyse quantitative sera également associée à une analyse de la fonction des CD, spécialement la fonction sécrétrice d’interférons de type I par les CDp, afin d’évaluer l’hypothèse d’une influence dans la pathogenèse d’un déficit de la sécrétion de ces cytokines essentielles dans les réponses antivirales.

P36
Identification d’une protéine de lyssavirus qui interagit avec la cytochrome c oxydase et qui inhibe l’activité de la chaîne respiratoire mitochondriale

Gholami A¹, Kassis R¹, Real E², Obach D¹, Larrous F¹, Jacob Y², Bourhy H¹

¹Unité postulante de recherche et d’expertise Dynamique des lyssavirus et adaptation à l’hôte ; ²Unité postulante de génétique, papillomavirus et cancer humain, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur-Roux, 75724 Paris Cedex 15
<ali@pasteur.fr>

La mort cellulaire programmée ou apoptose des neurones est un mécanisme fréquent de réponse post-traumatique et de réaction face à l’infection. Ce mécanisme participe aussi à la physiopathologie de l’infection par les lyssavirus, virus qui infectent le système nerveux et sont responsables de la rage. La protéine de matrice (M) des lyssavirus, induit l’apoptose dans les cellules humaines [Kassis et al., 2004]. Les mécanismes moléculaires impliqués dans l’induction de l’apoptose par voie mitochondriale sont actuellement inconnus. Ce présent travail montre que la protéine de matrice du lyssavirus Mokola présente une localisation mitochondriale et qu’elle induit l’apoptose. L’analyse des interacteurs de la protéine M par système double hybride à partir d’une banque de cDNA de neurones humains, montre une interaction avec la sous-unité 1 de la cytochrome c oxydase (cox1), une protéine impliquée dans la chaîne respiratoire mitochondriale.
L’association physique de la protéine M avec cox1 est confirmée par microscopie confocale et par coprécipitation. La signification biologique de cette interaction est vérifiée par une baisse spécifique de l’activité cox dans un système in vitro en présence de la protéine M. Afin de déterminer les zones d’adressage mitochondrial et responsables de l’induction de l’apoptose, plusieurs mutants de délétion de la protéine M ont été produits. Ces fragments ont été criblés par une série de tests fonctionnels comprenant la localisation mitochondriale, la libération du cytochrome c dans le cytoplasme, l’activation de la caspase 9 et l’activité cox. Cette analyse démontre que certains fragments comprenant les amino-acides 46 à 110 conservent toutes les propriétés correspondantes de la protéine M entière. Les résultats des expériences menées avec ces sous-fragments et les analyses de mutagenèse dirigée permettent de déterminer la séquence la plus courte capable d’induire l’apoptose par la voie mitochondriale dans les cellules humaines. Il s’agit de la première description de la fixation d’une protéine virale à la cytochrome c oxydase à l’origine de la perturbation de la respiration cellulaire et de l’apoptose.

P37
Le virus de l’hépatite C est internalisé par une voie d’endocytose dépendante de la clathrine

Blanchard E¹, Belouzard S¹ Goueslain L¹, Wakita T², Dubuisson J¹, Wychowski C¹, Rouille Y¹

¹CNRS-UPR2511, Institut de Biologie de Lille ; ²Department of Microbiology, Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience, Tokyo, Japan
<emmanuelle.blanchard@ibl.fr>

Durant plus de 15 ans, l’absence de système de culture cellulaire permettant d’amplifier efficacement le virus de l’hépatite C (VHC) a considérablement limité les connaissances sur le cycle infectieux de ce virus. Ces dernières années, pour contourner ce problème, un système de production de pseudoparticules rétrovirales infectieuses exprimant à leur surface les glycoprotéines d’enveloppe du VHC (ppVHC) a été généré. Récemment, l’obtention de l’ADNc complet d’une souche de VHC (clone JFH1 isolé par le Dr Wakita T) pouvant initier la production de virus infectieux (ccVHC) après transfection dans des cellules a permis de reproduire pour la première fois le cycle infectieux complet du VHC en culture cellulaire. Des travaux récents suggèrent que le ppVHC infecte les cellules cibles par un mécanisme de fusion dépendant du pH acide des endosomes. Cela suggère que l’entrée du VHC nécessiterait une étape préalable d’internalisation par endocytose. Cependant, la ou les voies d’endocytose ainsi que le trafic intracellulaire du VHC restent encore à définir.
Notre objectif est d’étudier ces mécanismes d’entrée. L’entrée des ppVHC a été mesurée par PCR quantitative en temps réel après 3 heures de contact avec des cellules d’origine hépatocytaire, et l’infection des ccVHC a été quantifiée par des analyses d’immunofluorescence et d’immunoblot. Nous avons pu montrer que l’entrée des ppVHC et l’infection des ccVHC sont inhibées d’une part par le prétraitement des cellules par la chlorpromazine, un inhibiteur de la formation des puits recouverts de clathrine à la membrane plasmique, et d’autre part, par la déplétion des cellules en clathrine à l’aide de petits ARN interférents. Nous avons aussi montré que l’entrée des ppVHC ainsi que l’infection des ccVHC sont inhibées par le prétraitement des cellules avec la bafilomycine A1 et la chroroquine, deux drogues connues pour neutraliser le pH des endosomes. Ces données indiquent que le VHC infecte les cellules cibles par la voie d’endocytose de la clathrine, suivie d’une étape de fusion dans un compartiment endosomal acide.

P38
La protéine de mouvement du virus de la mosaïque du tabac est-elle une MAP ?

Boutant E, Ashby J, Seemanpillai M, Ritzenthaler C, Heinlein M
<emmanuel.boutant@ibmp-ulp.u-strasbg.fr>

Le virus de la mosaïque du tabac (VMT), un tobamovirus, possède un génome constitué d’un ARN simple brin de polarité positive codant pour quatre protéines, dont la protéine de mouvement ou MP. Cette protéine est indispensable au mouvement de cellule à cellule de l’ARN viral. Durant le cycle viral, la MP est associée initialement aux plasmodesmes, mais aussi avec différentes structures subcellulaires comme le réticulum endoplasmique (RE) ou à un stade plus tardif avec les microtubules (MT). La fonction de ces composants dans le transport de l’ARN du VMT est encore très controversée. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la localisation tardive de la MP sur les microtubules lors de l’infection virale et essayons de comprendre le mécanisme d’association de la MP aux MT ainsi que les propriétés éventuelles de la MP sur la dynamique microtubulaire.
Pour répondre à ces interrogations, nous avons utilisé deux approches différentes : le traitement aux agents déstabilisants les MT tels que l’amiprophosméthyl (APM) ou l’oryzaline (ORY) et la FRAP (fluorescence recovery after photobleaching). Cette dernière consiste à suivre après photoblanchiment par irradiation laser d’une zone déterminée, la récupération de fluorescence. Cette étude a été réalisée soit ors d’une infection de cellule avec le virus VMT-MPwt:GFP codant pour une MP fusionnée à la GFP, soit hors contexte viral. Dans ce cas, nous avons créé et utilisé deux lignées cellulaires de tabac BY2 exprimant de manière stable des protéines de fusion à la GFP. La lignée MPwt:GFP permet l’expression de la MP sous le contrôle du promoteur inductible à la dexaméthasone et la lignée GFP :MAP65.5 exprime une protéine d’A. thaliana associée aux MT, son expression étant placée sous le contrôle du promoteur constitutif 35S.
Le traitement aux agents déstabilisants consiste à observer l’effet de l’APM et de l’ORY sur les MT lorsque la MP du TMV est produite de manière transitoire ou lors de la virose. Ainsi, des cellules BY2 sauvages ont été infectées soit avec VMT-MPwt:GFP, soit avec VMT-MPP81S: GFP, traités pendant une heure avec de l’APM ou avec de l’ORY, immunomarqués et analysés par microscopie confocale. À la différence de la VMT-MPwt:GFP, le mutant VMT-MPP81S:GFP exprime une MP non fonctionnelle, incapable de promouvoir le mouvement du TMV et dont la localisation est purement cytosolique. Enfin, la construction 35S-MP:YFP permet l’expression d’une MP fonctionnelle utilisée pour l’étude hors contexte viral.
Nous observons, quelle que soit la manière dont la MP est produite (contexte viral ou expression transitoire), une récupération uniforme de la fluorescence de la MP-GFP au niveau des MT des zones photoblanchies. Le même phénomène est observé pour la lignée GFP:MAP65.5. Indépendamment de la manière dont la MP est synthétisée (expression transitoire ou virus), nous observons qu’en présence d’une MP fonctionnelle associée aux MT, les MT ne sont que faiblement dépolymérisés. Par contre, en présence de la MP mutante MPP81S:GFP, les MT sont dépolymérisés comme dans le témoin non infecté.
Nos résultats démontrent que la présence de la MP sur les MT a pour effet de stabiliser les MT contre des agents dépolymérisant tels APM ou ORY et ce, de manière indépendante de l’infection virale. De plus, nos résultats de FRAP montrent que le recrutement de la MP sur les MT s’effectue de manière similaire à celui de la GFP-MAP65.5 dont on sait qu’il s’effectue par un ancrage latéral de la protéine aux MT.
L’ensemble de ces résultats semble indiquer que la MP du VMT se comporte comme une protéine structurale associée aux microtubules ou MAP dont la fonction dans le mouvement viral reste encore à élucider.

P39
Modulation de l’expression de la protéine ICAM1 en réponse aux cytokines pro-inflammatoires par le virus de la varicelle et du zona

El Mjiyad N, Bontems S, Ote I, Piette J, Sadzot-Delvaux C

Université de Liège, Service de virologie et d’immunologie, Tour de Pathologie B23, B-4000, Liège, Belgique
<nelmjiyad@ulg.ac.be>

Une récente étude a mis en évidence une diminution de l’expression de la protéine ICAM1 (intercellular adhesion molecule-1) dans les lésionscutanées causées par le virus de la varicelle et du zona (VZV) dans un contexte riche en cytokines pro-inflammatoires [Nikkels et al., 2004]. Sur la base de ces observations, nous avons étudié la modulation de l’expression de cette protéine en réponse à des cytokines pro-inflammatoires (IFNα, TNFα et IL1α), dans des mélanocytes humains (MeWo) infectés par le VZV.
Des cellules MeWo infectées ou non par le VZV ont été traitées par les cytokines pro-inflammatoires et l’expression d’ICAM1 a été suivie au cours du temps par western blotting et RT-PCR quantitative. Les voies de transduction activées par ces trois cytokines en présence ou non du virus ont été caractérisées.
Nos résultats indiquent que l’infection par le VZV module négativement l’expression d’ICAM1 induite par un traitement par une cytokine pro-inflammatoire, telle que l’IFNα, le TNFα ou l’IL1α. L’activation de la voie JAK/STAT induite par l’IFNα ne semble pas être régulée négativement par l’infection. Par contre, dans un contexte d’infection, le messager d’icam1 n’est pas induit en réponse à l’IFNα ou au TNFα, bien que sa demi-vie reste inchangée. Enfin, l’analyse de l’activation du NFκB par retard sur gel, montre que, bien que ce facteur soit présent de manière constitutive dans le noyau des cellules infectées, il est incapable de se lier à une sonde portant la séquence NFκB proximale du promoteur du gène icam1.
L’ensemble de ces résultats suggère que le virus ne perturbe pas la voie de signalisation médiée par les protéines JAK/STAT mais interfère avec l’activation d’icam1 par le NFκB médiée par l’IFNα, le TNFα et l’IL1α. L’inhibition de l’expression de la protéine ICAM1 dans un contexte d’infection diminuerait la capacité de la cellule infectée à interagir avec les cellules voisines, en particulier avec les cellules du système immunitaire. De manière plus générale, la capacité du virus à interférer avec le NFκB, facteur de transcription central dans l’activation de la réponse immunitaire consituerait un mécanisme d’échappement au système immunitaire.

P40
Identification des partenaires de la protéine VP22 du virus de la maladie de Marek par une analyse protéomique

Blondeau C, Belghazi M, Courvoisier K, Vautherot JF, Denesvre C

Centre INRA, UR BASE 086, Laboratoire de virologie moléculaire et immunologie, 37380 Nouzilly.
<cblondea@tours.inra.fr>

Le virus de la maladie de Marek (MDV) est un herpèsvirus pathogène chez le poulet, d’intérêt économique majeur en élevage avicole malgré une vaccination largement pratiquée. Très associé aux cellules, il présente des caractéristiques de dissémination et de morphogénèse particulières par rapport aux autres alpha-herpèsvirus. Plusieurs gènes ont été rapportés comme nécessaires dans la réplication du virus MDV en culture. Notre laboratoire a identifié le gène UL49 qui code pour la protéine VP22 comme essentiel dans la dissémination du virus en cellules primaires de peau de poulet (CESC) [Dorange et al. 2002]. Le MDV est le seul alpha-herpèsvirus connu pour lequel ce gène est indispensable.
Afin de mieux comprendre le rôle du gène UL49 dans ce processus, nous avons choisi d’identifier les partenaires cellulaires et viraux de la protéine VP22 de MDV dans des cellules de poulet par la méthode de purification d’affinité en tandem (TAP). Pour cela, le gène UL49 a été fusionné en 5’ à la séquence TAPTag, qui code pour deux domaines de liaison aux IgG de la protéine A de Staphylococcus aureus et un peptide de liaison à la calmoduline (CBP) séparé par un site protéasique rare (celui du virus de plante TEV). La protéine TAP VP22 a été exprimée dans des cellules CESC à partir d’un MDV recombinant Bac20 TAPVP22. Les protéines interagissant avec la protéine TAP VP22 après deux étapes d’affinité ont été séparées par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). Dix protéines partenaires potentielles, directes ou au sein de complexes, ont été identifiées par spectrométrie de masse MS/MS. Certaines d’entre elles sont en cours de vérification par d’autres approches.

P41
Le suppresseur de PTGS P0 des polerovirus possède un motif F-box-like

Pazhouhandeh M¹, Dieterle M^1,2, Marrocco K², Lechner E¹, Berry B^1,4, Brault V⁵, Hemmer O¹, Kretsch T³, Richards KE¹, Genschik P¹, Ziegler-Graff V¹

¹Institut de biologie moléculaire des plantes du CNRS, 12 rue du Général Zimmer, 67084 Strasbourg ; ²CRP-Santé, 84 Val fleuri, L-1526 Luxembourg, Luxembourg ; ³Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Institut für Biologie 2/Botanik, Schänzlestrasse 1, D-79104 Freiburg, Germany ; ⁴Current address : Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur-Roux, 75724 Paris ; ⁵Institut national de la recherche agronomique, 28 rue de Herrlisheim, 68021 Colmar
<pazhohandeh@yahoo.com>

Les polerovirus sont des virus de plante qui sont répandus dans le monde entier et qui causent des dégâts économiquement importants sur des gammes d’hôtes variées. Leur génome est constitué d’un ARN simple brin de polarité positive contenant six cadres ouverts de lecture. Parmi eux, le gène codant pour la protéine P0 situé à l’extrémité 5’ (29 kDa) est un suppresseur de PTGS (post-transcriptional gene silencing). Le criblage d’une banque d’ADNc d’Arabidopsis thaliana en système double hybride de levure nous a permis d’identifier des partenaires cellulaires de la protéine P0 du virus de la jaunisse des cucurbitacées transmis par puceron ou CABYV (cucurbit aphid-borne yellows polerovirus). Il s’agit des protéines ASK1 et ASK2 (Arabidopsis SKP1-related protein) qui sont des orthologues de la protéine SKP1 de levure intervenant dans les complexes E3 ubiquitine ligase de type SCF (SKP-culline-F-box). Ces complexes interviennent dans l’ubiquitination de protéines destinées à la dégradation par le protéasome 26S. Parmi les 21 gènes ASK identifiés chez A. thaliana, ASK1 et ASK2 jouent un rôle essentiel dans le développement des plantes. La protéine P0 du virus de la jaunisse occidentale de la laitue ou BWYV (beet western yellows polerovirus) interagit de manière similaire avec les protéines ASK1 et 2. Une approche de complémentation par fluorescence bimoléculaire (BiFC) nous a permis de confirmer l’existence de cette interaction in planta. Les protéines P0 des polerovirus possèdent un motif F-box-like LPxxI/L dans leur partie de N-terminale. En introduisant des mutations ponctuelles dans ce motif, les protéines P0 du CABYV et du BWYV perdent leur capacité à interagir avec les protéines ASK dans la levure. Cette perte d’interaction conduit également à la perte de l’activité de suppression de PTGS. Transposées dans le génome viral, ces mutations sont responsables de la forte diminution du pouvoir pathogène de ces virus. Afin de démontrer l’importance de l’interaction P0-ASK dans l’infectivité des polerovirus, nous avons utilisé une approche par VIGS (virus induced gene silencing) pour inhiber l’expression des gènes SKP de Nicotiana benthamiana (orthologues des gènes ASK). Des plantes de N. benthamiana ont été inoculées avec le PVX (virus X de la pomme de terre) ou un PVX recombinant dans lequel a été cloné un gène SKP. Après extinction du gène SKP, les plantes ont été sur-inoculées par le BWYV. Les plantes PVX-SKP qui présentent une forte diminution du taux de la protéine SKP sont résistantes à l’infection par le BWYV, alors que les plantes témoins PVX restent sensibles au virus. En conclusion, la protéine P0 possède une séquence consensus de protéine à F-box essentielle à l’interaction avec les protéines ASK. Nous proposons que par cette interaction, la protéine P0 pourrait adresser un facteur essentiel de la voie du gène silencing vers le protéasome où il serait dégradé, inhibant de ce fait la cascade du PTGS.

P42
Caractérisation de la protéine d’enveloppe M022L du virus myxomateux

Pignolet B, Gelfi J, Top S, Duteyrat JL, Bertagnoli S.

UMR 1225 Interactions hôtes-agents pathogènes, INRA-ENVT, École nationale vétérinaire, 23 chemin des Capelles, BP87614, 31076 Toulouse Cedex 03
<b.pignolet@envt.fr>

Le virus de la myxomatose (VM) appartient à la famille des Poxviridae, genre Leporipoxvirus. Il est l’agent responsable de la myxomatose, une maladie infectieuse majeure chez le lapin européen. Comme tous les membres de sa famille, son cycle viral cytoplasmique est complexe avec la succession de différentes formes virales. Ainsi, voit-on apparaître rapidement des virions mâtures intracellulaires (IMV), qui donneront naissance à des virions intracellulaires enveloppés (IEV) par acquisition d’une double enveloppe supplémentaire. Ces particules virales IEV vont ensuite pouvoir fusionner avec la membrane plasmique générant des particules ayant perdu une de leurs membranes et appelées EEV (extracellular enveloped virus). Bien que les mécanismes impliqués dans les différents stades de la morphogenèse virale soient bien documentés en ce qui concerne le virus de la vaccine (VACV, poxvirus modèle), il n’en est guère de même pour le virus myxomateux.
L’objectif de ce travail est donc d’établir des parallèles entre les mécanismes impliqués dans la morphogenèse du VACV et du VM. F13L est la protéine la plus abondante présente au niveau de l’enveloppe des formes virales tardives (IEV/EEV) chez le VACV. Cette protéine semblerait jouer un rôle important dans l’acquisition de l’enveloppe des IEV/EEV, la sortie et la transmission du virus. C’est pour cela que nous nous sommes tout particulièrement intéressé à la protéine M022L homologue à la protéine F13L du VACV.
Dans un premier temps, nous avons tenté de construire un virus délété pour ce gène. Notre incapacité à purifier un tel virus, nous a conduits à émettre l’hypothèse que cette protéine serait essentielle au cycle viral, et ce contrairement à son homologue F13L. Cette nouvelle observation nous a poussés à explorer de façon plus approfondie son rôle au cours du cycle. Pour cela, nous avons cloné M022L en fusion avec la GFP et étudié sa localisation cellulaire. M022L est exprimée en tant que protéine cytoplasmique et localisée de manière ponctiforme. Une des particularités des protéines F13L et M022L est la présence d’un motif HKD atypique caractéristique du site catalytique des phospholipases D. La phospholipase D1 et F13L colocalisent avec les endosomes précoces et les lysosomes. F13L est aussi présente au niveau de l’appareil de Golgi. Nous avons donc voulu savoir ce qu’il en était pour M022L. Les résultats d’expériences de colocalisation nous indiquent que M022L serait elle aussi localisée au niveau du réticulum endoplasmique, mais aussi dans les endosomes précoces, les lysosomes, mais aussi probablement au niveau de l’appareil de Golgi. Ces premiers résultats nous indiquent que M022L aurait un trafic intracellulaire complexe. Lorsque l’on mute le site catalytique HKD atypique, la localisation de la protéine est altérée. En effet, nous avons observé un marquage diffus dans tout le cytoplasme de la cellule. Cela semble donc indiquer que l’intégrité du site HKD atypique serait nécessaire au trafic normal de la protéine. De plus, l’expression après transfection de cellules eucaryotes de M022L conduit au bout de 48 heures à une cytotoxicité s’exprimant par la présence de pseudo-plages de lyse proches de celles observées lors d’une infection par le VM.
Ces observations et l’étude de virus mutés en divers sites du gène M022L posent la question du rôle de cette protéine dans le cycle viral et l’expression du pouvoir pathogène.

P43
Analyse de l’interaction CD4-CXCR4 dans la fusion membranaire dépendante de la glycoprotéine d’enveloppe du VIH1

Basmaciogullari S^1,2, Pachecco B¹, Bour S³, Benichou S², Sodroski J¹

¹Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA ; ²Institut Cochin, Inserm U567, CNRS UMR8104, Université Paris 5, Département des maladies infectieuses, Paris ; ³NIAID, Bethesda, MD, USA
<basmaciogullari@cochin.inserm.fr>

Dans cette étude, nous avons tenté de déterminer d’éventuelles interactions entre le récepteur du VIH1, CD4, et les deux corécepteurs principaux, CXCR4 et CCR5. Nous avons observé que CD4 et CXCR4 exprimés de façon transitoire dans des cellules HEK293T forment un complexe qui peut être immunoprécipité avec des anticorps dirigés contre les domaines extracellulaires de ces protéines. Une étude approfondie par mutagénèse dirigée a révélé que le domaine d’interaction de CD4 avec CXCR4 est localisé dans la partie cytoplasmique de CD4, avec une contribution majeure des acides aminés basiques localisés en position 400-402 et 411-412. Le complexe CD4-CXCR4 peut également être reconstitué en incubant un lysat de cellules exprimant CD4 avec un lysat de cellules exprimant CXCR4. Nous avons examiné le rôle de l’interaction CD4-CXCR4 dans le contexte de l’infection par le VIH1 et nous avons observé que l’efficacité de la fusion membranaire induite par la glycoprotéine d’enveloppe du VIH1 est indépendante de la capacité de CD4 à interagir avec CXCR4, que la fusion soit analysée dans un modèle de formation de syncytia ou dans un modèle d’entrée du virus en utilisant un système de cycle unique de réplication. Nous avons également mis en évidence une interaction entre CXCR4 et le domaine cytoplasmique de CD8α. Cette interaction s’est avérée topologiquement comparable à l’interaction observée entre CXCR4 et CD4. Il est donc possible que les interactions de CXCR4 avec CD4 et CD8α interviennent dans les voies de signalisation lymphocytaires communes entre les molécules CD4 et CD8α.

P44
Les lipoprotéines HDL atténuent l’activité neutralisante des anticorps de patients infectés par le virus de l’hépatite C en facilitant l’entrée virale

Voisset C, Op de Beeck A, Horellou P, Dreux M, Gustot T, Duverlie G, Cosset FL, VuDac N, Dubuisson J
<ngoc.vudac@ibl.fr>

Le modèle de pseudo-particules portant les protéines d’enveloppe du virus de l’hépatite C (ppVHC) assemblées sur une particule d’origine rétrovirale constitue une avancée majeure pour étudier l’entrée du VHC dans ses cellules cibles. De plus, l’utilisation de ces ppVHC a récemment permis de mettre en évidence la présence d’anticorps neutralisants dans le sérum de patients infectés par le VHC. Cependant, l’activité neutralisante de ces anticorps est atténuée par un facteur présent dans le sérum humain. Comme nous avons récemment montré que les lipoprotéines de haute densité (HDL) facilitent l’entrée des ppVHC dans leurs cellules cibles, nous avons voulu poursuivre nos travaux en étudiant la relation entre la facilitation de l’entrée virale médiée par les HDL et le rôle potentiel de ces lipoprotéines dans l’atténuation de l’activité neutralisante du sérum humain. Nous avons montré que les HDL atténuent l’activité neutralisante des anticorps de patients infectés par le VHC. Cette atténuation nécessite la présence du récepteur physiologique des HDL, le scavenger receptor class B type I (SR-BI). Nous avons également montré que certains inhibiteurs du transfert lipidique dépendant de SR-BI sont capables d’augmenter l’effet neutralisant des anticorps, indiquant que la fonction de SR-BI est essentielle pour l’atténuation de l’activité neutralisante des anticorps anti-VHC. Enfin, l’analyse comparative des cinétiques de facilitation de l’entrée médiée par HDL avec celle de l’activité neutralisante des anticorps indique que les HDL atténuent la neutralisation des ppVHC en accélérant l’entrée du virus dans la cellule. En conclusion, nos résultats indiquent que le VHC exploite le rôle physiologique de SR-BI dans le transfert lipidique des HDL pour faciliter son entrée et en conséquence éviter la réponse humorale.

P45
Etude de la résistance aux analogues de nucléosides et de la formation de l’ADNccc du virus de l’hépatite B grâce à un système utilisant des baculovirus VHB recombinants dans des cellules HepG2

Lucifora J, Durantel D, Hantz O, Trepo C, Zoulim F

Inserm U271, 151 cours Albert-Thomas, 69424 Lyon Cedex 03
<lucifora@lyon.inserm.fr>

Il y a quelques années, un système basé sur la transduction de cellules HepG2 avec un baculovirus recombinant contenant 1,3 unité de génome VHB a été décrit pour étudier la réplication et la sensibilité aux antiviraux du virus sauvage et des virus mutants. Avec ce système la formation d’ADNccc a été observée mais l’origine de cet ADNccc (un recyclage des nucléocapsides vers le noyau ou un phénomène de recombinaison à partir du vecteur baculovirus) n’a pas été étudiée. Notre objectif était d’améliorer ce système pour ensuite étudier la réplication du VHB et particulièrement la formation d’ADNccc et la résistance aux antiviraux.
Des baculovirus recombinant contenant 1,1 ou 1,3 unité de génome VHB ont été construits. Pour Bac-VHB1.1, la synthèse de l’ARNpg est sous le contrôle d’un promoteur fort de mammifères alors qu’elle est sous le contrôle des promoteurs naturels du VHB pour Bac-VHB1.3. La construction de Bac-VHB1.1 a été faite de sorte que la synthèse de l’ARNm codant pour les Ag HBe n’est pas possible sans la formation au préalable de molécules d’ADNccc. Les deux types de baculovirus ont été utilisés pour transduire des cellules HepG2 et des études comparatives ont été faites pour établir les paramètres de l’infection (ARN viral, ADN viral, Ag HBs, Ag HBe, ADNccc). D’autres baculovirus recombinants de type 1.1 contenant les mutations qui confèrent les résistances à la lamivudine et/ou à l’adéfovir (cad L180M/M204V, N236T et L180M/M204V/N236T) ont été construits. Ces baculovirus ont été utilisés pour étudier d’une part, la capacité réplicative des virus mutants, leur sensibilité aux antiviraux et les profils de résistances croisées et, d’autre part pour produire des virions mutants en cellules HepG2 qui ont été utilisés pour infecter des cellules HepaRG et étudier leur infectivité.
Premièrement, nous avons montré que Bac-VHB1.1 permet d’obtenir une meilleure réplication du VHB dans les cellules HepG2 que Bac-VHB1.3, ce qui prouve la supériorité de cette nouvelle construction. Ensuite, nous avons montré que les cellules HepG2 de l’ATCC ne sont pas capables de produire un grand nombre de molécules d’ADNccc. De plus, nous avons montré que l’ADNccc formé est le résultat d’un phénomène de recombinaison au niveau du vecteur baculovirus entre les séquences redondantes du VHB plutôt que d’un recyclage des nucléocapsides vers le noyau. Ces résultats remettent en question des résultats obtenus précédemment dans le modèle du DHBV où l’amplification de l’ADNccc par recyclage des nucléocapsides vers le noyau a été démontrée.
Deuxièmement, les résultats des expériences menées pour tester la capacité réplicative et la sensibilité à la lamivudine et à l’adéfovir sont similaires à ceux obtenus précédemment avec un système de transfection : WT > N236T > L180M/M204V > L180M/M204V/N236T pour la capacité réplicative et N236T ou L180M/M204V/N236T moins sensibles à l’adéfovir que WT et L180M/M204V ou L180M/M204V/N236T résistants à la lamivudine. Nous avons aussi montré que bien qu’ayant une capacité similaire à pénétrer dans les cellules HepaRG, les virions produits par ces mutants ont des capacités réplicatives différentes. Ce résultat suggère que le taux d’émergence de ces mutants in vivo pourrait être dû à une différence de sensibilité aux antiviraux et de capacité réplicative mais pas à une différence dans la capacité d’infection.

Vaccins et système immunitaire

Jeudi 20 avril 2006, 14 h à 15 h 15

Communications orales O46 à O50
Communications affichées P51 à P56

O46
Évaluation des vaccins antivarioliques de 1^re, 2^e et 3^e génération

Ferrier-Rembert A¹, Virgone B¹, Tournier JN¹, Drillien R², Crance JM¹, Garin D¹

¹CRSSA Emile Pardé, Grenoble, ²Équipe Propre Inserm 99-08, EFS-Alsace
<audreyferrier@yahoo.fr>

La prise en compte du risque de l’utilisation du virus de la variole comme arme biologique a entraîné la nécessité de disposer d’un vaccin moins dangereux et de traitements efficaces. Le vaccin ayant permis l’éradication de la variole est dit de première génération, c’est un virus vivant produit sur l’animal qui est efficace mais source d’effets adverses sévères, voire mortels. Pour tester de nouveaux vaccins mieux tolérés, il est nécessaire de disposer d’un modèle animal d’infection par un orthopoxvirus. Le cowpoxvirus (CPXV), inoculé par voie intranasale à des souris BALB/c, a été utilisé comme modèle d’infection de la variole afin de tester l’immunogénicité croisée des différents vaccins et leur effet protecteur. L’immunogénicité post-vaccinale est évaluée par quantification des lymphocytes T CD4+ et CD8+ en cytométrie de flux (sécrétion spécifique d’IFNγ par les lymphocytes T activés spécifiquement par des cellules dendritiques infectées avec le virus de la vaccine) et par quantification des anticorps neutralisants (séroneutralisation du virus infectieux en culture cellulaire).
Le modèle murin d’infection intranasale par le CPXV nous a permis de comparer des vaccins antivarioliques de 1^re, 2^e (vaccins vivants, produits en culture cellulaire) et 3^e générations (vaccins vivants, peu réplicatifs chez le mammifère). Les candidats vaccins antivarioliques de 3^e génération MVA, NYVAC, VVHR et VV D4R-, ont été comparés aux vaccins réplicatifs de 1^re et 2^e générations. La protection contre un challenge létal et l’immunogénicité induite à court (J12 et J32) et à long terme (J150) ont été évaluées. À court terme, à condition d’utiliser un rappel à J28, les vaccins de 3^e génération sont comparables aux vaccins réplicatifs. À plus long terme, un rappel avec un vaccin de 3^e génération n’est pas suffisant pour leur garantir une efficacité comparable aux vaccins réplicatifs puisqu’ils n’offrent qu’une protection partielle. Les études de protection à long terme ont également permis de différencier les candidats vaccins de 3^e génération entre eux et montrées que les souches MVA et NYVAC sont plus efficaces que les souches HR et D4R-. Les candidats vaccins antivarioliques doivent donc être évalués sur 150 jours dans le modèle murin. Par ailleurs, une prévaccination par la souche MVA diminue considérablement la taille de la pustule induite par une vaccination avec un vaccin réplicatif réalisée deux semaines plus tard. Cette protection n’est pas obtenue avec des souris immunodéficientes (nude, T déficientes).
Ce type de schéma vaccinal MVA + rappel avec un vaccin réplicatif permettrait de vacciner des sujets naïfs pour leur permettre d’intégrer l’équipe nationale dédiée, dont les membres ont jusqu’à maintenant du faire la preuve d’une vaccination antérieure.

O47
Expression et purification d’une forme monomérique soluble de la glycoprotéine de spicule du SRAS-CoV : évaluation comme candidat vaccin contre le SARS-CoV

Callendret B¹, Lorin V¹, Charneau P², Marianneau P³, Contamin H³, Huerre M⁴, Rose T⁵, Loth P³, Ave P⁴, Van Der Werf S¹, Escriou N¹

¹Unité de génétique moléculaire des virus respiratoires, CNRS URA 1966 ; ²G5 de virologie mMoléculaire et de vectorologie ; ⁴URE Histotechnologie et pathologie ; ⁵Unité d’immunogénétique cellulaire, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur-Roux, 75015 Paris ; ³Unité de biologie des infections virales émergentes, Institut Pasteur, 21 avenue Tony-Garnier, 69007 Lyon.
<escriou@pasteur.fr>

À la fin de l’année 2002, une pneumonie atypique sévère et contagieuse, dénommée SRAS (syndrome respiratoire aigu sévère) a émergé en Chine. L’agent responsable de cette maladie a été rapidement caractérisé et identifié comme étant un nouveau coronavirus d’origine inconnue. Ce virus se dissémina dans 29 pays différents et aura causé, entre novembre 2002 et juillet 2003, 774 décès sur 8 096 patients malades. Bien que l’épidémie de SRAS ait pu être maîtrisée et le risque pandémique écarté, les mécanismes d’introduction du SRAS-CoV restent largement inconnus. Dans la perspective d’une réémergence possible de la maladie, un vaccin efficace constituerait le moyen le plus sûr de circonscrire une nouvelle épidémie.
Le coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV) est un virus enveloppé comprenant un génome à ARN positif monocaténaire non segmenté dont la réplication a entièrement lieu dans le cytoplasme. Parmi les protéines qui composent l’enveloppe du virion, la protéine de spicule (S) assure la reconnaissance du récepteur d’entrée puis la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane plasmique de la cellule hôte. Cette glycoprotéine membranaire de type I (180 kDa) est composée d’un court domaine cytoplasmique, d’un domaine transmembranaire et d’un imposant domaine extracellulaire (ectodomaine) de 1 180 acides aminés. Comme cela a été démontré par des études d’immunisations passives et actives chez l’animal, la glycoprotéine S est aussi la cible d’une réponse humorale en anticorps neutralisants, qui représente le principal effecteur de la réponse protectrice de l’hôte.
Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur le développement d’un candidat vaccin sous-unitaire reposant sur un polypeptide S recombinant produit en cellules de mammifères. Ayant démontré que l’expression des séquences de la protéine S en cellules de mammifères in vitro nécessitait des vecteurs d’expression appropriés, munis de sites donneurs et accepteurs d’épissage ainsi que d’éléments de régulation post-transcriptionnelle comme WPRE (woodchuck posttranscriptionnal regulatory element) ou CTE (constitutive transport element), nous avons entrepris d’établir des lignées stables exprimant une forme soluble et sécrétée de S. Après transduction de cellules de mammifères par des vecteurs lentiviraux dirigeant l’expression de l’ectodomaine de la protéine S, fusionné en son extrémité C-terminale à une étiquette FLAG (Ssol), des clones cellulaires sécrétant le polypeptide Ssol de façon constitutive et à de hauts niveaux ont été sélectionnés et amplifiés. Une chromatographie d’affinité permet de purifier 1 à 2 mg du polypeptide recombinant Ssol par litre de surnageant : une analyse biochimique par ultracentrifugation analytique et spectrométrie de masse a permis de caractériser Ssol comme un monomère glycosylé de 182 kDa. La réactivité de la protéine Ssol avec un panel de sérums de patients infectés par le SRAS-CoV a également été établie.
L’immunogénicité de la protéine Ssol purifiée a été étudiée dans un premier temps chez la souris Balb/c. Deux injections de 10 μg de protéine en présence d’hydroxyde d’aluminium permettent l’induction d’une forte réponse immunitaire humorale. Des titres élevés en anticorps neutralisants (> 2 560) comparables à ceux induits par l’immunisation avec des virions purifiés et inactivés du SRAS-CoV ont été observés. Après inoculation d’épreuve par voie intra-nasale avec le SRAS-CoV, une réduction drastique de la charge virale pulmonaire a été observée chez les souris immunisées par rapport aux témoins.
Pour confirmer l’efficacité protectrice de ce candidat vaccin, l’immunisation de hamsters syriens dorés, qui constituent un meilleur modèle animal pour l’infection par le SRAS-CoV que la souris, a également permis de mettre en évidence l’induction d’une forte réponse en anticorps neutralisants. Cette réponse est également protectrice vis-à-vis d’une inoculation d’épreuve par le SRAS-CoV comme attesté par l’absence de virus détectable dans le tractus respiratoire supérieur, les poumons et le foie des animaux immunisés ainsi que par l’absence de lésions histopathologiques au niveau du tractus respiratoire.
En conclusion, nos résultats montrent que la protéine recombinante Ssol constitue une alternative séduisante au virus inactivé comme candidat vaccin contre l’infection par le SRAS-CoV.

O48
Étude de nouvelles combinaisons immunothérapeutiques à base du vaccin à ADN nu pour le traitement des hépatites B chroniques

Saade F¹, Buronfosse T¹, Ramamurthy N¹, Schultz U², Trepo C¹, Zoulim F¹, Cova L¹

¹Laboratoire des virus des hépatites et pathologies associées, Inserm Unité 271, Lyon ; ²University Hospital, Freiburg, Allemagne
<saade@lyon.inserm.fr>

Compte tenu de l’efficacité limitée des traitements actuels des hépatites B chroniques et de l’émergence de variants résistants, il est urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques antivirales. Dans ce contexte, l’immunisation par ADN nu est une approche particulièrement intéressante puisqu’elle permet à la fois la stimulation de la réponse humorale et de la réponse cellulaire, spécialement les réponses immunitaires de type Th1. Ces réponses Th1, requises pour la clairance virale, sont généralement déficientes chez les patients infectés chroniquement par le virus de l’hépatite B (VHB). Il a été démontré dans certains modèles animaux, comme la souris transgénique pour la VHB, que cette clairance est dépendante de la production d’interféron gamma (IFNγ) dans les cellules T activées.
Le modèle de canard chroniquement infecté par le VHB du canard (DHBV) est un modèle de référence pour l’essai de nouvelles stratégies thérapeutiques des hépatites B chroniques. Par contre, rien n’est connu sur le rôle que joue l’IFNγ dans la résolution de l’infection par le DHBV. Nous avons dans un premier temps exploré la dynamique de l’expression de l’IFNγ, quantifié par PCR en temps réel, dans le foie et les PBMC des canards transitoirement infectés par le DHBV, en relation avec des marqueurs sériques et hépatiques de la réplication virale et l’induction de la réponse humorale.
Nous avons montré qu’une forte baisse dans les niveaux d’ADN et de l’expression virale durant la résolution de l’infection aiguë chez ces animaux est non seulement associée à une induction de la réponse humorale anti-préS, généralement responsable de la protection, mais aussi avec l’augmentation des ARN codant pour l’IFNγ dans le foie et les PBMC. L’augmentation de l’expression de l’IFNγ, concomitante avec la clairance virale, suggère le rôle clé de cette cytokine dans le contrôle de l’infection par le DHBV.
Nous avons dans un second temps comparé, chez des canards naïfs, l’effet de la co-immunisation par ADN nu d’un plasmide codant pour la grande protéine d’enveloppe du DHBV (pCI-préS/S) en association avec un plasmide codant pour l’IFNγ du canard (pCI-INFγ) ou pour l’interleukine 2 du canard (pCI-IL2), avec l’immunisation par pCI-préS/S seul. Les résultats d’Elisa montrent une augmentation des taux des anticorps anti-préS quand le plasmide pCI-préS/S est associé aux plasmides exprimant l’IFNγ ou l’IL2, suggérant qu’une telle co-immunisation avec ces cytokines stimule la réponse humorale.
Ensuite, nous nous sommes intéressés à l’efficacité thérapeutique des combinaisons plasmidiques codant pour la grande protéine d’enveloppe (pCI-préS/S) et pour la capside du DHBV (pCI-C) avec les plasmides codant pour l’IFNγ et pour l’IL2, chez des canards chroniquement infectés par le DHBV, avec comme contrôle la combinaison pCI-préS/S + pCI-C. Les résultats montrent une baisse de la virémie accompagnée par une induction de la réponse humorale anti-préS chez les groupes co-immunisés avec les plasmides codant pour les protéines structurales virales et les cytokines (IFNγ, IL2). Chez le groupe traité avec pCI-préS/S + pCI-C + pCI-INFγ, la réponse anti-préS était puissante et environ 20-40 fois supérieure aux réponses anti-preS induites chez les autres groupes traités. De plus, une inhibition marquée de la réplication virale hépatique, voire une clairance totale de l’ADN viral a été observée chez 60 % des animaux traités par l’association préS/S + pCI-C + pCI-INFγ qui ont éliminé également l’ADNccc, responsable de la persistance virale et la chronicité. Chez le groupe de canards traités par l’association pCI-préS/S + pCI-C + pCI-IL2, seuls 25 % des animaux ont éliminé le DHBV. Par contre, nous n’avons obtenu aucun cas de clairance virale chez le groupe traité par l’association pCI-preS/S + pCI-C.
L’ensemble de ces résultats est prometteur et suggère que l’efficacité antivirale du vaccin à ADN nu codant pour les protéines structurales virales du DHBV pourrait être stimulée par une coadministration de plasmides codant pour des cytokines comme l’IFNγ. Ces résultats pourraient être intéressants pour une application thérapeutique chez les patients chroniquement infectés par le VHB.

O49
Facteurs viraux et immunitaires impliqués dans la récurrence de l’infection par le virus de l’hépatite C après greffe du foie pour cirrhose C

Schvoerer E¹, Thumann C¹, Soulier E¹, Royer C¹, Bastien-Valle M¹, Gendrault JL¹, Brignon N¹, Meyer N², Ellero B³, Woehl-Jaegle ML³, Meyer C³, Jaeck D³, Wolf P³, Stoll-Keller F¹

¹Institut de virologie, ²Département d’information médicale, ³Service de transplantation de l’Hôpital Hautepierre, CHU, 67000 Strasbourg
<evelyne.schvoerer@viro-ulp.u-strasbg.fr>

La cirrhose due à une infection chronique par le virus de l’hépatite C (VHC) accompagnée ou non d’hépatocarcinome est devenue la première indication de greffe hépatique. Malheureusement, la récurrence virologique du VHC est systématique, bien que d’évolution variable. Les facteurs viro-immunologiques impliqués dans la survenue et la sévérité de cette récurrence ne sont pas bien connus.
Notre travail porte sur 18 patients transplantés du foie pour cirrhose C et 10 témoins greffés du foie pour cirrhose non virale, qui sont étudiés au temps prégreffe et à différentes dates après la transplantation : J7, M1, M3, M6, M9 et M12. Les facteurs viraux sont analysés par mesure de la charge virale plasmatique, détermination du génotype viral, et analyse de la complexité et de la diversité des quasi-espèces du VHC étudiées dans la région hypervariable HVR1 du gène d’enveloppe E2 par séquençage après clonage. Par ailleurs, les facteurs immunitaires sont abordés par l’énumération en cytométrie de flux des cellules dendritiques (CD) sanguines circulantes plasmacytoïdes et myéloïdes, des lymphocytes T CD4 +, CD8 +, des lymphocytes B, des monocytes et des cellules NK, par la mise en évidence des cellules dendritiques et des lymphocytes par immunohistochimie au niveau du tissu hépatique, et par la quantification de cytokines plasmatiques.
Nos principaux résultats montrent une tendance à l’homogénéisation des quasi-espèces du VHC à J7 après la greffe, c’est-à-dire une diminution de la complexité et de la diversité virales par rapport à PG, quels que soient le génotype viral ou le niveau des virémies. Sur le plan immunologique, les principales données montrent une diminution dans le sang du nombre de CD plasmacytoïdes et myéloïdes, des lymphocytes et des cellules NK à J7 par rapport au temps prégreffe, accompagnée d’une baisse du niveau de l’IL12 plasmatique.
Nous présenterons l’ensemble des résultats obtenus ainsi que l’hypothèse de l’émergence d’un variant viral avantagé sur le plan structural et\ou fonctionnel très précocement après la transplantation hépatique, à la faveur de l’immunosuppression thérapeutique instituée pour favoriser la tolérance du greffon.

O50
Rôle central du TNFα et de l’IL1α dans la rupture de la barrière hématoencéphalitique associée au rétrovirus HTLV1

Afonso P¹, Ozden S¹, Prevost MC², Schmitt C², Wecksler BB³, Couraud PO4, Gessain A1, Romero I1,5, Ceccaldi PE1

¹Unité EPVO et ²Plateforme de microscopie électronique, Institut Pasteur, Paris ; ³Weill Medical College, Cornell University, New York, USA ; ⁴Institut Cochin, Paris, France ; ⁵Department of Biological Sciences, The Open University, Milton Keynes, Royaume Uni
<pafonso@pasteur.fr>

Le virus humain de la leucémie/lymphome à cellules T de type 1 (HTLV1) est le facteur étiologique d’une neuromyélopathie chronique, la paraparésie spastique tropicale/myélopathie associée à HTLV1 (TSP/HAM). Dans cette maladie neurologique progressive, des infiltrats lymphocytaires T et la diffusion de facteurs sériques sont observés dans le parenchyme de la moelle épinière thoracique. Ces observations s’expliquent par un dysfonctionnement de la barrière hématoencéphalique (BHE), structure anatomopathologique régulant l’homéostasie du fluide extracellulaire du parenchyme cérébrospinal.
Afin d’étudier les mécanismes de rupture de la BHE, un système in vitro a été mis au point. Une monocouche de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines a été cultivée en présence de lymphocytes infectés ou non par HTLV1. Les lymphocytes infectés induisent une augmentation importante de la perméabilité de la barrière à un marqueur fluorescent (FITC-dextran 70 kDa) dès 6 h de coculture, associée à une perte d’adhésion entre les cellules, une rupture des jonctions serrées intercellulaires et une baisse d’expression de la protéine Zonula occludens 1 (ZO1), composant majeur des jonctions serrées. L’expression du transactivateur viral Tax1 dans les lymphocytes est suffisante pour induire l’altération de la BHE ; celle-ci entraîne une augmentation de la sécrétion des cytokines IL1α et TNFα. L’introduction de ces cytokines dans le milieu de culture mime la rupture de la barrière par les lymphocytes infectés par HTLV1. De plus l’inhibition du TNFα et/ou de l’IL1α permet de préserver l’intégrité de la barrière.
Ces études permettent une meilleure compréhension de la pathogenèse virale associée au dysfonctionnement précoce de la BHE.

P51
Analyse du génome de la souche vaccinale antivariolique française (virus de la vaccine souche Lister) et comparaison avec les Orthopoxvirus

Garcel A, Crance JM, Garin D, Favier AL

Laboratoire de virologie, Centre de recherches du Service de santé des armées (CRSSA) Emile-Pardé, Grenoble <garcelaude@yahoo.com>

La variole est une maladie humaine mortelle causée par un virus appartenant au genre Orthopoxvirus, comprenant également le virus de la vaccine. Ces grands virus à ADN double brin contiennent environ 200 séquences codantes (ORF) dont la moitié ont des fonctions encore inconnues. Le virus de la vaccine présente une immunogénicité croisée avec le virus de la variole mais est responsable d’une pathogénicité très nettement atténuée, ce qui a justifié son utilisation massive lors de la campagne de vaccination à l’origine de l’éradication mondiale de la variole en 1980. Avec la recrudescence du risque bioterroriste faisant craindre l’utilisation du virus de la variole, le virus de la vaccine suscite un nouvel intérêt dans le cadre d’une réutilisation pour une nouvelle vaccination de la population française. Malgré sa faible pathogénicité, le virus de la vaccine engendre diverses complications post-vaccinales pouvant conduire jusqu’au décès du sujet vacciné, dont la fréquence est variable selon la virale utilisée. L’étude des génomes et des protéomes de ces souches pourrait éclairer les protéines virales et les mécanismes moléculaires mis en jeu lors de ces complications. Plusieurs souches de vaccine ont déjà été séquencées [Goebel et al., Virology 1990 Genebank NC001559 ; Esposito et al., 1982 Genebank NC006998 ; Antoine et al., Virology 1998- Genebank U94848] mais jusqu’à peu, aucun séquençage de la souche Lister (VACV-Lis), souche vaccinale française, n’avait été réalisé. En 2005, une souche Lister japonaise (VACV-LO) a été publiée [Morikawa et al., J Virol 2005 Genebank AY678276] montrant l’intérêt à séquencer la souche française. De plus, l’origine du virus de la vaccine reste inconnue puisqu’il a spontanément remplacé le cowpoxvirus utilisé à l’origine de la campagne de vaccination. La comparaison génomique des différentes souches de vaccine entre elles, ainsi qu’aux autres virus du genre Orthopoxvirus, permet de situer ce virus et cette souche en particulier, par rapport aux autres, et de confirmer l’appartenance du rabbitpoxvirus [Li et al., J Gen Virol 2005 Genebank AY484669] aux virus de la vaccine.
Afin de séquencer le génome du virus de la vaccine souche Lister, le vaccin français antivariolique de première génération a été cloné. Un clone représentatif a été sélectionné selon ses caractéristiques phénotypiques en culture cellulaire et sa virulence in vivo. Après séquençage de l’ADN viral selon la méthode de Sanger, les ORF ont été déterminés à l’aide de l’outil GeneAnnotÒ utilisant un programme Prokov. Une comparaison de séquences par BLASTX avec plusieurs bases de données a permis la confirmation ou l’infirmation de ces ORF. L’annotation fonctionnelle a ensuite été réalisée par comparaison BLASTP. Des dotplots ont été obtenus par comparaison de séquences entre les différentes souches de vaccine et ont permis de comparer leurs structures génomiques. De plus, une analyse phylogénique sur 22 orthopoxvirus a été réalisée à partir de 17 gènes sélectionnés pour leur stabilité [Gubser et al., J Gen Virol 2004].
Ainsi, le génome VACV-Lis contient 285 ORF codant pour de nombreuses protéines appartenant aux différentes familles classiquement décrites que sont les protéines de la réplication, de la transcription, les protéines structurales, les enzymes virales et les protéines immunomodulatrices. VACV-Lis est très similaire aux autres orthopoxvirus par sa structure génomique et ses protéines sont homologues à celles des autres virus de la vaccine. Les comparaisons de séquence ont démontré que VACV-Lis et VACV-LO sont identiques et qu’il s’agit bien de la même souche Lister. De plus, à l’inverse des autres souches de vaccine, la souche Lister code pour trois protéines du cowpoxvirus. L’analyse phylogénique a démontré le regroupement des virus de la vaccine au sein des orthopoxvirus et la forte similarité existante entre la souche Lister et le rabbitpoxvirus, prouvant son appartenance à cette classe de virus. Même si aucune hypothèse de l’origine de ce virus n’a pu être validée, la forte stabilité génique au sein de ces virus a été vérifiée.

P52
Facteurs immunitaires déterminants dans la protection naturelle de la souris BALB/c contre le cowpoxvirus

Ferreir Rembert A¹, Virgone B¹, Tournier JN¹, Drillien R², Garin D¹, Crance JM¹

¹CRSSA Emile Pardé, Grenoble ; ²Equipe Propre Inserm 99-08, EFS-Alsace
<audreyferrier@yahoo.fr>

En 1980, l’OMS a déclaré la variole éradiquée, entraînant l’abandon progressif de la vaccination et de la majorité des travaux de recherche s’y consacrant. Les risques d’utilisation de la variole en tant qu’arme biologique face à une population aujourd’hui naïve rendent nécessaires la mise à disposition de traitements prophylactiques et thérapeutiques efficaces. Pour réaliser les études précliniques de ces nouveaux traitements, il est nécessaire de disposer d’un modèle animal d’infection par un orthopoxvirus. Le cowpoxvirus (CPXV), inoculé par voie intranasale à des souris BALB/c, a été utilisé comme modèle d’infection de la variole afin de tester différents traitements ; il a aussi permis la mise en évidence des facteurs immunitaires déterminants dans la protection naturelle contre les orthopoxvirus.
La pathogénicité, la dissémination du virus et les réponses immunitaires spécifiques induites après infection respiratoire létale ou non létale ont été étudiées. Les souris infectées avec la dose non létale présentent un pic symptomatique au douzième jour puis une rémission progressive jusqu’à la disparition des symptômes au 15^e jour et une clairance virale complète au 30^e jour. Il est montré que les réponses cellulaires T sont détectées dès le 6^e jour de façon importante et sont maximales entre le 12^e et le 18^e jour alors que la réponse humorale évaluée par le titrage des anticorps neutralisants n’est détectée qu’à partir du 12^e jour. Elle reste faible jusqu’au 18^e jour. Ce modèle d’infection non létal a permis d’appréhender les réponses immunitaires impliquées dans la protection naturelle contre les orthopoxvirus.
Des souris BALB/c immunodéficientes ou immunodéplétées ont été infectées avec la dose non létale (sur souris immunocompétentes) de cowpoxvirus. La survie, la perte de poids et les réponses lymphocytaires T (détection des lymphocytes T CD4+ et CD8+ sécrétant spécifiquement de l’interféron gamma par cytométrie de flux) et anticorps neutralisants (séroneutralisation du virus infectieux en culture cellulaire) CPXV-spécifiques, induites après infection, ont été étudiées. Dans la protection naturelle, la réponse immunitaire B n’est pas nécessaire puisque toutes les souris B déficientes survivent à l’infection au prix d’une morbidité importante. Le pic symptomatique est observé au 9^e jour (20 % de perte de poids). Par contre, 100 % des souris déficientes en lymphocytes T meurent entre le 11^e et le 13^e jour, démontrant la nécessité des réponses immunitaires T. Afin d’évaluer précisément le ou les facteurs immunitaires T impliqués, des souris BALB/c ont été déplétées en lymphocytes T CD4+ ou CD8+ par injection d’anticorps spécifiques. Les souris CD8 déplétées présentent une morbidité importante avec une perte de poids de 21 % jusqu’au 21^e jour et 33 % de mortalité est observée au 26^e jour. La réponse T CD8+ est importante mais pas indispensable. Cent pour cent des souris CD4 déplétées meurent entre le 19e et le 28e sans produire d’anticorps neutralisants et avec une réponse T CD8 + vingt fois inférieure à la réponse T CD8+ évaluée chez des souris immunocompétentes.
En conclusion, lors d’une infection naturelle, c’est la réponse CD8 + /CD4 dépendante qui protège les animaux, les anticorps apparaissant trop tardivement. Ceci n’est pas observé après vaccination, où l’apparition précoce des anticorps permet la protection des animaux.

P53
L’expression de la glycoprotéine de spicule du coronavirus associé au SRAS requiert des éléments d’export hétérologues : application à l’immunisation génique

Callendret B¹, Lorin V¹, Marianneau P², Contamin H², Charneau P³, Van Der Werf S¹, Escriou N¹

¹Unité de génétique moléculaire des virus respiratoires, CNRS URA 1966, ³G5 de virologie moléculaire et de vectorologie, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur-Roux, 75015 Paris ; ²Unité de biologie des infections virales émergentes, Institut Pasteur, 21 avenue Tony-Garnier, 69007 Lyon
<benoitcl@pasteur.fr>

À la fin de l’année 2002, une pneumonie atypique sévère et contagieuse, dénommée SRAS (syndrome respiratoire aigu sévère) a émergé en Chine. L’agent responsable de cette maladie a été rapidement caractérisé et identifié comme étant un nouveau coronavirus d’origine inconnue. Ce virus se dissémina dans 29 pays différents et aura causé entre novembre 2002 et juillet 2003 774 décès sur 8 096 patients malades. Bien que l’épidémie de SRAS ait pu être maîtrisée et le risque pandémique écarté, les mécanismes d’introduction du SRAS-CoV restent largement inconnus. Dans la perspective d’une réémergence possible de la maladie un vaccin efficace constituerait le moyen le plus sûr de circonscrire une nouvelle épidémie.
Le coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV) est un virus enveloppé comprenant un génome à ARN positif monocaténaire non segmenté dont la réplication a entièrement lieu dans le cytoplasme. Parmi les protéines qui composent l’enveloppe du virion, la protéine de spicule (S), glycoprotéine de 180 kDa, assure la reconnaissance du récepteur d’entrée puis la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane plasmique de la cellule hôte. Comme cela a été démontré par des études d’immunisations passives et actives chez l’animal, la glycoprotéine S est aussi la cible d’une réponse humorale en anticorps neutralisants, qui représente le principal effecteur de la réponse protectrice de l’hôte. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’optimisation d’un candidat vaccin reposant sur une approche d’immunisation génique par les séquences de la protéine S.
Nous avons tout d’abord démontré que l’expression des séquences de la protéine S en cellules de mammifères in vitro nécessitait des vecteurs d’expression appropriés, munis de sites donneurs et accepteurs d’épissage ainsi que d’éléments de régulation post-transcriptionnelle comme WPRE (woodchuck posttranscriptionnal regulatory element) ou CTE (constitutive transport element). WPRE et CTE sont des éléments de régulation appartenant respectivement au virus de l’hépatite de la marmotte et au rétrovirus simien de Mason-Pfizer ; bien que leur mode d’action exact reste débattu, ils permettent dans le cadre du cycle viral l’export nucléaire des ARNm peu ou non épissés et ont été utilisés pour accroître l’expression de transgènes lors d’expériences de thérapie génique. Nos résultats suggèrent que l’intensité de l’effet de CTE et WPRE dépend du type cellulaire, et que WPRE est plus efficace que CTE. Ainsi muni des signaux adéquats, un vecteur plasmidique permet l’expression transitoire de la glycoprotéine S à des niveaux élevés dans des cellules de mammifères 293T et VeroE6. Les différentes propriétés fonctionnelles (interaction avec le récepteur, fusion) et antigéniques (reconnaissance par un panel de sérums de patients) de la protéine S exprimée dans ces conditions peuvent être mises en évidence.
Des souris BALB/c ont été immunisées par injection intramusculaire sous forme d’ADN nu des vecteurs plasmidiques dirigeant l’expression de la protéine S et munis ou non des éléments de régulation CTE ou WPRE. Les expériences dose-réponse réalisées ont démontré que l’élément WPRE était indispensable pour l’induction efficace d’une réponse protectrice en anticorps neutralisants : aux faibles doses d’immunogène (2 μg d’ADN nu par animal), après une épreuve par voie intranasale par le SRAS-CoV, la réplication virale devient indétectable uniquement chez les souris immunisées par le plasmide muni des séquences WPRE.
En conclusion, nos études démontrent que l’association de sites donneurs et accepteurs d’épissage et de l’élément de régulation post-transcriptionnel WPRE permet d’augmenter tant l’expression in vitro de la protéine S du SRAS-CoV que l’immunogénicité d’un candidat vaccin génique contre le SRAS. Elles suggèrent que l’incorporation de tels éléments pourrait d’une façon générale contribuer à améliorer l’efficacité des vaccins géniques et, en diminuant les doses d’ADN nécessaires, à limiter les inconvénients liés aux risques d’intégration et de persistance des séquences injectées.

P54
Le virus myxomateux vecteur vaccinal : application à la vaccination contre la bluetongue

Pignolet B¹, Albina E², Zientara S³, Gelfi J¹, Bertagnoli S¹

¹UMR 1225 Interactions hôtes agents pathogènes, INRA/ENVT, École nationale vétérinaire, 23 chemin des Capelles, BP87614, 31076 Toulouse Cedex 03 ; ²Cirad-EMVT, Campus international de Baillarguet, TA30/G, 34398 Montpellier Cedex 5 ; ³Afssa, Unité de virologie, 22 rue P. Curie, BP63, 94703 Maisons-Alfort Cedex
<b.pignolet@envt.fr>

La fièvre catarrhale du mouton (ou bluetongue) est une arbovirose des petits ruminants. Cette maladie est principalement présente dans les pays d’Afrique du Nord, mais aussi d’Amérique du Sud, centrale et les États-Unis. En 2000, la maladie a fait son apparition en Corse et, depuis, chaque année on peut y observer de nombreux foyers d’infection. Le virus de la bluetongue (BTV) est constitué de 24 sérotypes différents chacun induisant chez l’animal infecté une protection très partielle contre les autres. Cela pose le problème du contrôle de la maladie. En effet, le seul vaccin existant à ce jour est constitué de souches virales atténuées qui protègent contre un ou plusieurs sérotypes donnés selon sa composition. Notre objectif est donc de tenter de produire un vaccin capable de protéger les animaux contre tous les sérotypes du BTV à la fois. Pour y parvenir, nous nous appuyons sur les virus poxviraux et tout particulièrement le virus myxomateux (VM). Ces poxvirus ont déjà fait leur preuve en tant que vecteur de vaccination pour différentes espèces. En effet, ils sont capables d’induire une bonne réponse humorale mais aussi une forte immunité de type cellulaire contre le produit du transgène d’intérêt, transgène inséré au sein même de leur génome. En orientant ce type de réponse immunitaire contre des antigènes conservés, tels que les protéines non structurales (NS) du BTV, nous pourrions théoriquement induire une protection croisée entre différents sérotypes.
Nous avons donc construit plusieurs virus recombinants : virus myxomateux de souche SG33 (souche vaccinale) exprimant des transgènes d’intérêt du BTV et plus particulièrement des gènes codant pour des protéines très peu variables entre sérotypes, les protéines NS1, 2 et 3 et la protéine VP7. Le site d’insertion choisi est la zone contenant les gènes codant pour la protéine MGF (myxoma growth factor) et M11L. Ces gènes sont non essentiels à la réplication virale et leur délétion provoque une atténuation de la pathogénicité du virus sauvage. L’expression des transgènes d’intérêt a été testée dans un contexte réplicatif, c’est-à-dire sur cellules de lapins RK13, mais aussi en contexte non réplicatif, c’est-à-dire sur cultures cellulaires de bovins et d’ovins. Les détections ont été réalisées par immunofluorescence ou par RT-PCR. Les résultats obtenus montrent que nous avons une bonne production de la protéine VP7 et la présence des ARNm NS1, NS3 et NS2. L’infection de différentes lignées cellulaires de ruminants révèle la capacité du VM à infecter de façon non productive ces cellules et à exprimer les transgènes d’intérêt. L’immunogénicité de nos différents virus recombinés a été testée in vivo sur lapins. Puis une expérimentation sur chèvre a été réalisée afin de suivre la réponse immune spécifique dirigée contre chacun des antigènes d’intérêt.
Ceci nous permettra de valider notre système de vaccination chez les ruminants avant un essai de vaccination/protection face à une épreuve virulente.

P55
Protection envers l’infection génitale par l’herpèsvirus caprin 1 de chèvres immunisées par voie intranasale avec une souche atténuée de l’herpèsvirus bovin 1 délété de la glycoprotéine E

Thiry J^1,2, Tempesta M¹, Camero M¹, Tarsitano E¹, Muylkens B², Thiry E², Buonavoglia C¹

¹Département de santé et bien-être animal, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Bari, 70010 Valenzano, Italie ; ²Laboratoire de virologie, Département des maladies infectieuses et parasitaires, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Liège, 4000 Liège, Belgique.
<julien.thiry@ulg.ac.be>

L’herpèsvirus caprin 1 (CpHV1), responsable de maladies sévères chez la chèvre, est antigéniquement et génétiquement apparenté à l’herpèsvirus bovin 1 (BoHV1). Sur la base de ces propriétés communes, un vaccin vivant atténué à base d’un BoHV1 délété de la glycoprotéine E (gE-) a été évalué chez la chèvre par une immunisation par voie intranasale effectuée deux fois à 3 semaines d’intervalle. Trois semaines après la dernière immunisation, une épreuve virulente avec un CpHV1 a été réalisée par voie intravaginale qui est la voie d’infection naturelle chez la chèvre. Afin d’analyser la sécurité et l’efficacité de ce vaccin marqué, deux groupes de chèvres ont été utilisés comme témoins : un groupe a été immunisé avec un CpHV1 et un groupe n’a pas été inoculé jusqu’à l’épreuve virulente. Le vaccin n’a pas induit de signes cliniques, locaux ou généralisés, indésirables et les chèvres n’ont pas excrété de BoHV1 gE-. Après l’épreuve virulente, une réduction significative de la sévérité de la maladie a été observée chez les chèvres immunisées. Les chèvres immunisées avec le BoHV1 ont montré une réduction notable dans la durée et le pic d’excrétion virale. L’analyse des anticorps neutralisants a montré aussi bien la présence d’anticorps anti-BoHV1 que d’anticorps anti-CpHV1. De manière surprenante, malgré la présence d’une excrétion virale après l’épreuve virulente, les chèvres immunisées ont montré une protection clinique génitale. Ces données soulignent l’intérêt d’étudier l’approche d’une vaccination intranasale contre les infections transmises par voie génitale.

P56
Évaluation par épreuve homologue de la protection apportée chez le canard par un baculovirus triple recombinant coexprimant les protéines H5, N3 et M d’Influenzavirus aviaire H5N3 faiblement pathogène

Prel A¹, Le Gall-Recule G¹, Cherbonnel M¹, Grasland B², Amelot M³, Jestin V¹

Afssa, Agence française de sécurité sanitaire des aliments, Laboratoire d’études et de recherches avicoles et porcines, ¹Unité de virologie immunologie parasitologie aviaires et cunicoles ; ²Unité de génétique virale et biosécurité ; ³Service d’élevage et d’expérimentation en pathologie avicole.
<a.prel@afssa.fr>

Les canards domestiques peuvent jouer un rôle essentiel dans la transmission des influenza virus aviaires de sous-types H5 que ceux-ci soient faiblement (LP) ou hautement pathogènes (HP), mais seulement quelques vaccins commerciaux ont été évalués chez ces espèces. Ces vaccins ont une efficacité variable concernant la réduction de l’excrétion chez des canards infectés par la souche H5N1 HP circulant actuellement en Asie, les données relatives à la durée de l’immunité restent à acquérir et la stratégie que ces vaccins imposent pour différencier les oiseaux vaccinés par rapport aux oiseaux infectés, est critiquable. De plus, aucune donnée n’a été rapportée concernant la protection apportée chez des canards infectés par des virus d’influenza aviaire H5 LP, mais nous avons montré que deux vaccins commerciaux ne réduisaient pas l’excrétion virale chez des canards mulards éprouvés expérimentalement avec un virus influenza aviaire LP de sous-type H5N3. Par ailleurs, il n’existe pas de vaccin recombinant pour ces espèces mais ce type de vaccin requiert des études approfondies pour garantir son innocuité et sa stabilité génétique ; de plus certains vaccins recombinants ne sont utilisables qu’en primovaccination du fait de l’immunité forte dirigée contre le vecteur. Une autre voie possible pour la vaccination est l’utilisation de protéines virales immunogènes. La stratégie utilisant les propriétés immunogènes des différentes protéines de l’enveloppe du virus semble accessible depuis que des auteurs ont démontré la possibilité de produire des pseudo-particules virales (VLP) à l’aide d’un baculovirus quadruple recombinant codant les glycoprotéines d’enveloppe HA et NA, et les protéines de matrice M1 et M2 d’un virus Influenza humain H3N2. Plus récemment, la faisabilité du procédé a été confirmée par l’obtention d’un baculovirus triple recombinant codant les protéines HA, NA et M1 d’un virus Influenza humain H9N2 et seule la protection conférée par ces VLP a été étudiée chez la souris. Si leur immunogénicité était démontrée chez le canard, les VLP pourraient remédier aux défauts précités. C’est pourquoi ce concept a été appliqué en vue de tenter de développer un vaccin VLP H5N3 composé de trois protéines structurales H5, N3 et M dérivées d’une souche LP française récente, isolée de canard.
Le système d’expression Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Invitrogen) a été utilisé pour générer un baculovirus triple recombinant en partant d’un vecteur pFastBac Dual qui possède deux promoteurs distincts PP10 et PPH et auquel a été ajouté un second promoteur PPH. Les trois gènes ont été sous-clonés dans un plasmide pFastBac Dual et l’obtention d’un plasmide triple recombinant pMHANA a été vérifiée par PCR et séquençage. Un bacmide recombinant a été généré après transformation de bactéries compétentes DH10Bac (Invitrogen) et a été utilisé pour transfecter des cellules d’insectes Sf9. L’expression des protéines HA et M1 au niveau des cellules et dans les différentes fractions de surnageant purifiées sur gradient de saccharose a été vérifiée par western-blot, tandis que l’expression de la neuraminidase était vérifiée par un test d’inhibition de la neuraminidase. La présence de VLP a été aussi recherchée par microscopie électronique. Pour évaluer la protection conférée à des canards de Barbarie EOPS par différentes préparations vaccinales adjuvées (cellules infectées par du baculovirus triple recombinant et fractions de surnageant d’intérêt purifiées) administrées à 3 semaines d’intervalle, une épreuve homologue a été effectuée 10 jours après le rappel. Parallèlement, à titre de comparaison, un troisième groupe a reçu un vaccin commercial inactivé H5N9 (différent de ceux précédemment testés dans le laboratoire), puis a été éprouvé de la même façon. L’immunité ainsi conférée est en cours d’évaluation par mesure de la réponse immunitaire spécifique (par les tests d’inhibition de l’hémagglutinine, d’inhibition de la neuraminidase et par western-blot) ainsi que par quantification par RT-PCR de l’excrétion trachéale et cloacale après infection. Les perspectives qu’offrent de telles préparations vaccinales sont discutées.

Chimiothérapie antivirale

Jeudi 20 avril 2006, 15 h 45 à 17 h

Communications orales O57 à O61
Communications affichées P62 à P68

O57
Comparaison de la sensibilité à l’oseltamivir de neuraminidases N1 de virus influenza A d’origine humaine ou aviaire

Rameix-Welti MA¹, Agou F², van der Werf S¹, Naffakh N¹

¹Unité de génétique moléculaire des virus respiratoires, URA CNRS 1966, Institut Pasteur, Paris ; ²Unité de régulation enzymatique des activités cellulaires, Institut Pasteur, Paris
<mawelti@pasteur.fr>

Les virus influenza A représentent un problème de santé publique majeur. La circulation de virus humains de sous-types H1N1 et H3N2 est responsable d’épidémies touchant chaque année 5 à 15 % de la population. Par ailleurs, la transmission et l’adaptation à l’homme d’un virus influenza A aviaire de sous-type nouveau se produit épisodiquement et peut donner lieu à des épidémies exceptionnelles par leur extension et leur gravité telles que les pandémies de 1918, 1957 et 1968. Depuis avril 2003, la multiplication des cas de transmission à l’homme de H5N1 hautement pathogènes circulants chez les volailles domestiques en Asie du Sud-Est constitue une menace pandémique. Dans la lutte contre la grippe, les antiviraux apparaissent aujourd’hui comme un complément indispensable à la vaccination, tant en situation épidémique qu’en situation pandémique.
Le zanamivir et l’oseltamivir (OC), actuellement commercialisés, inhibent sélectivement la neuraminidase virale (NA) et sont efficaces en traitement préventif et curatif des infections par les virus influenza A et B. Des mutations de la NA conférant une résistance à ces drogues apparaissent avec une fréquence de 2 à 10 % en cours de traitement, mais les capacités réplicatives des virus résistants sont limitées. Notre étude porte sur la comparaison des propriétés enzymatiques des NA issues d’un H1N1 humain récent (A/Paris/650/04 : PR650) et de deux H5N1 hautement pathogènes responsables de cas humains d’infection, l’un à Hong Kong en 1997 (A/HongKong/156/97 : HK156), l’autre au Cambodge en 2005 (A/Cambodia/2237/05 : KH2237). Nous cherchons en particulier à comparer l’effet de la mutation H274Y, seule mutation de résistance à l’OC décrite pour les N1, selon le contexte génétique de la N1.
Dans ce but, nous avons mis au point une méthode de dosage fluorimétrique de l’activité sialidase sur des cellules exprimant transitoirement la N1 de PR650, HK156 ou KH2237. Les paramètres enzymatiques des N1 sauvages ou portant la mutation H274Y ont été ainsi déterminés. Les N1 de PR650, de HK156 et de KH2237 présentent un Km de l’ordre de 20 μM vis-à-vis du substrat utilisé (acide 2’-O-(4méthylumbelliferyl)-N-acétyl neuraminique). En accord avec les données publiées, nous avons observé que l’OC se comporte vis-à-vis des N1 comme un inhibiteur à liaison lente, et mesuré des Ki de l’ordre de 0,5 nM. En présence de la mutation H274Y, nous avons observé une disparition du phénomène de liaison lente de l’OC, et mesuré une augmentation des Ki (200 à 500 fois plus élevés que ceux des N1 sauvages) et des Km (1,5 à 2 fois plus élevés) pour les N1 de PR650 et de HK156. La mutation H274Y n’a pas d’effet sur la sensibilité des N1 au zanamivir.
Dans l’ensemble, nos résultats font apparaître des similitudes entre les N1 de PR650 et de HK156 quant à leur affinité pour le substrat et pour l’OC. Ils suggèrent qu’un virus H5N1 porteur de la mutation H274Y serait résistant à l’OC et pourrait posséder, comme les virus humains, des capacités réplicatives diminuées.

O58
Recherche de peptides à activité antivirale ciblant la ribonucléocapside des Mononegavirales

Castel G¹, Vichier-Guerre S², Jallet C¹, Eleouet JF³, Jestin JL², Tordon N¹

¹Unité postulante des stratégies antivirales, Institut Pasteur, Paris ; ²Unité de chimie organique, Institut Pasteur, Paris ; ³Unité VIM, INRA, Jouy-en-Josas

S’il a tendance à disparaître de nos régions, le virus de la rage reste une cause importante de décès dans le monde en développement. Par-delà les vaccins disponibles, sa longue durée d’incubation en fait un excellent modèle pour la recherche de molécules antivirales. Considérant son coût élevé, une telle approche n’est cependant réaliste que si elle cible une étape partagée par d’autres virus dans l’espoir de molécules au spectre d’action étendu. Le complexe de réplication spécifique et commun chez les Mononegavirales (Rhabdoviridae, Paramyxoviridae et Filoviridae) dans lequel la polymérase (protéines L/P) lit une matrice encapsidée (ARN-nucléoprotéine N) offre ce potentiel de cible spécifique. L’un des objectifs du laboratoire est de développer des approches de mises au point de peptides inhibiteurs de l’infection virale.
La première approche est basée sur la connaissance des interactions existant entre les différentes protéines du complexe de réplication/transcription. Nous montrons la mise au point de deux peptides inhibiteurs ciblant l’extrémité N terminale de la phosphoprotéine P rabique.
La seconde approche utilise une technique prometteuse dans la recherche antivirale : le phage display. Nous avons développé trois banques de peptides aléatoires de grande diversité (107-108 peptides différents, de 8 ou 12 acides aminés chacun). Ces banques de peptides sont présentées à la surface de phages filamenteux M13 et sélectionnées pour leur affinité pour le complexe RNP (ARN-N) de Mononegavirales (lyssavirus rage, paramyxovirus RSV) par la technique de panning. Les peptides affins sont séquencés afin de déterminer des motifs spécifiques. Leur affinité est consécutivement mesurée plus précisément en Elisa. À l’heure actuelle, deux banques ont été criblées. Après trois tours de sélection, nous montrons l’émergence de quelques séquences parmi les peptides retenus. Certaines sont communes à plusieurs RNP utilisées pour la sélection et possèdent une forte affinité pour celles-ci (Elisa). Cette observation est prometteuse dans la perspective d’obtenir des peptides inhibiteurs à large spectre. Leur éventuel pouvoir inhibiteur est actuellement testé sur un modèle de miniréplicon ou directement sur cellules infectées.

O59
Les inhibiteurs des alpha-glucosidases perturbent la morphogenèse, évitent la sécrétion et diminuent l’infectivité du virus de l’hépatite C dans différents systèmes d’étude

Chapel C¹, Garcia C¹, Bartosch B², Cosset FL², Zitzmann N³, Dubuisson J⁴, Dwek R³, Trepo C¹, Zoulim F¹, Durantel D¹

¹Inserm U271, Lyon ; ²Inserm U412, Lyon ; ³Glycobiology Institute, Oxford, UK ; ⁴Institut Pasteur de Lille, Lille
<chapel@lyon.inserm.fr>

Les stratégies antivirales basées uniquement sur l’utilisation d’inhibiteurs ciblant les enzymes virales du virus de l’hépatite C (VHC) pourraient être confrontées à des problèmes d’émergence de virus résistants comme cela a déjà été observé dans le cas du VIH et du VHB. Une approche alternative pourrait mettre en jeu l’utilisation de molécules ciblant d’autres étapes du cycle viral telle que la morphogenèse virale et la liaison aux cellules cibles. Dans un modèle viral proche du VHC, le virus de la diarrhée bovine virale (VDBV), des travaux sur les iminosucres ont apporté la preuve qu’une inhibition in cellulo de la morphogenèse était possible via une modification de la voie de N-glycosylation des glycoprotéines [Durantel et al., 2001]. L’importance de la glycosylation des protéines d’enveloppe du VHC d’une part et le rôle essentiel de la calnexine pour la formation des complexes de glycoprotéines d’enveloppe du VHC d’autre part laissent penser que les iminosucres pourraient inhiber la morphogenèse du VHC.
En 2005, un système permettant la réplication complète du VHC a été obtenu avec une souche particulière de VHC (souche JFH1, génotype 2a, isolé d’un patient souffrant d’une hépatite fulminante). En vue d’étudier l’effet des iminosucres sur le repliement et l’assemblage des glycoprotéines, mais aussi sur la sécrétion et l’infectivité du VHC, nous avons utilisé trois approches complémentaires. Premièrement, l’amélioration du système d’expression des protéines structurales du VHC basé sur l’utilisation de baculovirus recombinants a permis d’étudier l’effet des iminosucres sur la morphogenèse des glycoprotéines d’enveloppe gpE1 et gpE2. Deuxièmement, nous avons utilisé des pseudo-types VHC rétroviraux (VHCpp) portant des glycoprotéines gpE1 et gpE2 non modifiées [Bartosch et al. 2003] pour mesurer et démontrer l’effet des iminosucres sur l’entrée virale. Enfin, nous avons utilisé le système de réplication du VHC in vitro [Wakita et al., 2005] pour tester l’effet des iminosucres dans un système cellulaire permettant la sécrétion de particules virales.
En présence d’inhibiteur d’alpha-glucosidases, nous avons montré que gpE1 et gpE2 synthétisées et retenues dans le réticulum endoplasmique : 1) contiennent des N-glycanes triglycosylés, 2) n’interagissent pas correctement avec la calnexine et 3) sont au moins partiellement mal repliées. Nous avons également observé que les PPV produites en présence de iminosucres ont des propriétés d’attachement aux cellules modifiées.
Le second modèle d’étude nous a permis de montrer que : 1) la production et la sécrétion de VHCpp étaient diminuées, 2) les VHCpp contenaient des N-glycanes triglycosylés et des protéines mal repliées et 3) que l’entrée des VHCpp dans les cellules cibles étaient diminuée après traitement par les iminosucres inhibiteurs des alpha-glucosidases. Ce dernier résultat montre pour la première fois que les inhibiteurs des alpha-glucosidases empêchent non seulement la sécrétion virale, mais diminuent aussi le pouvoir infectieux des VHCpp. Enfin, le troisième modèle nous a permis de confirmer l’effet inhibiteur des iminosucres dans un système cellulaire de réplication du VHC et de sécrétion de particules virales.
Ces approches nous ont permis de démontrer : 1) l’inhibition de la morphogenèse du VHC et 2) la diminution de l’infectivité de particules synthétisées en présence d’iminosucres. Les iminosucres pourraient donc être des molécules intéressantes afin de complémenter l’arsenal antiviral conventionnel utilisé pour combattre les infections par le VHC.

O60
Défaut généralisé d’incorporation des nucléotides naturels induit par la mutation S282T de la polymérase du VHC et résistance mutuellement exclusive aux analogues de nucléosides modifiés en 2’

Dutartre H, Bussetta C, Boretto J, Canard B

AFMB : Architecture et fonction des macromolécules biologiques, Département réplication virale : structure, mécanismes, et drug-design, UMR6098, CNRS, Université de Provence, Université de la Méditerranée, Parc Scientifique et Technologique de Luminy, Case 925, 163 avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09
<Helene. Dutartre@afmb.univ-mrs.fr>

Avec plus de 170 millions de personnes infectées dans le monde, l’infection par le virus de l’hépatite C représente un problème majeur de santé publique. Les traitements actuels sont soit peu efficaces, soit mal tolérés, ce qui justifie les nombreux efforts pour la découverte de nouvelles molécules antivirales. Parce qu’elle est indispensable à la réplication virale, l’ARN polymérase ARN dépendante NS5B constitue une cible de choix, et on dénombre plusieurs inhibiteurs de la polymérase. Parmi ceux-ci, l’analogue de nucléotide 2’-C-méthyl cytidine 5’-triphosphate (2’-C-Me-CTP) est le métabolite actif de la molécule NM283 actuellement en phase II clinique. Le traitement prolongé de cellule exprimant le replicon du VHC avec cet analogue conduit à la sélection de réplicon résistant portant la mutation S282T dans le gène de la polymérase. Ni le mode d’action des analogues de nucléosides modifiés sur la position 2’ du sucre, ni les mécanismes de résistance ne sont caractérisés au niveau moléculaire, ce qui constitue le but de notre travail.
Nous avons précédemment montré que la synthèse de novo d’ARN par NS5B peut être séparée en deux étapes : l’initiation, qui conduit à la synthèse d’une amorce à partir de nucléotides libres, et l’élongation de cette amorce, jusqu’à la copie complète de la matrice. Dans ce travail nous avons analysé, par des techniques de cinétique enzymatique, les constantes biochimiques de l’incorporation, à l’initiation et à l’élongation, du 2’-C-Me-CTP et du 2’-O-Me-CTP, également inhibiteur in vitro de la polymérase, par les polymérases sauvages ou portant la mutation S282T.
Nous avons montré que le 2’-C-Me-CTP est incorporé par l’enzyme sauvage aussi bien que le nucléotide naturel, ce qui en fait une des premières qualités d’un bon inhibiteur. Au contraire, la mutation S282T inhibe totalement l’incorporation du 2’-C-Me-CTP à l’initiation et l’enzyme mutante l’incorpore 21 fois moins bien que le nucléotide naturel à l’élongation. C’est une gène stérique induite par le contact entre le méthyl de la thréonine substituée et le méthyl de l’analogue qui est responsable de cette discrimination. Paradoxalement, cette mutation ne modifie pas l’incorporation du 2’-O-méthyl-CTP à l’initiation mais inhibe totalement son incorporation à l’élongation. Cette résistance mutuellement exclusive montre que les confomères de la position 2’ du sucre ciblent des étapes distinctes de la synthèse de l’ARN, ce qui offre des possibilités de combinaison thérapeutiques. De plus, nous montrons que la mutation S282T diminue fortement l’efficacité d’incorporation des nucléotides naturels qui sont de 5 à 20 fois moins bien incorporés par rapport à leur incorporation par l’enzyme sauvage. Comme dans le cas du VIH, nos résultats pourraient fournir les bases mécanistiques pour la combinaison rationnelle de drogues pouvant sélectionner des virus résistants mais à faibles capacités réplicatives.

O61
Évaluation in vivo des propriétés mutagènes de la ribavirine sur le virus de l’hépatite C et de la réduction de la charge virale par l’interféron alpha

Chevaliez S, Brillet R, Hézode C, Pawlotsky JM

CNR des hépatites B, C et delta, Laboratoire de virologie et Inserm U635, Hôpital Henri-Mondor, Créteil.
<stephane.chevaliez@hmn.aphp.fr>

Le traitement de l’hépatite chronique C repose sur l’utilisation combinée d’interféron (IFN) α pégylé et de ribavirine (RBV). La réponse virologique au traitement, définie par l’absence d’ARN du VHC détectable dans le sérum 24 semaines après l’arrêt du traitement, est approximativement de 40 à 80 % suivant le génotype infectant. Des travaux récents [Nature 2004 ; 432 : 922-24] montrent que la décroissance de la charge virale au cours du traitement est biphasique : la première phase de décroissance, rapide, survient le premier jour ou au cours des deux premiers jours de traitement et reflète l’inhibition de la réplication virale liée aux propriétés antivirales de l’interféron ; la seconde phase de décroissance virale correspondant à une élimination lente des cellules infectées. Des travaux récents de notre laboratoire ont montré que la RBV agissait sur ces deux phases de décroissance virale. Les mécanismes d’action de la RBV sont encore débattus. Il a récemment été suggéré que la RBV exercerait son action antivirale en induisant un effet mutagène, forçant les virus à la « catastrophe d’erreurs », c’est-à-dire à la génération de quasi-espèces virales non viables. Cet effet mutagène de la RBV a été observé dans différents modèles. Il a également été suggéré que le potentiel mutagène de la RBV apparaîtrait seulement lorsque la réplication virale est fortement inhibée par l’IFN. Objectifs : 1) Déterminer si la RBV exerce un effet mutagène in vivo chez des patients infectés par un VHC de génotype 1b ; 2) Étudier si l’effet mutagène de la RBV est présent uniquement lorsque la réplication virale est fortement inhibée par l’IFN.
Onze patients avec une hépatite chronique C de génotype 1b ont été étudiés : 4 patients recevant le RBV en monothérapie et 7 patients recevant la combinaison IFNα plus RBV. Deux régions du génome viral ont été considérées : la région codant la protéase NS3 du VHC et la région codant la protéine NS5A. Ces deux régions ont été amplifiées par RT-PCR avant l’initiation du traitement (D14), à l’initiation du traitement (D0), 14 (D14) et 28 (D28) jours après l’initiation du traitement. L’analyse des quasi-espèces virales (soit 1360 clones) a été réalisée. Chez les quatre patients recevant de la RBV en monothérapie, le taux d’accumulation de mutation (nombre de substitutions nucléotidiques divisé par le nombre de nucléotides séquencés dans un intervalle de 14 jours), n’a pas augmenté au cours des 28 premiers jours de traitement par rapport à la période préthérapeutique (D14). Comme observé pour le groupe de patients sous RBV seule, le taux d’accumulation de mutation des sept patients sous IFN plus RBV était très faible (0 à 10,13.10^-4 mutations par site soit 0 à 14 mutations nucléotidiques), même lorsque la réplication virale était fortement inhibée par l’IFN.
La RBV ne semble pas exercer ses capacités antivirales grâce à son effet mutagène, car nous n’avons pas observé d’accumulation de mutations in vivo chez des patients traités en monothérapie ou en combinaison avec l’interféron alpha.

P62
Sélection d’aptamères peptidiques inhibant spécifiquement l’activité du complexe de réplication des orthopoxvirus

Iseni F¹, Saccucci L¹, Rothlisberge C¹, Colas P2, Bickle M², Crance JM¹, Garin D¹

¹Unité de virologie, CRSSA Émile-Pardé, 24 avenue des Maquis du Grésivaudan 38702, Grenoble ; ²Aptanomics SA, 181-203 avenue Jean Jaurès 69007 Lyon
<daniel.garin@wanadoo.fr>

La variole a longtemps constitué l’un des pires fléaux infectieux qu’ait connu l’humanité. Le succès de la campagne d’éradication du virus par l’OMS et l’abandon progressif par les pays industrialisés de la vaccination font craindre une possible utilisation de ce virus comme arme bioterroriste. Pour compléter la seule possibilité thérapeutique antivirale que représente le cidofovir, la recherche de nouveaux inhibiteurs actifs sur les virus du genre Orthopoxvirus (regroupant l’ensemble des virus pathogènes chez l’homme) est nécessaire.
L’objectif du projet est d’identifier de nouvelles molécules antivirales spécifiques du complexe de réplication des Orthopoxvirus. La protéine virale plus particulièrement ciblée au cours de notre étude est la protéine A20R, protéine centrale du complexe de réplication et qui interagit physiquement avec quatre autres protéines virales essentielles à l’activité du complexe : les protéines E9L, D5R, D4R et H5R. L’idée du projet est de sélectionner des peptides (également appelés aptamères) qui interagissent spécifiquement avec la protéine A20R et qui inhibent son interaction avec les autres protéines virales, dans l’espoir d’obtenir une activité antivirale.
Les aptamères sont des peptides contraints de 13 à 20 acides aminés qui sont exposés à la surface d’une protéine présentatrice (dans ce travail la protéine bactérienne thiorédoxine A). Ils sont sélectionnés à partir d’une banque combinatoire constituée de plus de 10 millions de peptides. La sélection d’aptamères interagissant avec une protéine cible est réalisée, en levure, grâce à la technique du double hybride.
La protéine A20R a été exprimée en levure et son interaction avec deux de ses partenaires (les protéines D4R et D5R) a été confirmée. Ces résultats nous indiquent que la protéine A20R est bien exprimée dans sa conformation native en levure. Une banque d’aptamères a ensuite été criblée contre la protéine A20R. Environ 30 peptides interagissant spécifiquement avec A20R ont pu être sélectionnés. L’analyse de l’interaction de ces peptides avec A20R ainsi que le pouvoir inhibiteur de ces nouvelles molécules en culture cellulaire est en cours.

P63
L’uracile N-glycosylase hUNG2 cellulaire, essentielle à la réplication du VIH1. Nouvelle approche thérapeutique par convergence des criblages cristallographique, enzymatique, et virtuel

Frangeul A, Debarnot C, Bussetta C, Gruez A, Alvarez K, Romette JL, Guillemot JC, Canard B

AFMB : Architecture et fonction des macromolécules biologiques, Département réplication virale : structure, mécanismes, et drug-design, UMR6098, CNRS, Université de Provence, Université de la Méditerranée, Parc Scientifique et Technologique de Luminy, Case 925, 163 avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09
<Antoine. Frangeul@afmb.univ-mrs.fr>

Depuis une dizaine d’années, les avancées dans la thérapie anti-VIH ont été dues au développement de médicaments ciblant la transcriptase inverse (RT) et la protéase du VIH. Cependant, ces inhibiteurs induisent rapidement la sélection de mutants de résistance. Devant ce problème, de nouvelles approches ont vu le jour, comme l’inhibition de la fusion VIH-cellule ou l’inhibition des récepteurs cellulaires utilisés par le VIH pour entrer dans la cellule. Notre intérêt s’est porté sur une protéine cellulaire et non plus virale, car il est certainement plus difficile pour un virus de s’adapter (résister) à l’oblitération de l’un de ses partenaires cellulaires que de s’adapter à un agent pharmacologique ciblant ses propres protéines. Il a été montré en 2005 que l’uracile N-glycosylase humaine (hUNG2) est requise et nécessaire dans la particule virale pour assurer un cycle viral normal. La protéine est utilisée par le virion pour initier la réparation de l’ADN viral néosynthétisé lorsque des uraciles ont été incorporés à la place de la thymine. Notre objectif est la caractérisation d’antiviraux ciblés sur cette enzyme cellulaire essentielle au VIH1. Notre approche repose sur trois méthodes complémentaires que nous faisons converger : le criblage enzymatique rationnel, le criblage réel et le criblage basé sur la structure 3D de la cible.
Au laboratoire, nous disposons d’une chimiothèque de 20 600 composés, dont les motifs chimiques (nucléobases, aromatiques divers…) sont focalisés et donc tout à fait pertinents pour l’inhibition d’enzyme interagissant avec les acides nucléiques. Cette chimiothèque est cours de criblage sur hUNG2 par notre plateforme de criblage d’inhibiteurs d’enzymes. La fiabilité de cette dernière a été validée cette année avec le criblage d’autres enzymes comme des polymérases virales. En parallèle au criblage enzymatique, le criblage virtuel de la chimiothèque, en utilisant la technique d’arrimage moléculaire ou docking avec le programme Autodock, nous a permis de sélectionner in silico des inhibiteurs potentiels. Il sera très intéressant de confronter les résultats obtenus par le criblage virtuel et le criblage réel pour régler au mieux les paramètres de définition des touches virtuelles. Nous avons résolu la structure du domaine catalytique d’hUNG2 (hUNG2 ? 84) à 1,6 Å, ce qui en fait une cible intéressante pour le criblage cristallographique. Celui-ci consiste à tremper des cristaux de protéines dans des solutions cocktails de composés de faible poids moléculaire (fragments) et de déterminer la structure entre la protéine et les ligands fixés. Par ailleurs, ceci permettra d’explorer d’autres sites de liaison d’inhibiteurs potentiels autour du site actif et d’autre part d’identifier rapidement des fragments tête de série ayant des interactions clés avec la protéine. La structure cristallographique d’hUNG2 en complexe avec les inhibiteurs obtenus par les différents criblages apportera la validation de nos résultats de docking et permettra de comprendre le mécanisme d’inhibition de ces molécules.
La protéine recombinante hUNG2 a été produite et purifiée en quantité suffisante pour effectuer l’ensemble du criblage réel. L’activité de l’enzyme a été testée. Le test enzymatique de criblage repose sur l’inhibition d’hUNG2. Dans cet essai, un ADN simple brin en épingle à cheveux contenant des uraciles est marqué avec un fluophore (FAM) en 5’ et est modifié en 3’ avec un dabsyl qui sert à éteindre le signal de fluorescence émit par le FAM. Quand l’ADN substrat est exposé à l’hUNG2, les uraciles sont supprimés et les deux brins complémentaires de l’épingle à cheveux sont spontanément séparés, le dabsyl se trouve éloigné du FAM ce qui entraîne une augmentation de fluorescence. Le criblage réel débutera au début de l’année 2006.
Le criblage virtuel a été réalisé et les résultats sont en cours d’analyse. Actuellement, trois molécules semblent prometteuses et elles seront prochainement testées enzymatiquement. Par ailleurs, la structure de l’hUNG2 ? 84 a été également résolue à 1,6 Å de résolution au laboratoire. La cristallisation de l’hUNG2 ? 84 et des inhibiteurs potentiels sera réalisée prochainement. L’objectif est d’identifier et d’évaluer de nouvelles molécules actives contre l’hUNG2 et ayant une bonne activité anti-VIH, quel que soit le statut de résistance de l’isolat viral.

P64
Résistance clinique au ténofovir (TDF) chez un patient infecté par le virus de l’hépatite B de génotype A/G

Ducancelle A¹, Payan C², Sablon E³, Le Guillou H¹, Pivert A¹, Chennebault JM⁴, Lunel-Fabiani F¹

¹Laboratoire de bactériologie-virologie, CHU Angers ; ²Laboratoire de bactériologie-virologie, CHU Brest ; ³Unité de virologie, recherche et développement, Innogenetics, Belgique ; ⁴Service de maladies infectieuses, CHU Angers
<alexandra.ducancelle@wanadoo.fr>

Le ténofovir (TDF) est actuellement indiqué dans le traitement des patients infectés par le VHB en seconde intention après un échec thérapeutique avec la lamivudine. Nous rapportons un cas de résistance clinique au TDF chez un patient co-infecté par le VHB et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Il s’agit d’un patient qui était suivi au CHU d’Angers depuis la découverte de sa séropositivité pour le VIH en 1996. L’antigène HBs était négatif à cette époque. Malgré une trithérapie comprenant des analogues nucléosidiques et des inhibiteurs de protéase, la charge virale VIH est toujours restée détectable. En 1997, le patient reçoit une vaccination contre l’hépatite B avant plusieurs séjours programmés en Guyane. Malgré un déficit immunitaire important (CD4 = 100) avant son départ, le patient n’est pas observant et n’est plus suivi médicalement. Quand il revient en France en 2001, le patient est hospitalisé pour une altération majeure de son état général. Au cours de son hospitalisation, le diagnostic d’infection par le VHB est porté devant la découverte d’une cytolyse hépatique et d’un antigène HBs-positif. Avec une charge virale VIH autour de 5 log copies/ml et une charge virale VHB supérieure à 9 log copies/ml, une pentathérapie comprenant le TDF est alors entreprise. Cinq mois après la mise sous TDF, la charge virale VIH devient indétectable et la charge virale VHB diminue de plus de 5 log. Après un rebond de la charge virale VHB en mai 2002, la réplication VHB persiste à un niveau élevé sous traitement par 3TC et TDF jusqu’à ce jour. Nous avons réalisé une étude rétrospective sur le séquençage du gène de l’ADN polymérase à la recherche de nouvelles mutations de résistance et sur le génotypage des souches VHB à partir de plasmas prélevés entre 2001 et 2005. Le gène de l’ADN polymérase virale a été directement séquencé à partir de l’ADN viral extrait (QiaAMP viral DNA extraction kit, Qiagen, Germany). Les génotypes ont été déterminés à l’aide de la trousse Inno-LIPA HBV (Innogenetics, Belgium).

Comme le montre le tableau ci-dessus, deux souches de VHB de génotypes différents ont été mises en évidence. Le gène de l’ADN polymérase de la souche de génotype A est sauvage, alors que celui de la souche de génotype G porte la mutation M204I, associée à la résistance à la lamivudine, et la mutation compensatrice sur le codon 80. La mutation A194T, récemment décrite chez des patients résistants au TDF, n’a pas été détectée.
Les résultats suggèrent que le patient a été co-infecté ou « superinfecté » par deux souches de VHB de génotypes différents. Alors que le génotype A prédominait initialement, le génotype G est devenu majoritaire probablement sous la pression de sélection exercée par le traitement et lorsque la réplication virale réaugmente. La persistance de la réplication du VHB sous TDF, sans apparition de mutations sur le gène de l’ADN polymérase du VHB, pourrait suggérer un rôle des génotypes du VHB dans la résistance au TDF. Les données épidémiologiques récentes montrent que la prévalence de l’infection par le génotype G est en augmentation croissante en Amérique du Sud, ce qui suggère que notre patient a pu être contaminé au cours de ses séjours en Guyane.

P65
Peut-on maintenir une bithérapie lamivudine + adéfovir en présence de mutations conférant des résistances à ces deux antiviraux ?

Larrat S¹, Hilleret MN², Lupo J¹, Nicod S¹, Germi R¹, Zarski JP², Seigneurin JM¹, Morand P¹

¹Laboratoire de virologie, CHU, BP 217, 38043 Grenoble Cedex 9 ; ²Département d’hépatogastro-entérologie, CHU, BP 217, 38043 Grenoble Cedex 9
<SLarrat@chu-grenoble.fr>

Le traitement des hépatites B chroniques par des analogues nucléosidiques (lamivudine) et/ou nucléotiques adéfovir) constitue un net progrès thérapeutique mais est compliqué par l’émergence fréquente de souches du virus de l’hépatite B (VHB) résistantes à ces antiviraux. Ces résistances sont souvent associées à une remontée de la charge virale sérique et parfois à des poussées d’hépatite. De nombreux patients ont bénéficié de séquences thérapeutiques comprenant de la lamivudine en première intention relayée par de l’adéfovir lorsque le virus devenait résistant. Chez ce type de patient, l’évolution de la charge virale VHB et l’histoire naturelle de l’émergence des souches mutantes résistantes aux deux antiviraux est mal connue.
Nous décrivons ici le cas d’un patient successivement traité par lamivudine seule (14 mois) puis, lors de l’apparition de mutations de résistance à la lamivudine, par bithérapie lamivudine + adéfovir (15 mois) et enfin par adéfovir en monothérapie (19 mois). Le traitement actuel comprend la lamivudine et l’adéfovir en bithérapie depuis un an. Une étude rétrospective par séquençage du gène de la transcriptase virale inverse et par PCR sélective de la mutation rtM204V (technique permettant d’augmenter la sensibilité de détection de la mutation) a été effectuée pour étudier l’apparition de mutations de résistance aux traitements.
Les résultats, confirmés par Innolipa DR2, montrent que les mutations de résistance rtM204V, rtN236T et rtA181V à la lamivudine et à l’adéfovir étaient présentes lors de la réimportation de la bithérapie. Malgré la présence simultanée de ces trois mutations, la charge virale de ce patient va se négativer en 1 an environ (< 6 UI/mL en Taqman Roche) et les transaminases resteront normales. Sur le dernier sérum dans lequel l’ADN du virus de l’hépatite B était encore détectable, aucune mutation n’a été observée.
À notre connaissance, la seule description de l’association de mutation conférant à la fois une résistance à la lamivudine et à l’adéfovir correspondait à une construction in vitro comprenant les mutations rtL180M + rtM204V + rtN236T [Brunelle MN, Hepatology, 2005]. Ces mutations étaient responsables d’une augmentation de 58,8 fois de la CI50 de la bithérapie lamivudine + adéfovir. Les mutations rapportées ici sont différentes (rtM204V + rtN236T + rtA181V) et on ne sait pas si elles se situent sur la même souche virale. On constate, néanmoins, la persistance d’une efficacité clinique et virologique de la bithérapie lamivudine + adéfovir après 12 mois de traitement. Une étude approfondie de l’impact de l’association de ces trois résistances sur la capacité réplicative du virus serait à envisager.

P66
Étude in vitro du complexe protéasique des flavivirus, cible potentielle de molécules antivirales

Bessaud M, Pastorino B, Peyrefitte C, Rolland D, Grandadam M, Tolou H

Unité de virologie tropicale, Institut de médecine tropicale du service de santé des armées, Marseille
<publi.viro@laposte.net>

Le genre Flavivirus regroupe plus de 70 virus dont la plupart sont des arbovirus. Plusieurs d’entre eux sont des agents pathogènes humains de première importance responsables dans les formes les plus graves de manifestations hémorragiques ou d’encéphalites parfois mortelles. À l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement contre ces virus. Le génome des flavivirus code une polyprotéine unique, clivée en au moins 10 protéines virales. Ces clivages, indispensables au déroulement du cycle viral, sont dus à des protéases cellulaires et au complexe protéasique viral. Ce dernier, composé de deux protéines virales, NS2B et NS3, constitue une cible séduisante pour une stratégie antivirale. Notre objectif est l’identification et la conception d’inhibiteurs de l’activité du complexe ciblant soit le site catalytique, soit les domaines impliqués dans l’interaction NS2B/NS3.
Le travail présenté ici concerne l’étude in vitro de l’activité de la protéase de plusieurs flavivirus choisis selon plusieurs critères (importance pour la santé humaine, lignage phylogénétique, groupe sérologique, association à un vecteur). Pour chaque virus, les domaines de la polyprotéine impliqués dans le complexe ont été identifiés par analyse de séquences. Différentes protéines recombinantes regroupant ces domaines ont été purifiées et leur activité a été caractérisée in vitro.
Nos résultats montrent que les protéases étudiées présentent des caractéristiques biochimiques communes, mais également certaines différences qui pourraient entraîner une sensibilité variable aux inhibiteurs de l’activité protéasique. L’ensemble des protéines produites constitue un outil actuellement utilisé pour l’étude de différents aspects de l’activité du complexe NS2B/NS3 tels que la spécificité de clivage de chaque protéase, la sensibilité à différents inhibiteurs ou le niveau de conservation des séquences des domaines d’interaction entre les deux partenaires au sein du genre Flavivirus.

P67
Étude du transcriptome interféron chez des patients atteints d’hépatite C chronique sous traitement par l’interféron pégylé et la ribavirine

François C¹, Descamps V¹, Castelain S¹, Brochot E¹, Nicolas N¹, Duchaussoy I², Capron D², Duverlie G¹

¹Laboratoire de virologie, CHU d’Amiens, UPR CNRS 2511 ; ²Service d’hépatogastro-entérologie, CHU d’Amiens.
<catherine.francois@u-picardie.fr>

Le traitement de référence actuel de l’hépatite C chronique associe l’interféron pégylé à la ribavirine. Il reste lourd et onéreux, non dénué d’effets indésirables parfois sévères avec un taux d’éradication virale de l’ordre de 50 %, tous génotypes confondus.
Afin de l’optimiser, nous réalisons une étude du transcriptome interféron à partir des leucocytes périphériques de patients atteints d’hépatite C chronique sous traitement. Les prélèvements sont réalisés avant l’initiation du traitement (J0) et un mois après la première injection (M1) à l’aide de tubes de prélèvements contenant un stabilisateur d’ARN. Après extraction des ARN cellulaires et synthèse d’un ADN complémentaire, l’expression de 100 gènes impliqués dans les défenses antivirales et/ou induits par l’interféron est mesurée par PCR quantitative en temps réel. Ces PCR sont réalisées de manière simultanée à J0 et M1, en duplicate, grâce au système Low Density Array (Applied Biosystems). Parallèlement, un suivi de la charge virale VHC est réalisé afin de déterminer l’efficacité du traitement, de même qu’un dosage de l’interféronémie qui permet de valider le transcriptome interféron.
Les premiers résultats de cette étude mettent en évidence 31 gènes dont l’induction est supérieure à 2 fois ; sur ces 31 gènes, 8 sont induits plus de 10 fois. Parmi ces gènes, on retrouve la protéine PKR, les protéines Mx et les protéines du système 2-5A synthétases. Seul IFI27, dont la fonction est inconnue, présente une induction supérieure à 1000. Ces inductions semblent en outre variables en fonction des patients (PKR, IRF-7IFI27). Certains gènes sont induits chez certains patients, alors qu’ils sont réprimés chez d’autres (indoleamine-pyrrole 2,3 dioxygenase, IRF3). La diversité des réponses entre les patients suggère que plusieurs voies effectrices du système interféron peuvent être efficaces pour obtenir l’éradication virale.
Cette étude pharmacogénétique devrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes antiviraux mis en jeu lors du traitement de l’hépatite C chronique. De plus, elle devrait permettre la mise au point d’un test précoce permettant de mieux prédire la réponse au traitement.

P68
Identification de siRNA antiviraux ciblant les séquences du virus de l’hépatite C portées par un virus chimérique GBV-B/VHC

Chevalier C¹, Saulnier A², Benureau Y¹, Flechet D¹, Colbère-Garapin F², Martin A¹

¹Unité de génétique moléculaire des virus respiratoires, CNRS URA 1966 ; ²Laboratoire des virus entérotropes et stratégies antivirales ; Institut Pasteur, Paris
<saulnier@pasteur.fr>

L’objectif de ce travail est d’évaluer le potentiel d’une stratégie antivirale à base de petits ARN interférents (siRNA pour small interfering RNA) pour traiter l’infection par le virus de l’hépatite C (VHC). Afin de pallier le manque de modèles expérimentaux cellulaires et animaux accessibles, l’équipe a récemment développé un virus chimérique vGB/III (HC), capable d’infecter des petits primates du Nouveau Monde, chez lesquels il cause une hépatite, comme le virus parental GBV-B, un virus de la famille des Flaviviridae très proche du VHC. Le virus vGB/III (HC) contient le domaine III de la région 5’ non codante (NC) du VHC, essentiel pour la traduction de la polyprotéine virale et impliqué dans la réplication du génome viral. Ainsi, nous avons recherché des siRNA ciblant la séquence du domaine III du VHC dans le but d’éprouver leur effet inhibiteur sur la multiplication du virus chimérique vGB/III (HC) dans des hépatocytes primaires en culture, puis à terme chez l’animal. Une étude préliminaire a reposé sur l’utilisation de réplicons du VHC qui dirigent l’expression d’une protéine rapportrice sécrétée dans le surnageant de culture cellulaire et qui confèrent la résistance cellulaire au G418. Dans ce système, nous avons identifié quatre siRNA ciblant la région 5’NC du VHC, qui, lors de cotransfections à de faibles doses avec le réplicon, réduisent considérablement, voire abolissent la réplication de l’ARN viral durant les 7 à 14 jours d’observation post-transfection. Sous pression de sélection du G418 pendant 3 semaines après transfection, les siRNA ont confirmé leur effet inhibiteur sur la formation de clones cellulaires résistants. Nous n’avons pas mis en évidence de substitutions nucléotidiques dans les régions ciblées par les siRNA au sein de l’ARN viral hébergé dans les clones cellulaires résiduels obtenus après une seule transfection avec les siRNA. Cependant, pour limiter un échappement viral potentiel lors de traitements répétés, différentes combinaisons de siRNA ont été testées et les doses minimales nécessaires à une extinction de la réplication de l’ARN viral ont été déterminées. Nous avons également démontré l’effet inhibiteur des siRNA sur la réplication du réplicon hébergé de façon stable dans des lignées cellulaires.
En conclusion, le modèle des réplicons du VHC nous a permis d’identifier des siRNA antiviraux qui éteignent la réplication du génome viral en culture cellulaire. Leur effet sera prochainement étudié au cours du cycle viral complet ex vivo, dans des hépatocytes primaires de primate infectés par le virus chimérique vGB/III (HC), afin de valider l’effet thérapeutique de siRNA sur les infections à hepacivirus.

Interaction virus-cellule 2

Jeudi 20 avril 2006, 15 h 45 à 17 h

Communications orales O69 à O73
Communications affichées P22 à P45

O69
Étude de complexes ribosomiques engageant le facteur de réinitiation de la traduction TAV du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) et des partenaires cellulaires

Thiebeauld O¹, Park HS², Geldreich A¹, Spahn CMT³, Keller M¹, Ryabova LA¹

¹Institut de biologie moléculaire des plantes (CNRS), 12, rue du Général-Zimmer, 67084 Strasbourg Cedex ; ²Département de botanique, Université de Bale, CH 4056 Bale, Suisse ; ³Institu fur Medizinische Physik und Biophysik Charite-Universitatsmedizin Berlin, Ziegelstrasse 5-9, 10117 Berlin.
<odon.thiebeauld@ibmp-ulp.u-strasbg.fr>

Le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), membre type des Caulimovirus de la famille des Caulimoviridae, est un pararétrovirus. Sa protéine TAV est codée par un transcrit monocistronique, contrairement aux autres protéines virales qui le sont par un transcrit polycistronique. Cette protéine joue un rôle essentiel dans l’expression des cinq autres protéines du virus, en activant en trans la réinitiation de la traduction des ORF correspondants à partir d’un messager polycistronique du CaMV. Cette transactivation traductionnelle implique l’association de la protéine TAV avec la machinerie de traduction de la plante hôte. TAV peut se lier à trois protéines de la sous-unité ribosomique 60S (L13, L18 et L24) et, à la sous-unité ribosomique 40S en interagissant avec le facteur d’initiation de la traduction eIF3. Le criblage d’une banque d’ADNc de la plante hôte Arabidopsis thaliana a permis d’isoler un autre partenaire cellulaire de TAV, de fonction inconnue. L’interaction entre TAV et cette protéine cellulaire a été confirmée in vitro par GST pull down ; pour cette raison, cette protéine a été dénommée TAV interacting protein (TAIP).
Des études en protoplastes issus de cellules de tabac BY2 cobombardés par deux clones recombinants codant respectivement pour les protéines TAV et TAIP montrent une colocalisation de ces deux protéines dans le cytoplasme. Cette observation suggérait fortement que la protéine TAIP pourrait être impliquée dans la transactivation traductionnelle médiée par TAV. Cette hypothèse a été confirmée par des expériences de transactivation menées en protoplastes provenant de Nicotiana plumbagnifolia, cotransfectés avec les deux clones décrits précédemment et un plasmide codant pour un ARN bicistronique.
L’analyse de la structure tridimensionnelle des deux complexes ribosomiques impliquant la protéine TAV à savoir 60S-TAV et 80S-eIF3-TAV, permettra de connaître la localisation de la, ou des molécules de TAV lie (es) à la sous-unité 60S, de même que les interactions et les changements conformationnels au sein de chaque complexe ribosomique. Cette analyse se fera par cryomicroscopie électronique. Parallèlement, nous étudions aussi par cette même approche, les complexes formés in vitro par les interactions entre les protéines TAV et TAIP et les sous-unités ribosomiques 60S et 40S. Cette étude permettra de déterminer si TAIP modifie la conformation des complexes ribosomiques contenant la protéine TAV du CaMV.

O70
Identification d’éléments génétiques du VHC régulateurs de la traduction du génome viral

Jaffrelo L¹, Chabas S¹, Pflieger A¹, Wychovsky C², Staedel C¹, Toulme JJ¹

¹Unité Inserm U386, Modulation artificielle des gènes eucaryotes, Université Victor-Segalen Bordeaux 2, 146, rue Léo-Saignat, 33076 Bordeaux Cedex ; ²Institut Pasteur de Lille, Institut de biologie de Lille, CNRS-UPR 2511, groupe Hépatite C, 1 rue du Pr Calmette, BP 447, 59021 Lille Cedex
<jaffrelo@bordeaux.inserm.fr>

La traduction du génome du VHC dépend d’un site d’entrée interne du ribosome (IRES) localisé dans la région 5’UTR hautement structurée de l’ARN viral. Quelques facteurs d’origine cellulaire ou virale capables de moduler l’activité de l’IRES (ITAF : IRES-transacting factors) ont déjà été identifiés ; cependant, la régulation de la traduction du VHC est largement méconnue à l’heure actuelle. Afin d’identifier des éléments régulateurs de la traduction du VHC, nous avons mis en œuvre une stratégie combinatoire dans un environnement cellulaire.
Une banque de fragments aléatoires de 100-200 bases du génome du VHC de génotype 1a a été générée par digestion à la DnaseI et construite de manière à ce que les fragments puissent être exprimés sous forme d’ARN sens ou antisens, ou sous forme de peptides. La banque est introduite sous forme de rétrovirus dans des cellules cibles HepG2 exprimant de manière stable la HSVTK (Herpes simplex thymidine kinase) sous la dépendance de l’IRES du VHC. Après infection par la banque, les cellules sont sélectionnées pendant un mois par exposition à 140 ? M de ganciclovir (GCV), qui est toxique pour les cellules exprimant la thymidine kinase. Cependant, les cellules ayant incorporé un élément de la banque qui soit un régulateur négatif de l’IRES, deviennent résistantes au GCV. Après deux tours de sélections au GCV, nous avons isolé 28 clones HepG2-HSVTK résistant au GCV, desquels nous avons pu récupérer par PCR les fragments VHC potentiellement actifs, intégrés dans l’ADN génomique. Ces fragments ont été identifiés par séquençage.
Parmi les 6 éléments VHC majoritaires identifiés au cours de ce processus de sélection, seuls deux sont capables de reproduire le phénotype GCV-résistant : un fragment sens localisé dans NS5a et un autre dans NS5b. Ces fragments sont aussi capables d’inhiber la traduction IRES-dépendante de la luciférase Renilla, sans affecter la traduction cap-dépendante de la luciférase Firefly, dans une construction bicistronique.
Ainsi, ces deux éléments génétiques du VHC sont susceptibles d’inhiber l’IRES du VHC. Il conviendra de déterminer s’ils agissent sous forme d’ARN ou de peptide, et de manière directe sur l’IRES, dans le cadre d’une autorégulation de la traduction du virus, ou indirectement en séquestrant un ITAF.

O71
Régulation transcriptionnelle de la sous-unité ARN virale de la télomérase

ShkreliM, Soubieux D, Kut E, Dambrine G, Rasschaert D

Laboratoire TLVI, UR086, INRA de Tours, 37380 Nouzilly
<shkreli@tours.inra.fr>

La maladie de Marek est caractérisée par le développement de tumeurs lymphoïdes de type T chez le poulet et la dinde. Son agent causal, le virus de la maladie de Marek (MDV), est un alphaherpesvirus. L’identification du gène de la sous-unité ARN matricielle de la télomérase (TR) au sein du génome du MDV a mis en évidence un nouvel élément viral potentiellement impliqué dans la lymphomagenèse associée au MDV. En effet, la télomérase est une ribonucléoprotéine, composée d’une partie protéique (TERT) présentant une activité transcriptase inverse, et d’une sous-unité ARN matricielle (TR). Responsable de l’élongation des télomères dans les cellules à fort taux de division, la télomérase est fortement impliquée dans l’immortalisation des cellules lors de l’oncogenèse.
Une précédente étude menée au laboratoire a montré que la sous-unité ARN virale de la télomérase (vTR) permet de reconstituer une activité télomérase in vitro. La première partie du travail présenté ici consiste en l’étude de la régulation de l’activité télomérase et de l’expression des partenaires du complexe télomérasique lors de l’infection par le MDV. Les résultats obtenus in vivo au cours de l’infection de poulets par la souche oncogène MDV-RB1-B montrent une augmentation de l’activité télomérase corrélée à la formation de tumeurs chez le poulet. De plus, l’analyse de la transcription des gènes relatifs à la télomérase (vTR, ainsi que les sous-unités cellulaires aviaires chTR et chTERT) montre que seule l’expression de vTR est augmentée de façon concomitante avec l’activité télomérase lors de la tumorogenèse. Ce résultat a ensuite été confirmé in vitro par l’étude de la fonctionnalité des promoteurs de vTR et chTR utilisant la luciférase comme gène rapporteur. En effet, le promoteur de vTR montre une efficacité transcriptionnelle au moins deux fois plus importante que pour le promoteur de chTR dans les deux lignées cellulaires aviaires testées (LMH et MSB1). La fonctionnalité des éléments cis-régulateurs présents dans les promoteurs de vTR et chTR a ensuite été testée par clonage de promoteurs mutants en amont du gène de l’enzyme rapporteur (luciferase firefly). Nous avons ainsi montré que la boîte TATA-like était nécessaire à l’expression des sous-unités ARN virale et cellulaire aviaire de la télomérase. Nous avons ensuite étudié l’implication des éléments cis-régulateurs spécifiques du promoteur de vTR dans la régulation de son expression. Les résultats obtenus montrent que dans les deux types cellulaires testés, la régulation de l’expression de vTR est sous l’influence de la boîte E localisée deux nucléotides en aval du site initiateur de transcription. De plus, par surexpression de l’oncoprotéine c-Myc et par des essais de ChIP, il a été montré que la transactivation via cette boîte E impliquait l’oncoprotéine c-Myc.

O72
L’infection de cellules humaines par le virus de l’encéphalomyocardite (EMCV) est modulée par le type cellulaire et la nature de la souche virale

HammoumiS, Guy M, Bakkali Kassimi L

UMR 1161 INRA-AFSSA-ENVA, 7 avenue du Général-de-Gaulle, 94700 Maisons-Alfort
<shammoumi@vet-alfort.fr>

Dans le but d’évaluer le risque de transmission du virus de l’EMC de l’animal, en particulier le porc, à l’homme, nous nous sommes intéressés à l’interaction du virus de l’EMC avec des cellules humaines avec comme objectif la mise en évidence des facteurs susceptibles de limiter ou de favoriser cette transmission. Ainsi nous cherchons à déterminer si la sensibilité des cellules humaines dépend de la souche virale et/ou de l’origine tissulaire du phénotype des cellules, à quelle étape du cycle virale la multiplication du virus est-elle bloquée pour les cellules insensibles et enfin, quels sont les déterminants viraux impliqués dans cette restriction.
Les résultats ont montré que les cellules humaines sont permissives à l’EMCV, notamment des cellules primaires du myocarde et rénales. Cependant, l’effet cytolytique varie en fonction du type cellulaire, la multiplication virale étant plus efficace dans les cardiomyocytes que dans les cellules rénales. En outre, une variation a également été observée entre les souches. Cette différence pourrait être expliquée par leur historique de passage sur cultures cellulaires en laboratoire. En effet, le pouvoir infectieux, sur les cellules humaines testées, d’une souche virulente (B279) s’est avéré fortement atténué après plusieurs passages successifs sur cellules BHK21. Cette diminution du pouvoir infectieux corrèle avec une diminution de sa capacité d’attachement sur les cellules humaines. Ces résultats ont également été observés pour vingt et un variants isolés à partir de la souche atténuée. La comparaison de la séquence des protéines de capside de ces variants avec celle de la souche d’origine a permis d’identifier quatre mutations N12S, N62D, K102E, K231R au niveau de la protéine majeure de capside VP1. D’après des études de cristallographie de la capside, les acides aminés 62, 102 et 231 sont situés à la surface de la particule.
Par des études de mutagenèse à partir d’un clone infectieux, nous avons montré que la mutation N62 en D62 ne modifie pas le pouvoir d’attachement du virus sur les cellules humaines. Cependant, cette mutation induit une diminution du pouvoir infectieux, ce qui suggère un rôle de cet acide aminé dans une étape ultérieure du cycle. Par ailleurs, l’analyse de l’interaction de quinze variants isolés à partir d’une autre souche, 1086C, a permis d’identifier deux groupes qui diffèrent par leur pouvoir cytolytique et d’attachement sur les cellules humaines. Les analyses de séquences de la protéine VP1 ont montré une seule variation au niveau de l’acide aminé 231 entre les deux groupes. Les clones s’adsorbant mieux et cytopathogènes portent une lysine alors que les autres portent une arginine. Par ailleurs, cet acide aminé a été décrit comme intervenant dans l’attachement aux érythrocytes par une sialoglycoprotéine, la glycophorine A. Cela suggère un rôle de cet acide aminé dans l’attachement du virus aux cellules humaines nucléées via des acides sialiques.
Il en résulte que la sensibilité des cellules humaines à l’EMCV dépend non seulement de la souche mais également du type cellulaire, que l’acide aminé 62 de la protéine de capside VP1 ne jouerait pas de rôle dans l’attachement mais probablement dans l’internalisation et que la nature de l’acide aminé 231 de la protéine de capside VP1 a une influence sur l’infection des cellules humaines : son rôle dans le cycle viral se situerait au stade de l’attachement. Cette hypothèse est en cours de vérification par la production de virus muté en position 231 de la protéine VP1.

O73
Caractérisation des sites d’intégration du rétrovirus endogène porcin (PERV) dans le génome de cellules humaines infectées in vitro

Moalic Y, Blanchard Y, Felix H, Jestin A

Unité de génétique virale et biosécurité, Agence française de sécurité sanitaire des aliments (Afssa)
<y.moalic@afssa.ploufragan.fr>

La capacité du rétrovirus endogène porcin (PERV) à infecter des cellules humaines in vitro a été démontrée, ce qui suscite des interrogations sur la biosécurité de greffes utilisant le porc comme animal donneur et sur le risque zoonotique afférent.
Le PERV, comme tous les rétrovirus, possède un cycle de vie nécessitant une étape particulière irréversible : l’intégration du génome proviral dans le génome de la cellule hôte. Le risque associé à l’étape d’intégration rétrovirale a été clairement caractérisé par deux cas de leucémies développés lors d’un programme de thérapie génique utilisant un vecteur rétroviral appliqué à onze patients. Dans chacun des cas, la maladie a été causée par la modification de l’expression du proto-oncogène LMO2 suite à l’insertion de la séquence thérapeutique en amont de ce gène. Le risque rétroviral dépend donc du site d’intégration dans le génome et des éventuelles modifications de l’expression des gènes qui en découlent.
Dans le but d’étudier le risque lié à l’intégration du PERV dans le génome humain, nous avons entrepris de caractériser le profil d’intégration du génome proviral du PERV dans une lignée cellulaire humaine in vitro.
La recherche des sites d’intégration du PERV a été réalisée au cours d’une cinétique d’infection de la lignée HEK293. L’inoculum viral utilisé est un surnageant de culture de la lignée porcine PK15 infectée. Une stratégie de capture de séquences a été définie : L’ADN génomique cellulaire subit une LM-PCR après digestion par une l’endonucléase MseI, les fragments d’intérêts PERV/humain amplifiés sont ensuite purifiés sur billes magnétiques par couplage biotine-streptavidine, puis amplification par nested-PCR. Les produits de PCR obtenus sont purifiés sur colonne avant séquençage. Trois critères ont été retenus pour caractériser une insertion : 1) une séquence hybride PERV/humain, 2) la présence du dinucléotide CA caractéristique de l’intégration à l’extrémité 3’ du génome proviral et 3) une homologie des séquences humaines supérieur à 95 % avec celles contenues dans les banques de données. À ce jour, 191 sites d’intégration du PERV dans le génome de la lignée cellulaire humaine HEK-293 ont été caractérisés 15 jours post-infection.
Dans un premier temps, l’analyse a porté sur l’identification des zones d’intégration préférentielles : 1) les sites d’intégration sont répartis de façon homogène sur les différents chromosomes, 2) 43,5 % des sites d’intégration sont localisés dans les unités de transcription (TU) et 3) les zones proches (+/- 5 kb) des îlots CpG et des extrémités 5’ des TU sont préférentielles (5.5 fois et 15 fois supérieur à une intégration aléatoire). Dans un second temps, la recherche d’une séquence consensus d’intégration, par l’étude statistique des bases encadrant les zones d’intégration, a été menée et permet de visualiser un palindrome statistique de 8 nucléotides spécifique au PERV : « TGGTACCA ». Comparé aux autres rétrovirus (MLV, HIV, SIV, ASLV), il apparaît que le profil d’intégration du PERV est comparable à celui du MLV avec un biais marqué envers les zones proches des îlots CpG et des extrémités 5’des TU.
L’étude du profil d’intégration du PERV a, ainsi, permis de souligner des similitudes entre deux rétrovirus le PERV et le MLV ; tout en relevant des différences. L’analyse des sites d’intégration du PERV dans une cellule humaine sera poursuivie par l’étude de l’activité transcriptionnelle des gènes à partir : 1) de données disponibles dans les banques et 2) des données de l’analyse du transcriptome des cellules infectées par le PERV.

Structure et morphogenèse virale 1

Jeudi 20 avril 2006, 15 h 45 à 17 h

Communications orales O74 à O78
Communications affichées P79 à P95

O74
Structures de la glycoprotéine G de VSV sous ses conformations neutres et acides

Roche S, Bressanelli S, Rey FA, Lepault J, Gaudin Y

Laboratoire de virologie moléculaire et structurale, CNRS-INRA UMR 2472, 1 avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex
<roche@vms.cnrs-gif.fr>

La glycoprotéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) est constituée de trois monomères de 63 kDa et joue un rôle lors de la reconnaissance du récepteur du virus, ainsi que lors du processus de fusion entre les membranes virales et cellulaires. Un abaissement du pH déclenche une série de réarrangements structuraux de G qui vont conduire à la fusion. Trois conformations ont été décrites jusqu’à présent : la forme native (N), présente à la surface du virus à pH 7 ou plus, la forme activée (A) hydrophobe sous laquelle G va s’ancrer à la membrane cible pour induire le processus de fusion et la forme inactivée (I) plus stable à pH. Il existe un équilibre dépendant du pH entre ces différentes conformations. La transition vers la forme inactivée est donc réversible, contrairement à ce qui est observé avec les protéines fusogènes des autres familles virales. Cela indique également que la forme native n’est pas métastable.
Par protéolyse ménagée, nous avons isolé un ectodomaine soluble de la glycoprotéine de VSV-Indiana. Ce fragment EctG conserve les propriétés biochimiques de la protéine entière (état oligomérique, capacité à changer de conformation en fonction du pH, capacité à se lier aux membranes à pH acide). Il a pu être cristallisé dans de nombreuses formes cristallines à des résolutions allant jusqu’à 2,5 Å. Ces cristaux nous ont permis de résoudre la structure de EctG à la fois sous les conformations neutres et acides.
Ces structures révèlent la localisation du peptide de fusion de G, l’amplitude du changement de conformation à pH acide et permettent de comprendre les bases moléculaires de la réversibilité. De plus, elles prouvent de manière définitive que G est différente de toutes les autres protéines fusogènes décrites à ce jour.

O75
Assemblage et bourgeonnement du virus de Sendai

Gosselin-Grenet AS, Roux L

Département de microbiologie et médecine moléculaire, Centre médical universitaire, Genève, Suisse. <anne-sophie.gosselin@medecine.unige.ch>

Pour faciliter leur bourgeonnement, de nombreux virus enveloppés détournent la machinerie de la cellule hôte, et notamment la voie cellulaire impliquée dans la formation des corps multivésiculaires (MVB). Les rétrovirus, par exemple, peuvent rediriger cette machinerie à la membrane plasmique ou bourgeonner directement à partir des MVB et quitter la cellule par la voie d’exocytose. L’interaction avec les MVB se fait par l’intermédiaire d’un domaine dit ’late’, présent dans la protéine de matrice.
Pour le virus de Sendai, prototype de la sous-famille des Paramyxovirinae, il est généralement admis que l’assemblage et le bourgeonnement se déroulent à la membrane plasmique, où les deux glycoprotéines virales HN (hémagglutinine-neuraminidase) et F (fusion) sont ancrées dans la bicouche lipidique. La protéine de matrice M, qui forme un feuillet sur la face interne de la membrane plasmique, rassemblerait les glycoprotéines de surface et la nucléocapside reconnaîtrait cette portion de la membrane enrichie en protéines virales. Les virions bourgeonneraient ensuite à partir de la membrane plasmique. Aucun motif late traditionnel n’a été à ce jour identifié dans la protéine M de Sendai. Mais les protéines virales C, dite « accessoires », ont été rapportées interagir avec AIP1/Alix, une protéine faisant partie de complexes actifs dans les MVB [Sakaguchi T et al., 2005].
Nous avons donc cherché à déterminer si le virus de Sendai utilisait malgré tout la voie des MVB lors de l’étape du bourgeonnement et/ou si les MVB pouvaient également être un site d’assemblage menant au bourgeonnement. Pour cela, nous avons mesuré la production virale dans les conditions où l’expression d’Alix est inhibée par un siRNA spécifique. Nous avons également étudié si le bourgeonnement du virus était sensible à l’expression d’un mutant dominant négatif de VPS4A, une ATPase impliquée dans la voie de formation des vésicules endosomales dont l’activité peut se révéler essentielle au moment du détachement du bourgeon viral. Par ailleurs, afin de préciser le site d’assemblage du virus de Sendai, nous avons utilisé des virus recombinants dont la glycoprotéine HN est mutée et n’est pas incorporée dans les particules virales, bien qu’elle soit exprimée à la surface de la cellule. Nous avons notamment suivi par immunofluorescence la distribution cellulaire et le devenir de la protéine mutée en comparaison avec la protéine sauvage. Les résultats obtenus seront présentés.

O76
Structure cristalline de la protéine de capside du VIH1 en complexe avec un peptide inhibiteur de l’assemblage viral

Ternois F¹, Sticht J², Duquerroy S^1,3, Kräusslich HG², Rey FA^1,3

¹Laboratoire de virologie moléculaire et structurale, UMR 2472/1157 CNRS-INRA et IFR 115, avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex ; ²Department of Virology, Universitätsklinikum Heidelberg, 69120 Heidelberg, Germany ; ²Département de Virologie, Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux, 75015 Paris.
<ternois@vms.cnrs-gif.fr>

Après assemblage sous la membrane cytoplasmique de la cellule hôte, les virions de VIH1 bourgeonnent sous la forme de particules immatures et sphériques. Ce processus d’assemblage est régulé par les interactions entre les polyprotéines de Gag. La maturation protéolytique de Gag dans le virion conduit à la formation des particules matures, contenant une capside conique caractéristique des lentivirus. Le domaine C-terminal de la protéine de capside du VIH1 (C-CA), structure globulaire à quatre hélices α, forme un dimère et contient des déterminants d’oligomérisation essentiels pour l’assemblage de ces particules. Ce travail présente la structure cristalline à 1,7 Å de résolution de C-CA en complexe avec un peptide capable d’inhiber l’assemblage in vitro des particules pseudovirales immatures et matures. Le peptide, qui forme une hélice α, s’insère dans un sillon hydrophobe de C-CA, formant ainsi une structure compacte à cinq hélices. Le peptide inhibiteur modifie les interactions dimériques et aboli la formation des particules. Cette structure met en évidence un nouveau site réactif dans la protéine de capside du VIH, cible potentielle pour une nouvelle thérapie antivirale.

O77
Morphogenèse du virus de l’hépatite Delta : interactions entre la protéine d’enveloppe S du virus de l’Hépatite B et de la protéine L du virus de l’hépatite Delta via leurs résidus carboxyterminaux

Komla-Soukha I, Sureau C

Laboratoire de virologie moléculaire, INTS, 6 rue Alexandre-Cabanel, 75739 Paris Cedex15
<ikomla@ints.fr>

Le virus de l’hépatite Delta (HDV) est un agent sous-viral, satellite occasionnel du virus de l’hépatite B (HBV). Dans un hépatocyte humain infecté, le génome, un ARN circulaire de petite taille, peut se répliquer en l’absence d’HBV. Il s’associe à de multiples copies de la protéine delta (seule protéine codée par le génome HDV) présente sous deux formes : la protéine S-HDV impliquée dans la réplication du génome et la protéine L-HDV nécessaire à l’assemblage des virions. Il se forme alors des ribonucléoprotéines (RNP) qui ne quitteront la cellule, sous forme de virions enveloppés, que grâce au système d’export fourni par le virus auxiliaire HBV.
Le HBV, prototype de la famille des Hepadnaviridae, est un virus à ADN enveloppé dont l’export est dirigé par la petite protéine d’enveloppe S, seule responsable de la dynamique de bourgeonnement. Cette protéine forme des agrégats qui bourgeonnent spontanément dans la lumière du réticulum endoplasmique sous forme de particules sous-virales lipoprotéiques appelées particules HBs. Ce mécanisme d’auto-bourgeonnement est extrêmement efficace et joue un rôle central dans la fonction d’auxiliaire qu’exerce HBV pour HDV.
Nous nous intéressons à l’analyse moléculaire de l’enveloppement de la RNP HDV en recherchant, sur les protéines S-HBV et L-HDV, les déterminants aminoacides impliqués dans la morphogenèse de la particule HDV.
En premier lieu, nous avons montré que la substitution par une thréonine de l’asparagine à la position 146 (conduisant à un mutant S non glycosylé) conserve la capacité de S-HBV à interagir avec la protéine L-HDV alors que la substitution par une phénylalanine du tryptophane à la position 196 ne permet plus cette interaction. Ensuite, nous avons examiné le rôle des nombreux résidus tryptophanes de la région carboxyterminale de S-HBV et avons mis en évidence l’importance des résidus tryptophanes 196, 199 et 201 dans l’interaction avec la protéine L-HDV. Puis, par des expériences d’enveloppement de protéines GFP-L-HDV par la protéine S-HBV, nous montrons que les 19 résidus carboxyterminaux de L-HDV sont suffisants pour l’enveloppement par S-HBV, mais que les résidus situés juste en amont de cette région et appartenant à la fois à la S-HDV et à la L-HDV facilitent l’export des particules HDV.

O78
Structure du triatoma virus

Squires G, Pous J, Bressanelli S, Rozas-Dennis GS, Costabel MD, Navaza J, Guérin DMA, Rey FA

Laboratoire de virologie moléculaire et structurale, CNRS, bâtiment 14, 1, avenue de la Terrasse, 91190 Gif-sur-Yvette
<squires@vms.cnrs-gif.fr>

TrV est un virus non enveloppé dont le génome est composé d’un ARN simple brin positif. Il possède trois protéines de capside différentes chacune d’un poids d’environ 30 kDa et le diamètre de la capside icosaédrique est d’environ 30 nm. Tout d’abord classé comme un « picorna-like » virus compte tenu de sa similarité dans la composition et la taille de leurs protéines de capside et des propriétés biophysiques de leur génome d’ARN, TrV a ensuite été classé comme un membre appartenant à la famille des Dicistroviridae et au genre Cripavirus une fois sa séquence nucléotidique complètement déterminée. Médicalement, c’est un virus important dans la mesure où il est un agent de contrôle potentiel des triatomines, les insectes qui sont les vecteurs de la maladie de Chagas, endémique dans 21 pays d’Amérique du Sud.
Sa structure cristallographique a été déterminée par remplacement moléculaire à 2,5 Å de résolution, à partir de celle d’un virus homologue, le virus de la paralysie du grillon (CrPV), malgré la faible identité de séquence (26 %). Les comparaisons détaillées des picorna-like de plantes, des picornavirus de mammifères et des cripavirus démontrent clairement que les capsides sont reliées dans l’évolution tandis que la sophistication des capsides reflète directement la complexité des cycles de vie des virus.

P79
Etude des interactions entre les protéines VP1 et VP3 du virus de la bursite infectieuse aviaire (IBDV)

Decouche V¹, Squires G¹, Chevalier C², Da Costa B², Delmas B², Bressanelli S¹

¹Unité mixte de recherche 2472 CNRS-INRA Virologie moléculaire et structurale, 1, avenue de la terrasse, 91190 Gif-sur-Yvette ; ²Unité de Virologie et Immunologie Moléculaires, INRA, Domaine de Vilvert, 78350 Jouy-en-Josas.
<decouche@vms.cnrs-gif.fr>

Bien que la capside virale de l’IBDV soit de mieux en mieux décrite, les mécanismes exacts de son assemblage restent hypothétiques. Trois protéines forment la capside de ce virus non enveloppé, VP2 en est la protéine majeure (sous forme de trimères en surface du virion), VP3 est localisée sous VP2 et tient un rôle central dans l’orchestration de l’encapsidation, VP1 est l’ARN polymérase ARN-dépendante virale et en interagissant avec VP3, elle permet l’encapsidation du génome viral auquel elle peut se lier covalement.
Lors de l’assemblage, VP1 et VP3 doivent d’abord interagir pour que cette dernière soit activée et puisse interagir à son tour avec pVP2 (précurseur de VP2). Les interactions VP3/pVP2 sont nécessaires à l’émergence de la forme mature VP2 (clivage d’un peptide de pVP2 en C-term), induisant un assemblage correct de la capside.
Notre étude s’attache à déterminer la nature des interactions entre VP1 et VP3. Dans un premier temps on produit et on purifie les protéines virales VP1 et VP3. Une fois les deux protéines purifiées, nous procédons à la formation et à la caractérisation du complexe VP1-VP3. Des essais de cristallisation du complexe sont par ailleurs envisageables. Leur production se fait en système baculovirus. Pour chaque protéine, deux baculovirus recombinants ont été préparés, comportant ou non une queue polyhistidine en N-term. La purification de ces protéines s’opère sur colonne de nickel. Pour vérifier la formation du complexe VP1-VP3, on procède également à la purification de celui-ci en ne faisant exprimer qu’à une des deux espèces protéiques une queue polyhistidine en C-term. Dans la même optique, on fait passer dans une colonne d’exclusion de taille VP1 ou VP3, déjà purifiées, puis les deux en même temps afin d’évaluer la taille du complexe. Il apparaît qu’il y a bien formation du complexe VP1-VP3 in vitro et que des essais de cristallisation sont envisageables. Au moment où ce résumé est soumis, la caractérisation du complexe (stœchiométrie et affinité) est en cours et les essais de cristallisation vont commencer.

P80
Etat d’oligomérisation et stabilité en solution de la phosphoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire

Gérard F¹, RAMOS CHI², Jamin M², Ruigrok RWH²

¹Institut de virologie moléculaire et structurale (IVMS, FRE2854 CNRS-UJF), 6, rue Jules Horowitz, BP 181, 38042 Grenoble Cedex 9 ; ²Centro de Biologia Molecular Estrutural, Laboratorio Nacional de Luz Sincroton, PO Box 6192, Campinas SP, 13084-971, Brazil
<fgerard@embl-grenoble.fr>

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) est un virus enveloppé, non segmenté, dont le génome est composé d’une seule molécule d’ARN simple brin de polarité négative, opposée à celle de l’ARNm, qui code pour 5 protéines virales. Le VSV sert de modèle pour l’étude de la multiplication des virus appartenant à l’ordre des Mononegavirales. L’ARN polymérase ARN-dépendante virale (L) n’est pas active sur l’ARN nu, mais nécessite une matrice formée par l’ARN et la nucléoprotéine virale (N). La polymérase virale est fixée sur la matrice N-ARN par l’intermédiaire de la phosphoprotéine (P).
La protéine P a deux rôles majoritaires : elle est un cofacteur de l’ARN polymérase ARN-dépendante virale (L) et chaperonne la nucléoprotéine (N). La phosphorylation cette protéine par la caséine kinase II (CKII) semble induire son oligomérisation et serait nécessaire pour la transcription et la réplication du génome viral. Il a été montré que l’oligomérisation de la protéine P est nécessaire pour la fixation de N et L. Toutefois, la stœchiométrie des homopolymères formés par la protéine P, leur structure et leur rôle exact dans les processus de transcription et de réplication, n’est pas clair : il a été proposé, par l’utilisation de méthodes différentes, que la protéine P forme des tétramères ou encore des trimères.
Nous avons entrepris une caractérisation biochimique, biophysique et structurale de la phosphoprotéine P du VSV. Pour cela nous avons exprimé la protéine P recombinante dans deux systèmes d’expression différents : le système baculovirus/cellules d’insectes où la purification de la protéine native a été mise au point, ainsi que le système bactérien où la protéine native a été purifiée grâce à une étiquette histidine. Dans ces deux systèmes, la protéine P obtenue après purification est tronquée de 5 à 14 résidus du côté N-terminal.
L’utilisation de diffusion de lumière statique couplée à la chromatographie d’exclusion de taille (Sec-Malls : size-exclusion chromatography - multi-angle laser light scattering) et réfractométrie, nous a permis de déterminer l’état d’oligomérisation de la phosphoprotéine en solution. La détermination de la masse moléculaire de la protéine P en solution a révélé qu’elle existait essentiellement sous la forme de dimères. Le rayon hydrodynamique de 5,4 nm de ce dimère indique que la protéine P a une forme non-globulaire.
Les méthodes d’analyses biophysiques (dichroïsme circulaire et fluorescence intrinsèque des tryptophanes) de la stabilité de la protéine P (expériences de dénaturation chimique (urée) à l’équilibre) suggère qu’une partie de la séquence (environ 60 acides aminés) acquiert une structure tertiaire. Couplé à l’analyse bio-informatique, nous mettons en évidence que la protéine P de VSV pourrait faire partie des protéines intrinsèquement désordonnées (IPD : intrinsically disordered proteins), dont l’importance a été mise en évidence récemment [Gerard et al., en préparation].

P81
Etude du repliement induit du domaine C-terminal de la nucléoprotéine du virus de la rougeole à l’aide de sondes paramagnétiques

Morin B¹, Bourhis JM¹, Belle V2, Woustra M², Carrière F³, Guigliarelli B², Canard B¹, Fournel A², Longhi S¹

¹AFMB : Architecture et fonction des macromolécules biologiques, Département Réplication virale : structure, mécanismes, et drug-design, UMR6098, CNRS, Université de Provence, Université de la Méditerranée, Parc scientifique et technologique de Luminy, Case 925, 163 avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09 ; ²Bioénergétique et ingénierie des protéines, UPR 9036 CNRS, 31 chemin Joseph-Aiguier, 13402 Marseille Cedex ; ³Enzymologie interfaciale et physiologie de la lipolyse, UPR 9025, 31 chemin Joseph-Aiguier, 13402 Marseille Cedex
<Jean-Marie. Bourhis@afmb.univ-mrs.fr>

Le virus de la rougeole est un agent pathogène humain majeur qui appartient à l’ordre des Mononegavirales. Son génome, constitué par de l’ARN à simple brin, non segmenté et de polarité négative, est encapsidé par la nucléoprotéine (N) pour former une nucléocapside hélicoïdale. Les Mononegavirales utilisent ce complexe comme matrice pour la transcription et la réplication. Ces dernières réactions sont effectuées par l’ARN-polymérase ARN-dépendante, qui est un complexe constitué par le produit du gène L et la phosphoprotéine (P).
N possède un domaine C-terminal (NTAIL, aa 401-525) qui est intrinsèquement désordonné et qui subit un repliement induit lors de l’interaction avec le domaine C-terminal (XD, aa 459-507) de P. Au sein de NTAIL, nous avons identifié un alpha-MoRE (molecular recognition element, aa 488-499) impliqué dans la transition alpha-hélicale et un site additionnel (Box3, aa 517-525) également impliqué dans l’interaction avec XD.
La technique du marquage de spin consiste à introduire un radical nitroxyde en un site déterminé de la protéine. Cette sonde paramagnétique est observée à l’aide de la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE). La mobilité de la sonde reflète la mobilité locale des résidus dans l’environnement proche. Dans le but d’obtenir des informations sur l’implication de résidus spécifiques de NTAIL lors de l’interaction avec ses partenaires, nous avons utilisé la technique du marquage de spin.
Pour cela, nous avons ciblé trois sites au sein de NTAIL, correspondant à des régions conservées chez les nucléoprotéines des morbillivirus, à savoir la Box1 (aa 401-420), l’alpha-MoRE (aa 489-499) et la Box3 (aa 517-525). Le radical nitroxyde se liant de façon covalente à la fonction thiol, nous avons introduit par mutagenèse dirigée trois résidus cystéine uniques dans les positions 407, 488 et 517. Après purification de ces trois variants et fixation covalente du radical nitroxyde sur la chaîne latérale des résidus cystéine, nous avons étudié, à travers les spectres RPE, les variations de mobilité de la sonde paramagnétique en présence soit de trifluoroéthanol (TFE) (un inducteur de structure secondaire), soit de XD.
Nous avons observé des différences dans la mobilité des sondes paramagnétiques en fonction de leur position au sein de NTAIL. En présence de XD, une baisse de mobilité est observée pour les sondes fixées à proximité l’alpha-MoRE et de la Box3. En revanche, l’ajout de XD n’affecte pas la mobilité de la sonde fixée dans la Box1. Le TFE induit une rigidification dans la région N-terminale de NTAIL et à proximité de l’alpha-MoRE, alors qu’il n’a pas d’effet décelable sur la mobilité de la sonde fixée sur la Box3. Ces résultats prouvent que certaines régions protéiques « résistent » à la structuration même en présence de concentrations de TFE importantes (40 %), ce qui souligne la pertinence de l’utilisation du TFE pour obtenir des informations sur les propensions à la structuration. De plus, ces études ont permis d’identifier la Box1 en tant que région additionnelle de NTAIL susceptible de subir un repliement induit. La propension à la structuration de la Box1 n’avait jamais été décelée lors des études spectroscopiques précédentes. Cette région interagissant avec le récepteur cellulaire NR, un repliement induit de la Box1 lors de l’interaction avec ce dernier pourrait être postulé.
La technique du marquage de spin est une méthode qui est bien adaptée à l’étude des phénomènes de repliement induit que les protéines intrinsèquement désordonnées subissent lors de l’interaction avec un partenaire. De plus, cette technique à l’avantage de fournir des informations spécifiques sur la contribution au repliement induit à l’échelle de l’acide aminé.

P82
Étude structurale du complexe d’import nucléaire : importine α 5 humaine – nucléoprotéine du virus de la grippe

Boulo S¹, Akarsu H¹, Müller CW², Ruigrok RWH¹, Baudin F¹

¹Institut de virologie moléculaire et structurale (IVMS) ; ²European Molecular Biology Laboratory (EMBL), 6, rue Jules-Horowitz, BP 181, 38042 Grenoble Cedex 9
<boulo@embl-grenoble.fr>

Le virus de la grippe est un virus enveloppé de la famille des Orthomyxoviridae. Il se caractérise par un génome segmenté en 8 molécules d’ARN monocaténaires de polarité négative. Ces ARN sont organisés en particules ribonucléoprotéiques (RNP) et possèdent une structure hélicoïdale. Les RNP comprennent, outre l’ARN, les nucléoprotéines (NP) avec en moyenne une NP toutes les 24 bases, ainsi que la polymérase virale composée de trois sous-unités : PA, PB1 et PB2, fixées aux extrémités 3’ et 5’ des segments d’ARN. L’originalité de ce virus à ARN négatif est liée au lieu de transcription et de réplication de son génome : le noyau de la cellule. La nécessité d’aller dans le noyau est liée à l’épissage des segments 7 et 8 de son génome et – autre particularité du virus de la grippe – à l’utilisation des coiffes 5’m7GpppXm des ARN messagers cellulaires.
Lorsque le virus infecte une cellule, les RNP doivent pénétrer à l’intérieur du noyau. Après la traduction des protéines virales dans le cytoplasme, certaines d’entre elles doivent regagner le noyau pour entrer dans la formation de nouveaux RNP. Dans ce contexte, ces différentes protéines et complexes empruntent le pore nucléaire qui assure un rôle de gardien et contrôle les échanges entre le cytoplasme et le noyau. L’import nucléaire actif fait appel à des protéines de transport telles que les importines (Imp), capables de reconnaître une séquence peptidique nommée signal de localisation nucléaire (NLS). Chez l’homme, les importines α1, α3 et α5 reconnaissent la NP virale et lui permettent d’entrer activement dans le noyau.
Notre objectif principal est d’étudier l’import de la nucléoprotéine du virus de la grippe. Cette protéine précoce est l’une des premières à entrer dans le noyau au cours du cycle viral. Le rôle de la NP est multiple. Une de ses fonctions est de recouvrir le génome viral afin d’empêcher la formation d’ARN double brin qui serait reconnu comme néfaste et dégradé par la cellule. De plus, en se fixant à l’ARN viral, elle expose les bases pour les présenter à l’ARN polymérase virale dans les étapes de transcription et de réplication.
Notre stratégie consiste à fixer la nucléoprotéine virale à l’importine α5 humaine par son signal NLS. Nous avons mis au point la purification de chaque protéine, la formation du complexe et nous avons réussi à obtenir un complexe NP-Imp α5 qui présente une stœchiométrie 1 : 1. Une structure du complexe à 30 Å de résolution environ a été déterminée par microscopie électronique à transmission en coloration négative. Nous avons également cherché à positionner à l’intérieur de cette densité un homologue structurale de l’importine α5, Kapα50, caractérisé chez la levure [Conti et al., 1998]. Nous cherchons maintenant à améliorer la résolution du complexe obtenu et à déterminer la position des domaines N et C-terminaux de chaque protéine par l’utilisation d’anticorps monoclonaux afin de déterminer la densité occupée par la nucléoprotéine.

P83
La RNA-polymérase RNA-dépendante du virus de West-Nile : structure et mécanisme

Egloff MP¹, Malet H¹, Selisko B¹, Khromykh AA², Canard B¹

¹AFMB : Architecture et fonction des macromolécules biologiques, Département Réplication virale : structure, mécanismes, et drug-design″, UMR6098, CNRS/Université de Provence/Université de la Méditerranée, Parc scientifique et technologique de Luminy, Case 925, 163 avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09 ; ²Sir Albert Sakzewski Virus Research Centre, Royal Children’s Hospital, Brisbane, Queensland 4029, Australia.
<Marie-Pierre. Egloff@afmb.univ-mrs.fr>

Les Flavivirus constituent un genre comprenant de nombreux pathogènes humains, tels que le virus de la Dengue notamment. Grâce aux progrès réalisés dans le domaine de la modélisation moléculaire, la conception et l’optimisation de molécules antivirales repose de plus en plus sur la disponibilité de la structure tridimensionnelle de la protéine d’intérêt. Dans le cas des virus, les cibles principales d’une chimiothérapie sont généralement la polymérase et la (ou les) protéase(s). Alors que les polymérases des Hépacivirus et les Pestivirus ont été caractérisés structuralement, la résolution de la structure de la RNA-polymérase RNA-dépendante d’un membre des Flavivirus constitue depuis plusieurs années un challenge pour de nombreuses équipes au monde.
Grâce à une approche de génomique structurale, nous avons déterminé la structure cristalline d’un domaine polymérase actif de la protéine NS5 du virus de West-Nile à 2,4 Å de résolution. Une autre construction de cette même polymérase a aussi été cristallisée dans une forme cristalline différente et résolue.
Ces deux structures révèlent, au niveau moléculaire, des différences avec les autres polymérases de Flaviviridae (Hépacivirus et de Pestivirus). Ces différences seront corrélées aux caractéristiques enzymatiques spécifiques de chacune. Les bases structurales de l’inhibition de la polymérase de West-Nile par le calcium seront aussi décrites grâce à la résolution de la structure du complexe entre la polymérase et un ion Ca2+. La caractérisation structurale du complexe d’initiation est en cours, ainsi que celle de complexes avec des inhibiteurs caractérisés au laboratoire.

P84
Structures cristallographiques de la polymérase du virus de l’hépatite C : nouvelles données sur le rôle du domaine C-terminal

Bressanelli S¹, LaVoy J^2,3, Hagedorn C², Rey F^3,4

¹Virologie moléculaire et structurale, UMR CNRS-INRA 2472-1157, avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette ; ²Division of Gastroenterology/Hepatology, Department of Medicine, University of Kansas Medical Center, 4035 Delp, MS 1023, Kansas City, KA 66160, USA ; ³Whitehead Rm 215, 615 Michael St., Atlanta, GA 30322, USA ; ⁴Institut Pasteur, 25 rue du Docteur-Roux 75015 Paris
<bressane@vms.cnrs-gif.fr>

Nous avons déterminé la structure cristallographique de la polymérase NS5b du virus de l’hépatite C (HCV) de sous-type 1a, délétée de son ancre membranaire C-terminale (5b1a_dC21). De plus, nous avons obtenu la structure d’un complexe avec le GTP pour 5b1a_dC21. Elle montre notamment la présence au site actif de deux nucléotides et permet la description précise de leurs interactions avec 5b1a_dC21. Ces résultats complètent nos travaux précédents sur une polymérase délétée de 55 résidus C-terminaux (et de génotype 1b, 5b1b_dC55). Ils permettent d’avancer que le connecteur de quelque 35 résidus entre le domaine catalytique et l’ancre membranaire C-terminale (connecteur absent de 5b1b_dC55, mais présent chez 5b1a_dC21), est activement impliqué dans l’induction de la synthèse d’ARN et vraisemblablement dans la transition entre induction et élongation du brin néosynthétisé.

P85
Caractérisation d’antiviraux contre la polymérase du virus de l’hépatite C et étude cristallographique des complexes

Bussetta C, Gruez A, Debarnot C, Barral K, Peyrane F, Alvarez K, Guillemot JC, Romette, JL, Boretto J, Dutartre H, Canard B.

AFMB : Architecture et fonction des macromolecules biologiques, département Réplication virale : structure, mécanismes, et drug-design, UMR6098, CNRS, université de Provence, université de la Méditerranée, parc scientifique et technologique de Luminy, case 925, 163 avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09.
<Cecile. Bussetta@afmb.univ-mrs.fr>

Le virus de l’hépatite C (VHC) constitue un problème majeur de santé publique. En effet, l’infection chronique, qui affecte 3 % de la population mondiale, est à l’origine de la majorité des cirrhoses et cancers du foie. Le traitement actuel est lourd avec de nombreux effets secondaires, mais conduit à une réponse virologique prolongée chez 55 % des patients. Il existe donc de réels espoirs d’éradication de l’infection virale par l’amélioration des traitements disponibles.
Les ARN polymérases ARN dépendantes (ARN-pol) jouent un rôle central dans le processus de réplication et sont donc des cibles privilégiées pour la synthèse de molécules antivirales. Bien que ces protéines aient été caractérisées enzymatiquement et structuralement, le mécanisme de réplication reste mal défini au niveau moléculaire, en particulier parce qu’il n’existe pas de données structurales concernant le complexe de réplication impliquant la polymérase avec tous ses substrats. Notre stratégie pour caractériser de nouveaux inhibiteurs spécifiques de l’ARN-pol du VHC s’articule autour des points suivants : 1) Caractérisation structurale de polymérases issues de VHC sauvages ou mutants (par exemple : mutation de résistance aux traitements, différents génotypes) par cristallographie aux rayons X, tests enzymatiques, modélisation et dynamique moléculaire ; 2) criblage de la chimiothèque du laboratoire à l’aide d’une part d’un test enzymatique mis au point dans notre équipe et d’autre part d’un programme d’arrimage moléculaire, AutoDock ; 3) étude par cristallographie aux rayons X des complexes entre l’ARN-pol du VHC et des inhibiteurs sélectionnés au préalable puis amélioration des molécules les plus intéressantes par synthèse organique et évaluation par enzymologie et cristallographie aux rayons X.
Afin d’atteindre nos objectifs, nous utiliserons la cristallographie aux rayons X, la modélisation et la dynamique moléculaires. Le criblage enzymatique est effectué sur une chimiothèque de plus de 15 000 composés dont le laboratoire s’est doté. Pour le criblage virtuel, nous utilisons le programme d’arrimage moléculaire AutoDock. Les tests d’activité enzymatiques ont été mis au point au sein du laboratoire.
Le criblage enzymatique de la chimiothèque a été effectué et des inhibiteurs ont été sélectionnés. Afin d’identifier le mode de liaison de ces inhibiteurs, nous avons obtenu au sein du laboratoire et de façon reproductible des cristaux de la polymérase et nous avons résolu de sa structure. Des essais de cocristallisation et de trempages sont en cours avec des substrats mais aussi des inhibiteurs. Nous avons construit puis produit des mutants de chacun des sites allostériques susceptibles de fixer ces inhibteurs, afin de valider le mode d’action de ces inhibiteurs. À très court terme, nous pourrons résoudre des structures de complexes entre la protéine native ou mutante et des ligands. Parallèlement, le criblage virtuel de notre chimiothèque réalisé par arrimage moléculaire grâce au programme AutoDock complète les études structurales et mécanistiques. La confrontation des résultats des deux méthodes de criblage nous permettra de valider l’approche virtuelle. L’analyse des premiers résultats, obtenus après criblage virtuel sur un seul des trois sites allostérique a permis de prédire deux des 30 molécules inhibitrices identifiées lors du criblage réel. Des modifications seront apportées sur ces molécules par les chimistes du laboratoire afin d’augmenter leur pouvoir inhibiteur et l’évaluation de celles-ci se fera par des tests in vitro et sur culture de cellules infectées ainsi que par cristallographie.
Notre approche pluridisciplinaire et la mise en place de différents outils nous a permis d’identifier de nouvelles molécules inhibitrices de la polymérase du VHC. Leur caractérisation structurale, chimique et biochimique est en cours et devrait permettre à terme de proposer des inhibiteurs validés pour des études précliniques.

P86
La maturation de la protéine de capside du VHC par la peptidase du peptide signal (SPP) est requise pour le bourgeonnement viral

Ait Goughoulte M, Hourioux C, Brand D, Roingeard P

Inserm Espri 3856, IFR 136, Université François-Rabelais, Tours
<ait_m@med.univ-tours.fr>

La mise au point récente de systèmes de propagation du virus de l’hépatite C (VHC) in vitro représente une avancée très importante pour étudier le cycle infectieux de ce virus dans sa cellule hôte. Cependant, les étapes d’assemblage et de bourgeonnement des virions restent encore très difficiles à visualiser en microscopie électronique avec ces systèmes cellulaires. Le modèle développé par notre équipe [Blanchard et al. 2002], qui consiste à surexprimer les protéines structurales du VHC en cellule de mammifère à l’aide d’un réplicon du virus de la forêt de Semliki (SFV), permet de visualiser l’assemblage et le bourgeonnement de pseudo-particules virales du VHC à la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Ce modèle nous a permis de montrer que la protéine de capside seule, mais pourvue de sa séquence signal transmembranaire C-terminale l’adressant au RE (C191), permettait cet assemblage et ce bourgeonnement en pseudo-particule virale [Blanchard et al. 2003].
Nous avons, par la suite, étudié si la maturation par clivage du domaine C-terminal de la protéine de capside par la peptidase du peptide signal (SPP) constituait un prérequis pour le bourgeonnement de la particule virale. En effet, même si la forme mature de la protéine de capside est détectée dans la particule virale circulante chez les sujets infectés par le VHC ou dans les particules produites par les systèmes de propagation in vitro du VHC, il a été montré que le clivage par la SPP induit le trafic de cette protéine vers les gouttelettes lipidiques. De ce fait, on peut penser que la rétention, au moins transitoire, de la protéine par sa séquence signal pourrait empêcher son trafic vers les gouttelettes lipidiques et favoriser la formation de la particule virale au niveau du RE. Du fait de données conflictuelles sur les mutants de la protéine de capside abolissant le clivage par la SPP [Mc Lauchlan et al. 2002, Okamoto et al. 2004], nous avons réalisé plusieurs mutants de la C191 de génotype 1a pour son domaine transmembranaire (170-PGCSFSIFLLALLSCLTVPASA-191). Dans notre modèle, le mutant V180/LV183-4 n’est pas clivé, tandis que les mutants AL176-7 et ML173-4 sont efficacement clivés par la SPP. En conséquence, ces deux mutants clivés se comportent comme la forme sauvage de la protéine de capside du VHC et migrent vers les gouttelettes lipidiques, au contraire du mutant non clivé. L’expression de tous ces mutants induit des modifications ultrastructurales différentes : le mutant ML173-4 est logiquement similaire à la forme sauvage, tandis que le mutant V180\LV183-4 induit la formation d’un RE dense et multilamellaire dans lequel aucun bourgeonnement de particule virale ne peut être détecté. Curieusement, aucune modification ultrastructurale ne peut être mise en évidence avec le mutant AL176-7. En présence de Z-LL2 ketone, un inhibiteur de la SPP, le clivage de la protéine de capside sauvage est réduit de 50 %, et n’est donc pas complètement aboli. Cependant, les cellules traitées par cet inhibiteur de protéase montrent un RE parfois multilamellaire, à l’image de celui rencontré dans les cellules exprimant le mutant V180/LV183-4, et le bourgeonnement de particules virales à la membrane du RE y est beaucoup moins fréquent.
Notre étude permet de préciser les acides aminés impliqués dans le clivage du domaine C-terminal transmembranaire de la protéine de capside par la SPP, et suggère que ce clivage soit une étape requise pour le bourgeonnement du virus.

P87
L’inhibition des clivages de la protéine de capside du virus de l’hépatite C favorise le bourgeonnement viral

Pene V¹, Vauloup-Fellous C¹, Harper F², Garaud-Aunis J¹, Pichard E², Sogni P^1,3, Pierron G², Rosenberg AR^1,4

¹Inserm, Équipe Avenir Virus de l’hépatite C, Institut Cochin, Paris ; ²CNRS, UPR 1983, Institut André Lwoff, Villejuif ; ³Université Paris-Descartes, Faculté de Médecine, AP-HP, Groupe hospitalier Cochin, Service d’hépatogastro-entérologie, Paris ; ’Université Paris-Descartes, Faculté de Médecine ; AP-HP, Groupe Hospitalier Cochin, Service de Virologie, Paris.
<pene@cochin.inserm.fr>

Les protéines du virus de l’hépatite C (VHC) sont produites par clivages de la polyprotéine codée par le génome viral. La séquence de la protéine de capside (C) est située à l’extrémité N-terminale de la polyprotéine, et se termine par un peptide signal qui adresse la chaîne protéique en cours de traduction à la membrane du réticulum endoplasmique (RE) de la cellule hôte, et induit la translocation dans la lumière de la glycoprotéine d’enveloppe E1 située en aval. Le clivage catalysé à la jonction C-E1 par la signal-peptidase (SP), une protéase cellulaire présente dans la lumière du RE, sépare la glycoprotéine E1 de la forme dite immature de la protéine C, la p23, qui reste ancrée dans la bicouche lipidique du RE par le peptide signal. Le clivage intramembranaire du peptide signal catalysé par la signal peptide-peptidase (SPP), une protéase cellulaire enchâssée dans la bicouche lipidique du RE, libère la forme dite mature de la protéine C, la p21, qui est dépourvue de domaine d’ancrage transmembranaire. C’est cette dernière qui constituerait la capside des particules circulantes chez les malades atteints d’hépatite C. Ce travail a été entrepris afin de déterminer si le clivage par la SP est nécessaire au clivage par la SPP permettant de générer la p21, d’une part, et au bourgeonnement des particules de VHC dans le RE, d’autre part.
Le clivage par la SPP générant la p21 est-il conditionné au clivage préalable par la SP à la jonction C-E1 ? Cette question a fait l’objet d’une controverse. Pour la résoudre, nous avons introduit dans deux séquences de VHC de génotypes différents chacune des deux combinaisons de mutations connues pour inhiber le clivage par la SP à la jonction C-E1. Les polyprotéines mutées ont été testées dans les deux modèles expérimentaux qui avaient abouti aux résultats contradictoires de la littérature : le système d’expression en cellules de mammifères à l’aide d’un réplicon recombinant dérivé du virus de la forêt de Semliki (SFV) et le système d’expression en cellules d’insectes à l’aide d’un baculovirus recombinant. Dans toutes les conditions testées, l’analyse par Western blot à l’aide d’un anticorps dirigé contre la protéine C du VHC a révélé non seulement le précurseur C-E1, mais aussi une espèce minoritaire d’un poids moléculaire apparent comparable à celui de la p21. Cependant cette espèce n’était pas la p21, puisqu’elle était toujours présente lorsque nous avons inhibé le clivage de la protéine C par la SPP, soit par un inhibiteur pharmacologique spécifique de la SPP, soit par des mutations du peptide signal abolissant sa reconnaissance comme substrat par la SPP. Nos résultats ont donc établi que la polyprotéine du VHC se conforme à la règle générale selon laquelle le clivage par la SP dans la lumière du RE est un préalable au clivage intramembranaire par la SPP.
Le bourgeonnement des particules de VHC dans le RE est-il conditionné aux clivages préalables par la SP puis par la SPP permettant de générer la p21 ? Pour aborder cette question, nous avons utilisé le système d’expression par réplicon recombinant dérivé du SFV, qui est à ce jour le seul modèle cellulaire permettant de visualiser en microscopie électronique des évènements de bourgeonnement de pseudo-particules de VHC dans le RE lorsque les clivages générant la p21 ont lieu. Ni l’inhibition du clivage par la SP, ni l’inhibition du clivage par la SPP n’ont empêché l’initiation du bourgeonnement viral, et ce quelle que soit la stratégie d’inhibition utilisée. Au contraire, nous avons observé un plus grand nombre de bourgeons viraux, qui, de plus, semblaient avoir progressé jusqu’à un stade plus tardif du bourgeonnement. Ainsi, la morphogenèse du VHC semble favorisée tant que la protéine C est ancrée dans la bicouche lipidique du RE par le peptide signal.
L’ensemble de ces résultats suggèrent un modèle dans lequel la morphogenèse des particules de VHC serait initiée par un précurseur de la protéine C, et les clivages par la SP puis par la SPP générant la p21 auraient lieu après et/ou pendant le bourgeonnement, peut-être pour convertir la protéine C d’une forme vouée à l’assemblage du virus en une forme vouée à son désassemblage lors de l’entrée dans une nouvelle cellule.

P88
Étude structurale et caractérisation fonctionnelle des domaines macroviraux : vers un rôle dans l’apoptose ?

Egloff MP¹, Malet H¹, Dutartre H¹, Putics A³, Heinonen M², Frangeul A², Gruez A², Ziebuhr J³, Ahola T², Canard B²

¹AFMB : Architecture et fonction des macromolécules biologiques, Département Réplication virale : structure, mécanismes, et drug-design, UMR6098, CNRS, Université de Provence, Université de la Méditerranée, Parc scientifique et technologique de Luminy, Case 925, 163 avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09 ; ²Institute of Biotechnology, PO Box 56 (Viikinkaari 9), 00014 University of Helsinki, Finland ; ³Institute of Virology and Immunology, University of Wuerzburg, Versbacher Str. 7, 97078 Wuerzburg, Germany.
<Marie-Pierre. Egloff@afmb.univ-mrs.fr>

Les domaines X, ou domaines macro, constituent une famille de modules protéiques retrouvés dans tous les règnes du vivant. Ils peuvent constituer une protéine à eux seuls, mais sont aussi souvent associés à d’autres domaines au sein d’histones ou de protéines impliquées dans le métabolisme de la chromatine. L’activité initialement proposée pour les domaines macro est une activité phosphohydrolase de l’ADP-ribose-1»-phosphate, celle-ci étant une molécule produite au cours l’épissage des ARNt et de la maturation des snoRNA (small nucleolar RNAs). Les protéines non structurales de certains virus, tels que les coronavirus, les alphavirus et le virus de l’hépatite E, comportent des domaines macro. La présence d’une activité ADP-ribose-1»-phosphohydrolase au sein de ces virus est très intrigante. Nous avons donc entrepris l’étude structurale et fonctionnelle des domaines macroviraux.
Les domaines macro des virus de l’hépatite E (HEV), de Semliki Forest (SFV) et du SRAS ont été purifiés et leur activité ADP-ribose-1»-phosphohydrolase a été testée. En parallèle, l’étude structurale par cristallographie aux rayons X du domaine macro du virus du SRAS en complexe avec un analogue de substrat potentiel, l’ADP-ribose, a été entreprise. Enfin, la liaison au poly-ADP-ribose synthétisé in vitro par la PARP1 (poly-ADP-ribose polymérase 1) a été testée.
Les domaines macro-étudiés se sont révélés peu actifs ou inactifs en tant que ADP-ribose-1»-phosphohydrolases. La résolution de la structure du domaine X du SRAS à 1,8 Å de résolution en complexe avec l’ADP-ribose a révélé l’existence d’une poche étroite dans laquelle l’ADP-ribose vient se loger. Cette structure a permis de mettre en évidence les résidus importants pour la stabilisation de l’ADP-ribose. Cependant, l’examen de la géométrie de ce site actif putatif, corrélé à une analyse mutationnelle, suggère plutôt que seule l’architecture de domaines macro-ancestraux est utilisée dans les protéines non structurales virales, alors que la fonction initiale d’ADP-ribose-1»-phosphohydrolase a été détournée pour assurer un rôle spécifique profitable au virus.
Par ailleurs, le fait que nous ayons montré que les domaines macro de HEV, SFV et du SRAS peuvent lier le poly-ADP-ribose suggère une fonction pour ces domaines macroviraux, à savoir un nouveau lien entre les voies de signalisation cellulaire, qui font intervenir le poly-ADP ribose, et la réponse cellulaire à l’infection virale.

P89
Études structurales et fonctionnelles du transactivateur Zenra du virus d’Epstein Barr : interaction préférentielle avec l’ADN méthylé et reconnaissance d’heptamères et d’octamères nucléotidiques

Pagniez P², Perrissin M², Baudin F², Petosa C¹, Mueller CW¹, Morand P²

¹European Molecular Biology Laboratory (EMBL), B.P. 181, 38042 Grenoble Cedex 9 ; ²Institut de virologie moléculaire et structurale (IVMS), CNRS-FRE 2854, Université Joseph Fourier, Grenoble
<pagniez@embl-grenobel.fr>

Le virus d’Epstein Barr (EBV) est un herpès virus qui infecte plus de 90 % de la population adulte. Il est à l’origine de la mononucléose infectieuse (MNI) et également impliqué dans des proliférations lymphoïdes telles que le lymphome de Burkitt, le carcinome nasopharyngien ou certains lymphomes T humains. Il présente un cycle d’infection biphasique consistant en une phase de latence et une phase lytique et réplicative. La protéine Zebra de l’EBV est un facteur de transcription indispensable pour l’activation du cycle lytique et la réplication de l’EBV. Elle joue également un rôle dans le blocage du cycle cellulaire en interagissant avec des protéines cellulaires lors de l’infection virale.
Comprendre comment Zebra peut avoir autant de rôles différents était encore impossible à ce jour dû au manque d’informations structurales la concernant. La structure récemment découverte des domaines de dimérisation et de liaison à l’ADN de Zebra, en interaction avec le promoteur d’un gène lytique de l’EBV a considérablement aidé à élucider les propriétés fonctionnelles de ce facteur de transcription. Zebra appartient à la famille des protéines basiques à leucine zipper (bZIP) et comprend trois domaines : le domaine d’activation dans la partie N-terminale de la protéine, le domaine de fixation à l’ADN et le domaine de dimérisation en C-terminal. Ce bZIP possède une aptitude à dimériser en l’absence du motif leucine zipper et a une très large spécificité de séquences nucléotidiques cibles. De plus, il a été démontré que Zebra avait une préférence pour transactiver des promoteurs de l’EBV dans leur état méthylé.
Nous nous intéressons particulièrement à la structure des domaines de dimérisation et de liaison à l’ADN de Zebra en interaction avec un promoteur de gène lytique de l’EBV (ZRE-2) dans son état méthylé où le site reconnu est un heptamère. Les résultats actuels de cristallographie sont très concluants avec des cristaux diffractant à 4 Å. Nous avons également mis en évidence l’aptitude de Zebra à reconnaître un octamère nucléotidique tel que dans le promoteur cellulaire C/EBP et les premiers résultats de cristallogenèse sont encourageants. Enfin, on sait actuellement que Zebra interagit avec de nombreux bZIP cellulaires comme le facteur de transcription cellulaire C/EBPα mais le mécanisme d’interaction est encore incompris. Ayant démontré l’incapacité de Zebra à hétérodimériser avec le facteur C/EBP, notre futur projet consisterait à obtenir la structure tridimensionnelle d’un complexe Zebra-C/EBPα afin d’élucider les implications fonctionnelles d’un tel complexe.

P90
Etude structurale du complexe entre l’UNG du virus d’Epstein-Barr et l’UGI

Geoui T^1,2, Buisson M^1,3, Tarbouriech N^1,2, Burmeister WP^1,2,4

¹Institut de virologie moléculaire et structurale, FRE 2854 CNRS-UJF, BP181, 38042 Grenoble Cedex 9 ; ²EMBL, Grenoble outstation, BP181, 38042 Grenoble Cedex 9 ; ³Laboratoire de virologie, CHU Michallon, BP 217, 38043 Grenoble Cedex 9 ; ⁴Institut universitaire de France, 103, bd Saint-Michel, 75005 Paris
<geoui@embl-grenoble.fr>

La présence d’uracile dans l’ADN peut résulter de l’incorporation erronée de dUTP à la place du dTTP ou de la désamination de la cytosine. Cet événement peut être la source de mutations ; ainsi l’évolution a mis en place des mécanismes de réparation de l’ADN permettant un maintien de l’intégrité de l’information génétique. Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est un Herpès virus humain à ADN double brin, qui peut se répliquer dans les cellules quiescentes dont le métabolisme et donc la production d’enzyme de réparation de l’ADN, est peu actif. Afin de prévenir l’incorporation d’uracile dans son génome, EBV code pour la désoxyuridine 5’-triphosphate pyrophosphatases (dUTPases) et l’uracil-ADN glycosidase. Au cours de cette étude, nous avons produit dans E. coli l’UNG et sa protéine inhibitrice, l’uracil-ADN glycosidase Inhibiteur (UGI) et nous avons formé un complexe entre ces deux protéines, ce qui nous a permis de stabiliser la structure de l’UNG et d’obtenir des cristaux diffractant à 2,3 Å. Nous avons pu résoudre la structure de ce complexe et son analyse confirme que l’UNG possède une large insertion dans la » boucle leucine » qui joue un rôle essentiel dans le mécanisme catalytique de l’UNG. Nous étudions les conséquences de cette insertion sur les interactions avec l’UGI et les différences avec les structures d’autres complexes d’UNG/UGI publiés. Nous avons également caractérisé l’UNG sur le plan enzymatique et nous comparons les valeurs obtenues avec celles d’UNG d’autres espèces.

P91
Structure cristalline d’un domaine crucial de la syncytin humain 2, un gène de protéine de fusion de rétrovirus endogène capturé par les primates il y a 40 millions d’années

Varela PF¹, Renard M², Letzelter C², Duquerroy S¹, Rey FA¹, Heidmann T²

¹Retrovirus endogènes et éléments rétroïdes des eucaryotes supérieurs, UMR 8122 CNRS, Institut Gustave-Roussy, 94805 Villejuif ; ²Virologie moléculaire et structurale, UMR 2472 CNRS, 91198 Gif-sur-Yvette
<pfvarela@vms.cnrs-gif.fr>

L’HERV-FRD est un rétrovirus endogène humain qui est entré dans le génome humain il y a 40 millions d’années. Son gène d’enveloppe, syncytin-2, a été détourné par un hôte ancestral pour réaliser un rôle dans les morphogenèses du placenta, le plus probablement à cause de sa propriété de fusion. Il a été maintenu dans un état fonctionnel dans toutes les branches de primates comme un gène cellulaire bona fide, soumis à un taux de mutation très bas en comparaison à des génomes de rétrovirus infectieux. La structure de la protéine syncytin-2 ainsi fournit une bonne vue de la plus vieille enveloppe rétrovirale de mammifères.
Ici, nous rapportons la structure cristalline d’un fragment central de son ectodomaine fossile. Ce domaine a été produit comme matériel soluble dans le cytoplasme d’Escherichia coli, et purifié par deux étapes de chromatographie d’échange des ions. Une étape supplémentaire de chromatographie de tamis moléculaire a montré que plus de 95 % de ce domaine central du syncytin-2 était dans une forme trimérique. Cette protéine a été cristallisée par la méthode de diffusion de vapeur. Des cristaux tétragonaux ont été obtenus. Ces cristaux diffractent à 1,6 Å de résolution utilisant une source de rayon X synchrotron. La structure du domaine central de la syncytin-2 a été déterminée par remplacement moléculaire avec les coordonnées du domaine correspondant du virus de leucémie murine de Moloney (MoMLV).
La structure obtenue permet une superposition remarquable avec les structures des domaines correspondants dans des rétrovirus infectieux actuels, tels que le MoMLV ou le virus lymphotropique humain de cellules T (HTLV-I), en dépit de plus de 60 % de divergence de séquence. Ces résultats suggèrent l’existence d’une solution structurale unique choisie par ces protéines pour leur fonction de fusion.

P92
La co-infection de cellules permissives pour le VIH et le HSV2 conduit à la réplication des deux virus sans produire de particules VIH pseudo-typées par des glycoprotéines HSV2

Legoff J¹, Bouhlal H¹, Lecerf M¹, Klein C², Hocini H¹, Si-Mohamed A¹, Muggeridge M³, Belec L¹

¹Université Paris V, Équipe immunité et biothérapie muqueuse, Unité Inserm Internationale U743 (immunologie humaine), Centre de recherches biomédicales des Cordeliers, Laboratoire de Virologie, Hôpital européen Georges-Pompidou, Paris ; ²Service commun d’imagerie cellulaire et de cytométrie, Inserm IFR58, Centre de recherches biomédicales des Cordeliers, Paris ; ³Department of Microbiology and Immunology, Louisiana State University Health Sciences Center, Shreveport, LA 71130, USA
<jerome. le-goff@egp.ap-hop-paris.fr>

Le virus herpes simplex type 2 (HSV2) est un cofacteur majeur de l’acquisition sexuelle de l’infection VIH et est suspecté de faciliter la transmission génitale du VIH. Les arguments biologiques en faveur d’un risque accru de transmission du VIH par des sécrétions génitales co-infectées par le HSV2 incluent principalement la corrélation observée in vivo entre les quantités d’ARN VIH1 et d’ADN HSV2 dans les sécrétions cervicovaginales, l’observation de charges virales de VIH élevées rapportées dans des ulcérations herpétiques masculines, et la transactivation de la région LTR par des protéines précoces de l’herpès. Une autre hypothèse serait la formation de particules de VIH pseudo-typées par le HSV2. Les résultats de deux équipes indépendantes ont suggéré que le VIH pouvait former des particules virales hybrides avec le HSV1, permettant l’infection productive de cellules normalement résistantes à l’infection à VIH. La formation de tels pseudo-types entre le VIH et le HSV2 pourrait avoir des conséquences majeures sur la facilitation de la transmission génitale.
Nous avons analysé dans cette étude si le VIH et le HSV2 pouvaient former des virions VIH pseudo-typées par des glycoprotéines d’enveloppe du HSV2. Nous avons, sur-infecté des cellules lymphocytaires CEM et des cellules épithéliales HT29 et P4P infectées par le VIH avec le HSV2 ou transfecté des P4P-VIH + avec des plasmides codant pour gB2 et gD2, deux glycoprotéines HSV2 nécessaires à la fusion de l’herpès avec la membrane cellulaire. Nous avons évalué les capacités des surnageants viraux produits à induire une infection productive du VIH dans les cellules Vero non permissives au VIH, en déterminant dans le surnageant la quantité d’antigène p24 et d’ARN VIH et en détectant la présence d’ADN proviral dans le culot cellulaire des Vero. Nous avons ensuite analysé en microscopie confocale la colocalisation des protéines gB2 et gD2 avec la gp160 dans les cellules co-infectées et VIH + transfectées. Enfin nous avons évalué sur les particules virales produites l’incorporation des glycoprotéines gB2 et gD2 dans l’enveloppe du VIH à l’aide de tests d’immunocapture virale avec des microbilles magnétiques (μMACS™ Streptavidin MicroBeads, Miltenyi Biotec, Auburn, CA) sensibilisées avec des anticorps anti-CD44 pour capturer les particules VIH et anti-gB (HSV) ou anti-gD (HSV) pour capturer les virions portant les glycoprotéines gB2 ou gD2.
Nos résultats montrent que des cellules CEM, HT29 et P4P co-infectées peuvent corépliquer les deux virus et que les glycoprotéines gB2 et gD2 peuvent se colocaliser à la membrane plasmique aussi bien dans les cellules co-infectées et transfectées. Cependant aucun des surnageants produits n’a permis d’observer une infection VIH des cellules Vero. Le test d’immunocapture a permis de capturer spécifiquement des virions VIH1 produits par des CEM et P4P co-infectées et les P4P-VIH + transfectées par les plasmides codant la gB2 ou la gD2 avec les anticorps anti-CD44, et de capturer des virions HSV2 produits par des CEM et P4P co-infectées avec les anticorps anti-gB et anti-gD. En revanche aucune détection d’ARN VIH1 n’a été observée sur les populations virales produites sur les cellules CEM et P4P co-infectées et les P4P VIH + transfectées capturées avec les anticorps anti-gB et anti-gD.
Nos résultats suggèrent l’absence de formation de pseudo-types entre le VIH et le HSV2 et écartent cette hypothèse des mécanismes d’interactions entre le VIH et le HSV2 dans les sécrétions génitales co-infectées.

P93
Étude de l’implication de la boucle cytosolique des protéines d’enveloppe HBV dans la maturation d’HBV et d’HDV et dans l’infectiosité

Blanchet M, Sureau C

INTS, Laboratoire de virologie moléculaire, 6 rue Alexandre-Cabanel, 75015 Paris
<mblanchet@ints.fr>

Les virions HBV sont composés d’un ADN inclus dans une capside recouverte de trois protéines d’enveloppe virales, grande (L), moyenne (M), et petite (S). Elles possèdent une extrémité carboxy-terminale commune. La protéine S est formée du seul domaine S, tandis que M est formée des domaines préS2 et S, et L des domaines PréS1, PréS2 et S. Seules les protéines L et S sont indispensables à la morphogenèse des virions HBV matures. La protéine S constitue l’élément moteur du bourgeonnement, et L est nécessaire pour le recrutement des capsides HBV lors du bourgeonnement. L et S sont par ailleurs indispensables à l’infectiosité des virions HBV. Ces protéines d’enveloppe sont également utilisées par le virus de l’hépatite Delta (HDV), un agent sous-viral, satellite occasionnel d’HBV. HDV possède un génome à ARN capable de se répliquer dans un hépatocyte humain en l’absence d’HBV. Cependant, la présence de protéines d’enveloppe d’HBV est requise pour la maturation et l’infectiosité d’HDV.
Nous présentons ici une étude systématique et exhaustive de l’impact de mutations effectuées dans la « boucle cytosolique », sur la morphogenèse et l’infectiosité d’HBV et d’HDV. Cette boucle, située dans le domaine S des trois protéines d’enveloppe, est disposée à la face cytosolique du réticulum endoplasmique. Des mutations permissives pour la sécrétion de particules sous-virales HBV ont été réalisées sur l’intégralité de cette boucle, avec des substitutions ponctuelles sur les régions ne tolérant pas de délétions plus larges. Ces mutants ont été testés pour leurs impacts sur la maturation des virions HBV et HDV et sur l’infectiosité.
Nous montrons que : 1) Les mutations localisées sur la boucle cytosolique n’induisent pas d’effet délétère majeur sur la morphogenèse et l’infectiosité des virions HBV et HDV ; 2) La délétion des résidus 24 à 28 induit un effet délétère mineur sur la sécrétion des virions HBV et HDV ; 3) La mutation de la proline en position 29 en alanine semble délétère pour la synthèse et/ou la stabilité de la grande protéine d’enveloppe HBV. Cette mutation conduit logiquement à l’abolition de la synthèse et de la sécrétion d’HBV, du fait de la nécessité des domaines préS1 et préS2 de la L pour la morphogenèse des virions HBV. Les virions HDV portant cette mutation sont quant à eux correctement secrétés, avec une efficacité cependant plus faible que dans le cas du sauvage ; 4) L’ensemble des mutations citées ci-dessus n’interfèrent pas avec l’infectiosité des virions HDV.

P94
Étude structurale en microscopie électronique de la capside de l’adénovirus humain de type 5

Fabry CMS¹, Rosa-Calatrava M³, Conway JFC4, Zubieta C², Cusack S², Ruigrok RWH¹, Schoehn G¹

¹Institut de virologie moléculaire et structurale, FRE 2854, CNRS, Université Joseph-Fourier, Grenoble Cedex 2EMBL, Grenoble Outstation, Grenoble Cedex ; ³Laboratoire de virologie et pathogenèse Virale, RTH Laennec, Lyon ; ⁴University of Pittsburgh, Pittsburgh, USA.
<fabry@embl-grenoble.fr>

Les adénovirus sont des virus non enveloppés à ADN double brin. Ils en existent plus de 50 sérotypes chez l’homme. Ces virus sont la cause de maladies bénignes comme les gastro-entérites ou les conjonctivites. Leur capside forme un icosaèdre pseudo T = 25. Elle est composée de 3 protéines structurales majeures : l’hexon, une protéine trimérique possédant une base hexagonale et le penton formé par l’association non covalente de la base du penton (pentamère) et de la fibre (trimère). La base du penton projette la fibre à partir des 12 sommets de l’icosaèdre alors que le reste de la capside est formé par les hexons. Des protéines mineures viennent stabiliser le virus vers l’intérieur ou vers l’extérieur à des positions spécifiques (protéines IIIa, IX, VI et VIII).
À l’heure actuelle, les adénovirus sont largement utilisés comme vecteur de transfert de gènes dans les protocoles de thérapie génique et de thérapie anticancer. Leur utilisation en tant qu’agent thérapeutique chez l’homme est cependant problématique. En effet, une injection d’adénovirus provoque une réponse immune massive contre les protéines de capside. De plus la période d’expression du transgène est limitée à cause de l’absence d’intégration du transgène dans le génome de l’hôte. Il est aussi difficile de cibler certains tissus ou types cellulaires. Certains problèmes peuvent être dépassés en modifiant une ou plusieurs protéines de la capside mais une connaissance détaillée de la structure de l’adénovirus est nécessaire.
Nous avons déterminé la structure de la capside de l’adénovirus humain de type 5 à 10 Å de résolution par cryomicroscopie électronique ainsi que celle d’un virus mutant ne possédant pas les protéines IX et IIIa. Par la suite, nous avons généré un modèle quasi atomique de la capside en replaçant les structures atomiques de l’hexon de l’adénovirus de type 5 et de la base du penton de l’adénovirus de type 2 à l’intérieur de la carte à 10 Å obtenue en microscopie électronique. Ce modèle nous a permis de définir les zones d’interactions entre les différents capsomères avec une résolution de l’ordre de quelques acides aminés. Ensuite, par comparaison entre le modèle quasi atomique et les reconstructions tridimensionnelles, nous avons clairement défini la position et le rôle de certaines protéines mineures au sein de la capside. Les protéines IX et IIIa stabilisent le virion de l’extérieur alors que la protéine mineure VIII forme, sur la face interne de la capside, un réseau organisé selon la symétrie icosaédrique T = 2.
. Fabry CMS, Rosa-Calatrava M, Conway JF, Zubieta C, Cusack S, Ruigrok RWH, et al. A quasi-atomic model of human adenovirus type 5 capsid. EMBO J 2005 ; 24 : 1645-54.

P95
Etude du mécanisme moléculaire de translocation du génome du bactériophage SPP1, un virus à ADN double brin

Cuervo A¹, Oliveira L¹, Vaney MC¹, Antson AA², Tavares P¹

¹Unité de virologie moléculaire et structurale, bât.14b, CNRS, 91198 Gif-su-Yvette ; ²Structural Biology Laboratory, Department of Chemistry, University of York, Helsington, York YO105YW, UK
<cuervo@vms.cnrs-gif.fr>

Les virus bactériens (bactériophages) à queue et les virus eucaryotes herpès présentent des mécanismes similaires de construction de la nucléocapside virale et d’encapsidation du génome. Lors de leur assemblage, le génome viral est encapsidé à travers un pore portal situé à un sommet d’une procapside préalablement formée. La machine de translocation qui empaquette l’ADN est composée d’une ATPase (terminase) et de la protéine portale, organisée en 12 sous-unités autour du pore portale. L’objectif de ce travail est d’étudier le rôle de la protéine portale (gp6) pendant le processus d’encapsidation de l’ADN dans le bactériophage SPP1. Plusieurs études suggèrent que la protéine portale serait impliquée dans la translocation de l’ADN, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents ne sont pas connus.
La structure de gp6 a été déterminée. Elle suggère que des mouvements d’hélices alpha conduiraient aux changements conformationnels nécessaires à la translocation de l’ADN viral. Nous avons ainsi conçu par modélisation moléculaire des mutations qui conduiraient à la formation de ponts disulfures qui immobiliseraient les hélices. La création de ces mutants par génie génétique a montré qu’ils n’affectent pas l’activité biologique de la protéine in vivo, dans l’environnement réducteur du cytoplasme. La formation de ponts disulfure a été observée dans des conditions oxydantes, et ces pontages ont pu être renversés en présence d’un agent réducteur. Des expériences d’encapsidation in vitro réalisées dans des environnements oxydants et réducteurs ont montré une diminution de l’activité d’encapsidation lorsque les ponts disulfure sont formés pour certains mutants.
Ces résultats supportent fortement notre hypothèse, en indiquant que l’immobilisation des hélices de la protéine portale affecte l’encapsidation de l’ADN.

Structure et morphogénèse virale 2

Vendredi 21 avril 2006, 14 h à 15 h 15

Communications orales O96 à O102
Communications affichées P79 à P95

O96
Étude structurale du complexe nucléoproteine-ARN du virus de la rage

Albertini AAV¹, WernimontT AK², Tadeusz M², Ravelli RBG², Clapier CR², Schoehn G¹, Weissenhorn W², Ruigrok RWH¹

¹Institut de virologie moléculaire et structurale, FRE 2854 Université Joseph-Fourier, CNRS, BP181, 38042 Grenoble ; ²European Molecular Biology Laboratory (EMBL), BP181, 38042 Grenoble
<alberti@embl-grenoble.fr>

Le virus de la rage est un virus à ARN négatif non segmenté appartenant à l’ordre des Mononegavirales. La rage se transmet accidentellement à l’homme par morsure d’un chien infecté et constitue un sérieux problème dans les pays en voie de développement à cause de l’absence de campagnes de vaccination massives. Elle cause des encéphalites dont l’issue est fatale à 100 % et contre lesquelles il n’existe aucun traitement. La connaissance de la structure détaillée des protéines virales d’un virus comme la rage est indispensable pour mettre au point de molécules ayant une activité antivirale. Le génome du virus de la rage est recouvert de N ; l’association de l’ARN viral avec les sous-unités de N forme un complexe hélicoïdal appelé nucléocapside. La nucléocapside associée à la polymérase virale L et à la phosphoprotéine P (son cofacteur) constitue l’unité infectieuse de ce virus. L’ARN viral n’est jamais nu lors du cycle de multiplication, le complexe ARN-N sert de matrice pour la transcription et la réplication virale. Lorsque N de la rage est exprimée en cellules d’insectes, elle lie de manière non spécifique des ARN cellulaires. Lorsque la nucléoprotéine recombinante fixe un ARNm, de très longs complexes hélicoïdaux et flexibles sont obtenus ; si N lie un ARN de plus petite taille (ARNt), des complexes en forme d’anneaux sont formés. Ces anneaux, composés de 9 à 13 sous-unités de N et d’un brin d’ARN, sont peu flexibles et constituent des objets idéaux pour la réalisation d’études structurales. Une étape d’électrophorèse préparative a permis la séparation de ces anneaux. Nous sommes ensuite parvenus à cristalliser les 11-mers. Nous vous présentons la structure cristallographique d’un complexe nucléoprotéine-ARN à une résolution de 3,5 Å. Il s’agit d’une structure en forme d’anneau avec 11 nucléoprotéines et un ARN de 99 bases. N est composée de deux domaines, qui peuvent être comparés à deux mâchoires ; ces mâchoires maintiennent fortement l’ARN et l’isolent de l’environnement. Nous pensons que cette structure représente le complexe ARN-N dans une conformation inactive en réplication. La polymérisation de N se réalise grâce à des échanges de domaines entre les monomères. Ces domaines (sortes de charnières flexibles) permettent la formation de complexes ARN-N de différentes stœchiométries : de l’anneau à 9 sous unités de N à une nucléocapside composées de plusieurs milliers de N et de diamètre plus grand. N enveloppe très étroitement l’ARN, donc pour devenir accessible à la polymérase virale nous pensons que l’ARN doit se dissocier de sa nucléoprotéine. Il s’agit ici de la première structure à haute résolution de nucléoprotéine en complexe avec un ARN donnant des explications nouvelles sur les mécanismes réplicatifs et transcriptionnels des virus à ARN négatifs. Il est également fort probable que les virus à ARN négatifs d’autres familles comme les filovirus (Ebola) et les paramyxovirus (rougeole) utilisent un mécanisme similaire pour s’assembler en une nucléocapside de symétrie hélicoïdale.

O97
Étude génétique des interactions fonctionnelles entre sous-unités du complexe polymérase des virus grippaux de type A

Dos Santos Afonso E, van der Werf S, Naffakh N

Unité de génétique moléculaire des virus respiratoires, URA CNRS 1966, Institut Pasteur, Paris
<edsantos@pasteur.fr>

Le génome des virus grippaux de type A est constitué de 8 segments d’ARN monocaténaire de polarité négative. Dans la particule virale, chaque segment d’ARN viral (ARNv) est encapsidé par la nucléoprotéine NP et associé au complexe polymérase formé des sous-unités PB1, PB2 et PA. Le tout forme une ribonucléoprotéine (RNP) qui constitue l’unité de transcription et de réplication du génome viral. Des interactions physiques entre la protéine PB1 et chacune des protéines PB2 et PA d’une part, et entre la protéine NP et chacune des protéines PB1 et PB2 d’autre part, ont été mises en évidence par des expériences de co-immunoprécipitation et de double hybride. Mais les interactions fonctionnelles entre ces protéines et le rôle précis de chacune des sous-unités du complexe polymérase dans les processus de transcription et de réplication, restent largement méconnus.
Nous disposons, pour les virus grippaux humains A/WSN/33 (WSN) et A/PR/8/34 (PR8), de systèmes de génétique inverse qui reposent sur la transfection de plasmides permettant l’expression, puis la transcription et la réplication des 8 ARNv. Nous avons observé qu’un virus grippal recombinant dont le segment PB2 dérive de WSN et les autres segments dérivent du virus PR8 (virus PR8/WSN) présente des titres inférieurs d’environ 3 log à ceux des virus PR8 et WSN sauvages, et forme des plages de lyse de très petite taille. Afin de déterminer si le défaut de multiplication du virus PR8/WSN était lié à un défaut d’activité du complexe polymérase, nous avons utilisé un système d’expression transitoire permettant de reconstituer des RNP in vivo et de mesurer l’efficacité de transcription/réplication d’un ARN pseudo-viral porteur d’un gène rapporteur. Les RNP constituées de la protéine PB2 de WSN en association avec les protéines PB1, PA et NP de PR8 présentent une activité de transcription/réplication réduite d’un log par rapport aux RNP intégralement dérivées de PR8. L’ensemble de ces observations témoigne d’une incompatibilité entre la protéine PB2 de WSN et les protéines PB1, PA et NP de PR8, en dépit d’une homologie de près de 97 % entre les protéines PB2 de WSN et de PR8.
Après cinq passages en série du virus PR8/WSN sur des cellules MDCK, nous avons isolé un virus révertant qui présente une capacité de multiplication proche de celle du virus PR8 (revPR8/WSN). Le séquençage de produits de RT-PCR correspondant aux segments PB1, PB2, PA et NP du virus revPR8/WSN a révélé la présence de mutations dans la séquence en acides aminés des protéines PB1, PB2 et PA. Nous évaluons la contribution de chacune de ces mutations à la réversion phénotypique en les testant, individuellement ou en combinaison, dans le système de reconstitution transitoire de RNPs et dans le système de génétique inverse. Leur effet sur l’activité de transcription et/ou de réplication du complexe polymérase sera examiné plus précisément en mesurant par RT-PCR quantitative les taux de synthèse d’ARNv, d’ARNc et d’ARNm correspondant au segment NP, au cours du cycle de multiplication virale. Cette étude devrait déboucher sur une meilleure compréhension des interactions fonctionnelles entre sous-unités du complexe polymérase.

O98
Structure à 2,6 Å de résolution et mécanisme enzymatique de l’endonucléase nsp15 du coronavirus du SRAS

Ricagno S, Egloff MP, Canard B

AFMB : Architecture et fonction des macromolécules biologiques, Département Réplication virale : structure, mécanismes, et drug-design, UMR6098, CNRS, Université de Provence, Université de la Méditerranée, Parc scientifique et technologique de Luminy, Case 925, 163 avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09
<Bruno.Canard@afmb.univ-mrs.fr>

Le coronavirus responsable du syndrome respiratoire sévère aigu (SRAS) est l’agent étiologique de pneumonie atypique grave. Un gros effort a été entrepris dans le monde pour caractériser ce virus, et en particulier sa machinerie réplicative qui est d’une complexité élevée comparée à celle de tous les autres virus à ARN. Il a été montré récemment que la protéine nsp15 a une activité endoribonucléase, dont le rôle est inconnu, mais essentiel pour le déroulement correct du cycle viral.
Nous avons entrepris la caractérisation structurale et mécanistique de cette protéine pour essayer de comprendre que peut faire une telle enzyme dans un complexe de réplication viral. Cette protéine n’a aucun homologue connu hors des coronavirus, ce qui en fait une cible attractive pour le développement de molécules antivirales. Nous avons résolu la structure cristallographique de nsp15 à 2,6 Å de résolution, et élucidé son mécanisme d’action. Nsp15 a été exprimée avec un His-tag N-terminal, produite, et purifiée dans E. coli. La purification a été réalisée en deux étapes, et la protéine cristallisée à partir d’une concentration de 2 mg/ml dans du PEG, ce qui permetra la formation de complexes binaires ultérieurs. Les cristaux sont cubiques (0,03 mm !) et appartiennent au groupe d’espace P4(3)32. La structure a été résolue par la technique SAD utilisant une protéine séléniée. Nsp15 cristallise comme un hexamère, conformément aux études biochimiques préliminaires. Le monomère est formé de trois domaines indépendants. Un court domaine N-terminal consiste en deux hélices empilées sur un feuillet bêta de trois brins antiparallèles. Le domaine central est très riche en régions enroulées (88 aa sur 120). Le domaine C-terminal a un cœur en hélices alphas flanquées de deux feuillets bêtas. Il existe un sillon entre les deux feuillets, et c’est le site actif présumé.
La recherche d’homologie dans la PDB s’est révélée infructueuse pour le monomère, le domaine C-terminal, et le N-terminal + domaine central. L’ensemble est un dimère de trimères, dont la forme globale est celle d’un tore, présentant un canal central. Ce canal est trop étroit (15 Å) et trop chargé négativement pour encercler un ARN.
De précédents travaux ont souligné certains aa (His 249, His234, Lys 238) cruciaux pour l’activité endoRNAse, mais pas la stabilité en solution : ils sont localisés dans un sillon chargé positivement dans la partie C-terminale. Bien que nsp15 n’ait pas d’homologie structurale avec d’autres RNAses, deux histidines et une lysine catalytiques de la RNAse A se superposent très bien avec His 249, His234 and Lys 238 de Nsp15, tout comme deux acides aminés secondaires Thr et Phe. Nous proposons que nsp15 agisse suivant un mécanisme similaire à celui de la RNase A, dans lequel la lysine stabilise un intermédiaire phosphate pentacovalent. Cette hypothèse est en cours de vérification à l’aide de complexes cristallographiques binaires.
Nsp15 représente donc un autre exemple fascinant d’évolution convergente de deux enzymes de repliement, taille, phylogénies différentes, vers un mécanisme commun.

O99
Structure à 2 Å de résolution de l’ARN polymérase RNA dépendante du virus de coxsackie B3

Gruez A, Selisko B, Coutard B, Jabafi I, Egloff MP, Canard B

AFMB : Architecture et fonction des macromolécules biologiques, Département Réplication virale : structure, mécanismes, et drug-design, UMR6098, CNRS, Université de Provence, Université de la Méditerranée, Parc scientifique et technologique de Luminy, Case 925, 163 avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09 Arnaud.
Gruez@afmb.univ-mrs.fr

Les virus de coxsackie qui sont transmis par la voie féco-orale et la voie respiratoire infectent le tractus digestif et le système nerveux. La plupart des infections restent asymptomatiques, mais il a été montré que ces virus sont aussi responsables de forme sévère de myocardites, d’encéphalite grave et de la moitié des maladies cardiaques infectieuses. Des cas plus rares, provoquent des méningites souvent chez les enfants, ou du diabète. Chaque année, 5 à 10 millions de cas sont dépistés aux USA, parmi lesquels 1 % à 4 % des cas sont associés à des maladies cardiovasculaires. Le virus de coxsackie B3 est la cause de plus de 50 % des maladies cardiaques liées à une infection virale. À l’heure actuelle, il n’existe au vaccin, ni traitement antiviral contre ce virus. À terme l’objectif est de concevoir de manière rationnelle des inhibiteurs de l’enzyme. À plus court terme, notre objectif est de comprendre les mécanismes de la réplication virale, à savoir l’étape d’initiation et l’étape d’élongation.
Dans ce contexte, nous avons entrepris l’étude structurale et fonctionnelle de l’ARN polymérase ARN dépendante (CVP3pol) par les méthodes de cristallographie aux rayons X. La protéine a été exprimée et purifiée à partir d’E. coli, et sa structure résolue par remplacement moléculaire.
La structure de CVP3pol résolue par cristallographie des rayons X à haute résolution (2 Å), montre le repliement caractéristique des polymérases virales, en trois domaines : pouce, paume et doigts. Au site catalytique, la comparaison des acides aminés montre de subtiles différences avec la polymérase du virus de la poliomyélite. L’obtention de cristaux diffractant à haute résolution, ouvre la voie à une étude structurale détaillée de la protéine avec les différents partenaires impliqués dans la polymérisation de l’ARN et donc de la réplication virale. Dans ce cadre on distinguera schématiquement deux étapes. La première appelée l’initiation qui nécessite : un peptide servant d’amorce à la transcription (VpG), une matrice ARN, des nucléotides et des ions. La seconde étape communément appelée étape d’élongation qui nécessite uniquement la matrice et les nucléotides. L’analyse détaillée des structures de l’enzyme libre et complexée à des ligands sera présentée et discutée. Enfin les données structurales et biochimiques permettent d’envisager la conception rationnelle d’inhibiteurs de la réplication du virus de coxsackie par criblage de chimiothèques in vitro et in silico.

O100
Génomique structurale du virus d’Epstein-Barr

Tarbouriech N^1,2, Buisson M^1,3, Geoui G^1,2, Cusack S², Burmeister WP^1,2,4

¹Institut de virologie moléculaire et structurale, FRE 2854 CNRS-UJF, BP181, 38042 Grenoble Cedex 9 ; ²EMBL, Grenoble outstation, BP181, 38042 Grenoble Cedex 9 ; ³Laboratoire de virologie, CHU Michallon, BP217, 38043 Grenoble Cedex 9 ; ⁴Institut universitaire de France, 103, bd Saint-Michel, 75005 Paris.
<wpb@embl-grenoble.fr>

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est la cause de la mononucléose infectieuse ainsi qu’il est associé aux nombreux cancers humains : carcinome nasopharyngé (NPC), lymphome de Burkitt, lymphome hodgkinien et carcinome gastrique (GC) ainsi qu’au syndrome lymphoprolifératif chez des sujets immunodéprimés. Il code pour 86 protéines, qui sont les cibles de notre projet de génomique structurale. Après une mise à jour de l’annotation du génome 23 cadres de lecture ont été choisis pour une expression en E. coli, en choisissant les cibles pour une activité enzymatique et par rapport à leur degré de structure tridimensionnelle prédit. L’absence d’expression et le manque de solubilité des protéines se sont avérés comme obstacles majeurs. Il n’était pas possible de surmonter ces problèmes par une modification des constructions utilisées, des changements de la température d’expression ou de souche de bactéries ainsi par des techniques de renaturation. Dans 5 cas, il était possible de cristalliser des protéines solubles en utilisant un robot avec des nanogouttes. Quatre de ces structures ont pu être résolues par cristallographie aux rayons x. Les structures de la protéase, de la dUTPase, de l’uracil-ADN-glycosidase et de BARF1 ont été déterminées.
Le succès du projet dépendait plutôt d’un traitement individuel que de protocoles standardisés. Afin de surmonter les problèmes d’expression solubles nous nous sommes maintenant tournés vers une expression dans des cellules d’insectes en utilisant des baculovirus et nous travaillons sur les composantes de la machine de réplication d’EBV.

Diagnostic en virologie

Vendredi 21 avril 2006, 14 h à 15 h 15

Communications orales O101 à O105
Communications affichées P106 à P124

O101
Dépistage des néphropathies à virus BK en transplantation rénale : quel suivi virologique ?

Bressollette-Bodin C¹, Hourmant M², Renaudin K³, Imbert-Marcille BM¹, Coste-Burel M¹

¹JE 2437 Interactions Hote-Microorganisme, UFR Pharmacie, IFR26 et Laboratoire de Virologie, CHU Nantes ; ²Institut de transplantation et de recherche en transplantation (ITERT), CHU Nantes ; ³Laboratoire d’anatomo-pathologie A, CHU Nantes
<celine.bressollette@chu-nantes.fr>

L’augmentation de la prévalence des néphropathies associées au polyomavirus BK en transplantation rénale a été à l’origine du développement de nouveaux outils de dépistage et de suivi des patients présentant une réactivation virale. Au cours d’une étude prospective, nous avons mis en évidence la fréquence de survenue des réactivations du virus BK dans les 12 mois suivant une transplantation rénale, définies par la positivité de l’ADNurie (57 % des patients) et/ou de l’ADNémie (29 % des patients). Parmi les 104 patients inclus dans cette étude, 18 (17 %) étaient toujours positifs en ADNurie 12 mois après transplantation, avec pour 5 d’entre eux une ADNémie positive (5 %). Cependant, aucun cas de néphropathie virale n’a été diagnostiqué au cours de cette première année [Bressollette-Bodin et al., Am J Transplant, 2005]. À la suite de cette étude, notre objectif était d’évaluer la fréquence de survenue des néphropathies à virus BK dans cette cohorte au-delà de la première année suivant la transplantation.
L’ADNurie et l’ADNémie BK virus sont détectées et quantifiées par une technique de PCR en temps réel développée au laboratoire, qui amplifie un segment situé au sein de la région précoce du génome, et dont la sensibilité est de 10 copies/réaction. Les patients dont l’ADNurie et l’ADNémie étaient négatives au 12^e mois post-transplantation, n’ont pas été suivis de façon systématique. Le génome viral a été recherché dans les urines et le sang en cas de dégradation de la fonction rénale sans étiologie retrouvée. Aucun cas de néphropathie à virus BK n’a été diagnostiqué parmi ces patients. Chez les 18 patients dont l’ADNurie et/ou l’ADNémie étaient positives à 12 mois, le suivi virologique a permis de détecter à l’issue de la deuxième année la persistance d’une ADNurie positive chez 9 patients, associée à une ADNémie positive chez 6 d’entre eux. Tous avaient un traitement immunosuppresseur associant tacrolimus et mycophénolate mofetil. Pour 5 de ces patients, la recherche de decoy cells associée à un marquage anti-BK virus s’est révélée positive. Pour un de ces 5 patients, décédé d’un lymphome cérébral, le diagnostic histologique de néphropathie à virus BK, fortement suspecté, n’a pas pu être confirmé. Les résultats histologiques de la ponction-biopsie rénale ont permis de confirmer la néphropathie à virus BK chez 3 patients (respectivement à 24, 28 et 36 mois post-transplantation). Pour deux d’entre eux, la négativation de l’ADNémie associée à une diminution de l’ADNurie et à une amélioration de la fonction rénale a été obtenue après diminution de l’immunosuppression. Le troisième a dû subir une transplantectomie en raison du développement d’une fibrose majeure du greffon.
En ne considérant que les néphropathies histologiquement prouvées, la fréquence de survenue des néphropathies à virus BK est d’au moins 2,8 % dans cette étude.
Au total, cette fréquence est proche de celle rapportée dans la littérature, bien que le délai de survenue après la transplantation semble plus long (au moins 24 mois post-transplantation). Ces résultats nous ont conduits à prévoir un dépistage systématique de l’ADNurie et de l’ADNémie BK virus à 1 et 2 ans suivant la transplantation rénale. Les patients positifs sont suivis tous les 3 mois et la persistance d’une infection active à virus BK au bout de 6 mois peut conduire à proposer une biopsie.

O102
Comparaison des méthodes conventionnelles et des outils moléculaires pour la détection des virus respiratoires chez les enfants entrant aux urgences pédiatriques

Perrot-Simon S, Vabret A, Dina J, Legrand L, Brouard J, Cuvillon D, Gouarin S, Petit J, Freymuth F

Laboratoire de virologie humaine et moléculaire et Service de pédiatrie, CHU, Caen
<freymuth-f@chu-caen.fr>

L’objectif de l’étude était de comparer les performances de trois RT-PCR multiplex permettant la recherche simultanée de 14 virus respiratoires à celles des méthodes conventionnelles d’immunofluorescence (IF) et de culture sur 449 aspirations nasales (AN) d’enfants entrant aux urgences pédiatriques du CHU de Caen entre le 1^er novembre 2003 et le 30 mars 2004. Après examen médical et indépendamment des résultats de la virologie, certains enfants seront hospitalisés (n = 263), d’autres rentreront chez eux (n = 186).
Les AN sont traitées par IF pour la recherche du virus respiratoire syncytial (VRS), des virus influenza A et B, parainfluenza (VPI) 1, 2, 3 et adénovirus (Dako). En cas d’IF négative, un isolement sur culture de cellules HuH7 est pratiqué [Freymuth F., J Med Virol 2005 ; 77 : 295]. Après 4 jours d’incubation, les cellules sont examinées en IF et, en cas d’ECP, une RT-PCR multiplex 3 est effectuée sur le surnageant à la recherche des rhinovirus, entérovirus, virus influenza C, coronavirus humains (hCoV) 229E et OC43. Les tests RT-PCR multiplex 1, permettant la détection des virus influenza A, influenza B, VRS, métapneumovirus humain (hMPV), RT-PCR multiplex 2, la détection des VPI 1, 2, 3, 4 et RT-PCR multiplex 3, sont réalisés directement sur l’AN selon une procédure déjà décrite [Bellau-Pujol S, J Virol Meth 2005 ; 126 : 53]. Une recherche d’adénovirus par PCR y est associée [Vabret A, J Clin Virol 2004 ; 31 : 116].
Sur les 449 AN testées, 411 (91,5 %) sont positives et 514 virus sont détectés. Ils comprennent 226 VRS, 165 rhinovirus, 46 virus influenza A, B, C, 23 hMPV, 17 VPI 1,2,3,4, 14 hCoV 229E ou OC43, 12 adénovirus et 11 entérovirus. Il n’y a pas de différence dans la répartition des virus entre le groupe des enfants hospitalisés et les autres, sauf pour le VRS qui est plus fréquemment détecté chez les enfants hospitalisés, et pour les virus influenza qui sont plus fréquemment trouvés chez les enfants non hospitalisés. Plus de virus : 239 (91,8 %) sont détectés par les PCR multiplex et adénovirus que par les méthodes conventionnelles d’IF et de culture : 188 (72,3 %). La différence de performance entre les deux approches est significative pour la recherche du VRS et des rhinovirus. Il n’y a pas d’augmentation de la détection des virus influenza et adénovirus, mais les effectifs de ces virus sont relativement faibles dans cette étude.
Plusieurs différences apparaissent entre l’utilisation de l’IF seule, les méthodes conventionnelles d’IF et de culture et les techniques PCR : le nombre de virus détectables, respectivement 7, 13, 15 ; le pourcentage d’échantillons positifs : 56,1 %, 72,3 %, 91,9 %, le temps de réponse : 1 à 2 heures, 1 heure à 4 jours, 1 à 2 jours ; le coût des techniques (réactifs et temps de travail) : 12,11 Ç, 12,11 à 48,58 Ç, 23,69 Ç.

O103
RT-PCR en temps réel pour le diagnostic des méningites à entérovirus chez des enfants vus aux urgences d’un hôpital pédiatrique : bilan de l’épidémie 2005

Michel Y¹, Giraud C¹, Auguste V¹, Bailly JL³, Parez N², Garbag-Chenon A¹, Dehée A¹

¹Laboratoire de virologie, Hôpital Trousseau et Université Pierre et Marie Curie, EA 3500, Paris ; ²Urgences pédiatriques, Hôpital Trousseau, Paris ; 3Service de Virologie, CHU, Clermont-Ferrand.
<yanne.michel@trs.ap-hop-paris.fr>

Les buts du travail étaient de développer une technique de RT-PCR en temps réel permettant une détection sensible et une quantification de l’ARN des entérovirus dans le LCR et d’évaluer l’apport de cette technique pour le diagnostic des méningites à entérovirus chez les enfants vus aux urgences de l’hôpital Trousseau lors de l’épidémie 2005.
La RT-PCR en temps réel, réalisée en deux étapes, utilise une sonde d’hydrolyse TaqMan dans la région 5’ non codante du génome des entérovirus. Cette technique a été utilisée pour analyser, prospectivement, 342 LCR provenant d’enfants vus aux urgences pédiatriques de l’hôpital Trousseau (de mi-février à fin septembre 2005). Un isolement viral en culture cellulaire a été réalisé en parallèle pour chacun de ces 342 échantillons. Les résultats obtenus par RT-PCR (détection et quantification du génome viral dans le LCR) ont été comparés avec ceux obtenus par culture et analysés en fonction de différents paramètres clinicobiologiques (âge et sexe des patients, symptômes initiaux, délai entre la survenue des symptômes et la ponction lombaire, biochimie du LCR).
154 (45 %) des LCR adressés au laboratoire ont été retrouvés positifs pour l’entérovirus par RT-PCR en temps réel (23 % des LCR pour les enfants âgés de moins de 3 mois, 18 % pour la tranche d’âge 3 mois à 3 ans et 67 % pour les enfants de 3 à 15 ans). Parmi les LCR retrouvés positifs, le sexe ratio M/F était de 1,9. Quatorze % des LCR positifs contenaient moins de 10 éléments, 45 % en contenaient entre 10 et 100 et 41 % en contenaient plus de 100. Parmi les LCR contenant plus de 10 éléments, 17 % avaient une formule à prédominance lymphocytaire, 62 % étaient à prédominance de polynucléaires et 21 % avaient une formule équilibrée. Le pic de l’épidémie a été atteint entre mi-juin et mi-juillet, avec un taux de LCR positifs par RT-PCR en temps réel supérieur à 70 %. Par comparaison, la recherche d’entérovirus en culture cellulaire effectuée en parallèle n’a pu révéler que 10 % d’échantillons positifs. Le typage des souches isolées en culture a permis d’identifier différents entérovirus (echovirus 6, 13, 18, 30 ; coxsackie A9).
La RT-PCR en temps réel a constitué un outil précieux pour établir le diagnostic virologique de méningite à entérovirus, dans le cadre de l’épidémie de l’année 2005. Elle présente de nombreux avantages par rapport à la culture ou à la PCR « classique » : cette technique d’une grande sensibilité et d’une bonne faisabilité permet d’établir un diagnostic dans des délais très brefs, ce qui améliore la prise en charge des patients en réduisant le temps d’hospitalisation (mise en place d’une hospitalisation de très courte durée). La RT-PCR en temps réel permet de plus de quantifier la charge virale entérovirus dans le LCR. L’intérêt de cette quantification, en regard des autres données clinicobiologiques recueillies sera présenté et discuté.

O104
Charges sériques significatives d’ADN du virus de l’hépatite B parmi les sujets ayant un profil sérologique anticorps anti-HBc isolés

Masurel J¹, Launay O², Servant-Delmas A³, Basse-Guerineau AL¹, Meritet JF¹, Laperche S³, Sogni P^4,5, Rosenberg AR^1,5

¹Université Paris-Descartes, Faculté de Médecine, AP-HP, Groupe hospitalier Cochin, Service de virologie, Paris ; ²Université Paris-Descartes, Faculté de Médecine ; AP-HP, Groupe hospitalier Cochin, CIC de vaccinologie Cochin-Pasteur, Service de médecine interne, Paris ; ³INTS, Centre National de Référence des hépatites B et C en transfusion, Paris ; ³Université Paris-Descartes, Faculté de médecine, AP-HP, Groupe hospitalier Cochin, Service d’hépato-gastro-entérologie, Paris ; ⁵Inserm, Equipe Avenir Virus de l’hépatite C, Institut Cochin, Paris.
<arielle@cochin.inserm.fr>

La détection d’anticorps anti-HBc totaux en l’absence d’antigène HBs et d’anticorps anti-HBs (anti-HBc isolés) a été rapportée, notamment chez les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ou le virus de l’hépatite C (VHC). L’interprétation de ce profil sérologique est incertaine et l’intérêt de la recherche de l’ADN du virus de l’hépatite B (VHB) dans cette situation est discuté. Ce travail a été réalisé pour préciser la signification des profils anti-HBc isolés dans les sérums non sélectionnés adressés au laboratoire de virologie clinique.
Parmi les 6431 patients ayant bénéficié d’un dépistage des trois principaux marqueurs sérologiques du VHB au laboratoire du groupe hospitalier Cochin en 2003, 362 (5,6 %) avaient un profil anti-HBc isolés. Un seul patient avait des anticorps anti-HBc de classe IgM, en rapport avec une hépatite B aiguë en voie de résolution. Les anticorps anti-HBe étaient détectables dans 155/362 (42,8 %) sérums, nous conduisant à mettre en doute la réalité de la positivité des anticorps anti-HBc parmi les 207 sérums restants. Cependant, 11 seulement parmi ces 207 sérums étaient négatifs avec une seconde technique de détection des anticorps anti-HBc totaux ; pour ces 11 sérums, les valeurs de ratio (signal échantillon/seuil) dans la première technique étaient significativement plus faibles que celles observées pour les sérums positifs dans les deux techniques (p < 0,001). Dans les 350 sérums restants, nous avons effectué une seconde recherche de l’antigène HBs en utilisant un coffret commercialisé plus récemment. Deux de ces 350 sérums avaient un antigène HBs détectable par ce nouveau coffret. Dans ces 2 sérums, l’ADN du VHB était présent, et le séquençage du gène s a révélé dans l’épitope immunodominant de l’antigène HBs des substitutions d’acides aminés compatibles avec la discordance observée entre les deux coffrets. Finalement, l’ADN du VHB a été recherché dans les 348 sérums restants à l’aide du coffret Versant HBV DNA 3.0 (Bayer), un test standardisé dont le seuil de détection (2 000 copies/ml) devrait permettre de cribler les infections cliniquement pertinentes. Le coffret Cobas Amplicor HBV Monitor (Roche) a été utilisé comme test de confirmation. La recherche de l’ADN du VHB était positive chez 8 patients, dont une femme enceinte. Le séquençage du gène s réalisé pour 7 de ces 8 patients a permis d’identifier des mutations dans l’épitope immunodominant de l’antigène HBs dans 5 cas. Au total, l’ADN du VHB était donc retrouvé chez 10 des 362 patients ayant un profil anti-HBc isolés, soit une prévalence de 2,8 %, avec une charge virale supérieure à 10 000 copies/ml chez 6 patients. Les patients avec et sans ADN du VHB détectable ont été comparés selon plusieurs critères cliniques et virologiques (y compris le statut vis-à-vis du VIH et du VHC), mais aucun facteur prédictif de la présence sérique de l’ADN du VHB n’a pu être identifié.
En conclusion, la mise en évidence d’un profil sérologique « anti-HBc isolés » est fréquente au laboratoire de virologie clinique, et correspond rarement à une fausse positivité dans le test de détection des anticorps anti-HBc totaux. La prévalence de la présence sérique de l’ADN du VHB est faible chez les sujets ayant un profil anti-HBc isolés et, dans la majorité des cas, cette situation semble attribuable à des mutations du gène s malgré l’utilisation de tests de plus en plus sensibles pour la détection de l’antigène HBs. Cependant, l’existence de charges virales significatives et l’absence de facteurs prédictifs suggèrent que les sujets ayant un profil sérologique « anti-HBc isolés » doivent être considérés comme potentiellement porteurs d’ADN du VHB.

O105
Séquençage de résistance aux antirétroviraux du VIH en Tunisie à partir de spots de plasma séché

Dachraoui R^1,2, Trabelsi A², Simon F¹, Plantier JC¹

¹CHU Charles Nicolle, Rouen ; ²CHU de Sousse, Tunisie.
<Jean-Christophe. Plantier@univ-rouen.fr>

L’objectif de l’étude était de génotyper les souches VIH1 collectées sur spots de plasma séché (DPS, Dried Plasma Spot), déposés en Tunisie et envoyés par courrier postal en France.
20 μL d’échantillons de plasma de 35 patients tunisiens infectés par le VIH1 avec une gamme de charges virales de 2,25 log (177 copies/mL) jusqu’à plus de 5,9 log (750 000 copies/mL), ont été déposés sur des buvards en Tunisie. Ces DPS ont été conservés à température ambiante dans un sac plastique avec un absorbeur d’humidité et envoyés par courrier postal en France. Le délai entre la collecte et l’envoi a été de 10 jours. Des aliquots de plasmas correspondants non déposés ont été utilisés pour mesurer la charge virale (technique Cobas Monitor Roche). À réception en France, les DPS ont été conservés à -80 °C jusqu’à manipulation. Après élution et extraction de l’ARN, une RT-PCR nichée a été utilisée pour amplifier les régions protéase, reverse transcriptase (RT) du gène pol et la région gp41 du gène env (cible de l’enfuvirtide). Le séquençage de résistance a été réalisé sur tous les amplicons obtenus dans les différentes régions. Les séquences obtenues ont été analysées pour les mutations associées à la résistance et une analyse phylogénétique.
La région protéase a été amplifiée avec succès dans 27/35 cas (77,1 %), la RT dans 25/35 cas (71,4 %) et dans la gp41 dans 21/31 cas (67,7 %). Pour la gp41, les contrôles d’amplification sur les échantillons de plasma correspondants non déposés étaient négatifs pour 4 échantillons. Tous les échantillons avec une charge virale > 4 log (N = 27) ont été amplifiés avec succès dans la protéase (100 %) et 25 (92,6 %) dans la RT ; 21 des 24 échantillons étaient positifs avec notre protocole gp41 (87,5 %). Trois des 8 échantillons avec une charge virale < 3,7 log ont été amplifiés avec succès dans la région protéase et 1 dans la région gp41. Le séquençage a montré un profil de mutations en corrélation avec l’état thérapeutique des patients. Les analyses phylogénétiques ont conclu la présence de sous-type B, dans les différentes régions séquencées.
Nos résultats obtenus dans les conditions de terrain confirment que le suivi des résistances peut être réalisé dans les pays du sud. Une optimisation pour améliorer la sensibilité pour des charges virales < 4 Log est en cours. Les DPS sont simples d’utilisation et faciles à transporter (par courrier postal), et sont un outil possible pour le suivi individuel et épidémiologique des résistances et de la diversité génétique dans les différentes régions du monde.

P106
Rôle des mutants de l’antigène HBs dans la non-détection de l’infection par le VHB chez les donneurs d’organes, de tissus et de cellules

Challine D, Chevaliez S, Brillet R, Rigot P, Dubernet F, Larderie P, Remire J, Darthuy F, Pawlotsky JM

Laboratoire de virologie et Inserm U635, Hopital Henri-Mondor, Créteil
<dominique.challine@hmn.aphp.fr>

La recherche de l’antigène HBs (AgHBs) est systématique chez les donneurs d’organes, de tissus et de cellules afin de prévenir la transmission du virus de l’hépatite B (VHB) par la greffe. La recherche des anticorps (Ac) anti-HBc et anti-HBs est également systématique en France. En cas de résultats faussement négatifs de l’AgHBs, les receveurs sont exposés au risque de transmission du VHB par le greffon. Les objectifs de l’étude étaient de : 1) déterminer la prévalence des marqueurs de réplication du VHB chez les donneurs avec ou sans marqueurs sérologiques ; 2) comprendre le rôle des mutants de l’AgHBs chez les donneurs porteurs de l’ADN du VHB en l’absence d’AgHBs.
Parmi 11 155 donneurs d’organes de tissus et de cellules testés dans notre laboratoire, 626 présentaient au moins un marqueur d’infection, AgHBs, Ac anti-HBs ou anti-HBc (à l’exception des anti-HBs isolés) et 1 433 donneurs d’organes étaient séronégatifs pour le VHB ou présentaient un profil de vaccination (anti-HBs isolés). L’ADN du VHB a été recherché chez tous ces donneurs à l’aide d’une technique de PCR en temps réel (Cobas TaqMan HBV, Roche Molecular Systems, intervalle de quantification 6 à 108 UI/ml). Chez tous les donneurs ADN positifs, la séquence entière de l’AgHBs, encadrant le déterminant « a » (position en acides aminés 122-149) a été ou est en cours de séquençage.
L’ADN du VHB était présent, à un niveau en général faible, chez 83 % des donneurs d’organes, de tissus et de cellules porteurs de l’AgHBs. La séquence de l’AgHBs de ces donneurs est en cours. L’ADN du VHB a été mis en évidence chez 4 des 74 donneurs présentant des Ac anti-HBc isolés (5,4 %). La séquence de l’AgHBs a pu être déterminée chez deux d’entre eux : l’un présente une substitution par une valine en position 45 au niveau de l’épitope reconnu par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I et aucun ne présente de substitution dans le déterminant « a » connue pour altérer la détection de l’antigène HBs. Trois des 32 donneurs porteurs des 3 marqueurs (9,4 %) avaient une charge virale faible. L’un d’eux est porteur d’une mutation T131A, capable d’altérer la structure antigénique de l’AgHBs. Un donneur d’organe présentant un profil de vaccination (anti-HBs isolés) était virémique. La séquence de l’AgHBs de ce donneur présente de nombreuses substitutions, en particulier Q129P dont le rôle sur l’antigénicité de l’AgHBs reste à déterminer.
L’ADN du VHB est détecté chez la plupart des donneurs d’organes, de tissus et de cellules porteurs de l’AgHBs, mais avec un niveau de réplication plus faible que celui observé chez les malades porteurs d’une hépatite chronique B. L’ADN du VHB peut être détecté chez les donneurs sans AgHBs et porteurs ou non d’Ac anti-HBc. Les mutations de l’AgHBs n’apparaissent pas être responsables de l’absence de détection de l’antigène qui semble plutôt être en relation avec un manque de sensibilité des tests pour les taux faibles d’AgHBs. L’utilisation de tests ultrasensibles détectant les mutants de l’AgHBs permettrait d’améliorer la sécurité virale des greffes d’organes, de tissus et de cellules.

P107
Pourquoi les anticorps anti-HBc sont-ils absents chez certains patients infectés chroniquement par le virus de l’hépatite B ?

Avettand-Fenoel V¹, Katlama C², Poynard T³, Thibault V¹

¹Laboratoire de Virologie, GH Pitié-Salpêtrière, Paris ; ²Service de maladies infectieuses, GH Pitié-Salpêtrière, Paris ; ³Service d’Hépato-Gastro-Entérologie, GH Pitié-Salpêtrière, Paris
<veronique.avettand@nck.aphp.fr>

Le profil sérologique associé au portage chronique du virus de l’hépatite B (VHB) est habituellement caractérisé par la détection concomitante de l’antigène HBs (AgHBs) et des anticorps anti-HBc. Cependant, l’absence d’anticorps anti-HBc malgré la persistance d’AgHBs est observée dans quelques cas. Le but de notre étude était d’analyser les raisons de cette absence de détection chez des porteurs chroniques du VHB.
2169 patients infectés par le VHB et porteurs chroniques d’AgHBs ont été sélectionnés. La détection des AgHBs, AgHBe, anticorps anti-HBc et anti-HBe était réalisée avec la technologie Axsym (Abbott). Les patients présentant un profil sérologique avec absence d’anticorps anti-HBc confirmée par le test Axsym sur 2 prélèvements ont été recensés. L’absence d’anticorps anti-HBc était ensuite confirmée par un test Elisa sandwich (Monolisa Anti-HBc Plus, Biorad). Le gène précore-core a été séquencé puis analysé en cas d’absence d’anticorps anti-HBc.
Parmi les 2169 patients, 39 (1,79 %) présentaient un profil sérologique sans anticorps anti-HBc. Tous avaient un AgHBe positif et un génome HBV détectable par la PCR Cobas (Roche). La recherche d’anticorps anti-HBc a ensuite été réalisée par la technique Monolisa pour 19 de ces 39 patients et l’absence de détection était confirmée pour 12 d’entre eux (63 %). La distribution des génotypes viraux était représentative de celle observée pour les patients suivis dans notre groupe hospitalier. Aucune mutation du gène préC-C n’a été retrouvée pour 12/15 patients. Cependant, des mutations dans la région pré-core (W37stop ou S20T) étaient retrouvées dans 2 cas, la mutation preC associée à une mutation L64stop dans la région C dans un cas. Hormis 1 patient co-infecté par le virus de l’hépatite C, tous ces patients étaient immunodéprimés en raison d’un traitement spécifique post-transplantation ou d’une co-infection par le VIH.
L’absence de détection des anticorps anti-HBc chez les patients chroniquement infectés par le VHB est rarement observée et largement expliquée par le manque de sensibilité de certains tests sérologiques et par la faible production d’anticorps chez les patients immunodéprimés. L’hypothèse d’épitopes HBc mutés n’a pas été mise en évidence dans notre étude. L’absence d’anticorps anti-HBc chez les patients immunodéprimés doit être interprétée avec précaution.

P108
Evaluation d’une technique de quantification de la charge virale du virus de l’hépatite B par PCR en temps réel et comparaison avec deux tests commerciaux

Hormigos K, Belguerma N, Al Hawjari N, Brichler S, Alloui C, Dény P, Gordien E

Laboratoire de bactériologie, virologie, hygiène, Assistance Publique des Hôpitaux de Paris, E. A 3406, Université Paris 13, Bobigny
<katia.hormigos@wanadoo.fr>

La quantification précise de la charge virale ADN du VHB est indispensable pour la prise en charge et le suivi de patients infectés de façon chronique sous traitement antiviral. Cependant les résultats obtenus à l’aide des différentes techniques disponibles peuvent varier très fortement pour un même échantillon ; en fonction du génotype VHB considéré ; ou selon l’étendue de la gamme de détection. D’autre part la question d’un étalon standard international demeure. L’objectif de notre étude était d’évaluer les performances d’une nouvelle technique de PCR en temps réel, Affigene HBV Trender (Sangtec Molecular Diagnostic) par rapport à deux trousses commerciales, Cobas Amplicor HBV Monitor (Roche Diagnostic) et bDNA 3.0 (Bayer Health Care), dans la région de Seine-Saint-Denis, caractérisée par une grande diversité des souches virales circulantes. Les résultats obtenus ont été exprimés pour chaque technique, en unités internationales (UI) établies par l’organisation mondiale de la santé.
89 échantillons de sérum de patients ont été collectés de façon prospective pendant deux mois. L’extraction et la quantification de l’ADN viral ont été réalisées pour chaque test selon les recommandations strictes du fournisseur. Le génotypage VHB a été déterminé par séquençage et analyses phylogéniques d’une région de 410 paires de bases du gène de la polymérase. Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel SPSS version 10.0.
Les cinq génotypes A (27 %), B et C (10 %), D (13,5 %) et E (49,5 %) ont été retrouvés dans notre région. La technique HBV Trender s’est révélée rapide, facile d’utilisation et capable de détecter et de quantifier de façon équivalente les génotypes de A à E. La fourchette de quantification se situe entre 1,71 logUI/ml et 8,24 logUI/ml, mais des valeurs entre 1 logUI/ml et 9,5 logUI/ml (0,3 logUI/ml) peuvent être obtenues. L’analyse des résultats globaux a montré une sous-estimation significative des valeurs de charge virale par la technique Cobas par rapport à bDNA3.0 (p = 0,002) et à HBV trender (p = 0,015). Ces différences étaient liées essentiellement au génotype E « africain » (bDNA 3.0 : p = 0,02 et HBV trender : p = 0,03).
Cette étude soulève la question de la variabilité génétique du VHB dans la mesure de la charge virale en fonction des différents tests utilisés.

P109
Rolling circle amplification : une technique innovante et hautement sensible appliquée à l’amplification des génomes entiers de VHB

Margeridon S¹, Chemin I¹, Barraud L², Zoulim F¹, Trepo C¹, Kay A¹

¹Inserm U271, 151 cours A.-Thomas, 69003 Lyon ; ²Bioalliance Pharma, 59 bd M.-Valina, 75015 Paris.
<margeridon@lyon.inserm.fr>

Malgré l’existence de vaccins efficaces, l’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) reste un problème de santé publique majeur, avec près de 400 millions de porteurs chroniques dans le monde. Ce nombre considérable de sujets infectés chroniquement par le VHB est dû à plusieurs facteurs : la faible efficacité des traitements antiviraux contre le VHB (\\ 126\\ 30 %) dueau développement de mutations de résistance ; l’existence de VHB échappant au système immunitaire de l’hôte ; l’existence de variants indétectables par les tests sérologiques, nommés VHB cryptiques. L’étude des variants du VHB est donc indispensable mais l’obtention de leur génome entier par PCR est souvent difficile. Ceci peut s’expliquer par la structure du génome du VHB présent dans les particules virales circulantes, qui est une molécule d’ADN relâchée circulaire partiellement bicaténaire (ADN-RC). De plus, les faibles taux de réplication de certains variants compliquent ce problème. Ainsi, dans cette étude, nous avons appliqué une nouvelle technique d’amplification hautement sensible à l’étude du VHB, la « Rolling Circle Amplification » (RCA), dans le but d’améliorer l’étude des génomes entiers de VHB et plus spécialement ceux des variants. Cette technique innovante a pour principe d’utiliser une enzyme hautement processive, capable de déplacer les fragments d’ADN doubles brins. La réaction est isothermale et se fait classiquement à 30 °C pendant 8 à 18 heures Ceci aboutit à une amplification exponentielle de tous les génomes circulaires, et produit des quantités importantes de multimères d’ADN doubles brins de la matrice. L’efficacité et la forte sensibilité de la RCA ont déjà été prouvées pour l’amplification des génomes entiers d’autres virus et bactéries. Toutefois la RCA n’a jamais été appliquée au VHB.
Pour élargir le champ d’application de la RCA au VHB, nous avons dans un premier temps réalisé des essais à partir d’un sérum provenant d’un patient chroniquement infecté par le VHB. Toutefois, pour que la RCA fonctionne efficacement, des étapes préliminaires aboutissant à la circularisation complète de l’ADN-RC ont été indispensables. Pour contourner ce problème, nous avons alors testé la RCA sur des prélèvements hépatiques. En effet, dans le noyau des hépatocytes infectés, le génome du VHB existe sous une forme circulaire superenroulée (ADN-ccc), qui est la matrice de réplication du VHB. Ainsi, les risques de contamination ont été limités et la sensibilité augmentée. La RCA a alors permis de préamplifier l’ADN-ccc présent dans l’échantillon en produisant un amplicon de haut poids moléculaire. Il a donc été indispensable d’additionner à la RCA une étape de digestion enzymatique ou une PCR, pour pouvoir exploiter le produit amplifié. Ainsi, l’association « RCA plus PCR » a amplifié le génome entier du VHB à partir de moins de 10 copies d’ADN-ccc. La sensibilité de cette combinaison est 100 fois supérieure à celle de la PCR seule, et comparable à celle d’une PCR en temps réel. De plus, l’ADN obtenu après « RCA plus PCR » est facile à cloner et à transfecter en cellules. Actuellement l’étude de plusieurs génomes entiers de VHB cryptiques est en cours grâce à la RCA.
En conclusion, la RCA présente de réels avantages pour l’étude des génomes entiers de VHB et notamment ceux des variants ayant de faibles taux de réplication. Elle permet également de générer de grandes quantités de matériel, facilitant la réalisation d’autres expériences (clonage, transfection en cellule), et permettant une plus grande exploitation des échantillons disponibles en faibles quantités.

P110
Évaluation de la plate-forme automatisée de PCR en temps réel Cobas AmpliPrep-Cobas TaqMan 48 (CAP-CTM) pour la quantification de l’ARN du virus de l’hépatite C

Chevaliez S, Bouvier-Alias M, Dameron G, Darthuy F, Rémiré R, Pawlotsky JM.

CNR des Hépatites B, C et delta, Laboratoire de Virologie et Inserm U635, hôpital Henri-Mondor, Créteil.
<stephane.chevaliez@hmn.aphp.fr>

La quantification précise, sensible et spécifique de l’ARN du VHC est nécessaire pour évaluer la réponse virologique pendant et après le traitement des hépatites chroniques C par l’interféron alpha pégylé associé à la ribavirine. La plate-forme automatisée Cobas AmpliPrep-Cobas TaqMan 48 (CAP-CTM Roche Molecular System) permet la quantification de l’ARN du virus de l’hépatite C (VHC) par PCR en temps réel à partir d’échantillons plasmatiques. L’objectif de l’étude est d’évaluer les performances intrinsèques de la plate-forme de biologie moléculaire automatisée CAP-CTM 48.
La sensibilité analytique et la linéarité ont été évaluées par quantification de dilutions sériées de raison 3 d’un standard titré à 5.10⁶ unités internationales par ml (UI/ml) d’ARN du VHC, soit 6,7 log10 (Acrometrix). La sensibilité, l’exactitude et la reproductibilité de la quantification ont été établies par quantification de dilutions du standard titré à 5.106 UI/ml lors d’expériences indépendantes en triplicate. La spécificité a été déterminée sur 205 sérums séronégatifs pour le VHC. L’influence des génotypes sur l’intervalle de quantification linéaire et l’exactitude de la mesure de la charge virale ont été appréciées sur 49 échantillons de patients atteints d’hépatite chronique C : génotype 1 (n = 11), génotype 2 (n = 10), génotype 3 (n = 10), génotype 4 (n = 11), génotype 5 (n = 6), génotype 6 (n = 1). La charge virale des échantillons cliniques des différents génotypes du VHC déterminée par la plate-forme CAP-CTM 48 a été comparée à celle déterminée par la technique des ADN branchés (bDNA, Versant HCV RNA 3.0, Bayer Healthcare). L’intervalle de quantification de la plate-forme CAP-CTM 48 a été étudié par dilutions sériées de raison 5 des 49 échantillons cliniques jusqu’à extinction du signal.
La linéarité de la quantification évaluée à partir du standard titré à 5.106 UI/ml était satisfaisante (pente = 0,9761, R = 0,9981). L’écart à la valeur attendue du standard titré à 5.106 UI/ml et de ses dilutions variait de 0,03 à 0,20 log UI/ml (moyenne : 0,097 ± 0,047 log UI/ml). Le coefficient de variation des mesures réalisées en triplicate par dilutions sériées du standard s’étendait de 0,2 à 7,2 %, avec une moyenne de 1,9 %. La spécificité était de 100 %. Les charges virales des 49 échantillons appartenant aux différents génotypes du VHC et leurs dilutions montraient une quantification linéaire de l’ARN du VHC sur l’ensemble de l’intervalle testé. Les quantifications d’ARN viral déterminées par la plate-forme CAP-CTM 48 étaient pour la plupart (44/49 valeurs) supérieures à celles déterminées par la méthode bDNA (différence : 0,47 ± 0,42 log UI/ml) avec des écarts plus importants pour les génotypes 1 et 3, suggérant une différence de calibration entre les deux méthodes. Par ailleurs, 2 échantillons de génotype 4 demeuraient nettement sous-quantifiés par la technique TaqMan avec des différences de l’ordre de 1 log UI/ml.
La plate-forme automatisée de PCR en temps réel Cobas AmpliPrep-Cobas TaqMan 48 est une méthode sensible, spécifique et reproductible pour la quantification de l’ARN du VHC avec une large gamme linéaire de quantification. Néanmoins, une sous-quantification occasionnelle des génotypes non-1 semble pouvoir survenir.

P111
Corrélation entre profil anti-HBc isolé et infection par le virus de l’hépatite C dans le centre tunisien

Hannachi N, Mhalla S, Ferjani A, Boukadida J

Laboratoire de microbiologie-immunologie UR 16/02, CHU F. Hached, Sousse, Tunisie
<nhannachi@lycos.com>

La présence isolée de l’anticorps anti-HBc est souvent non spécifique ou témoin d’un contact ancien avec le virus de l’hépatite B, une association avec l’infection par le virus de l’hépatite C a fréquemment été retrouvée. Le but de ce travail est de déterminer la corrélation entre le profil de l’anticorps anti-HBc isolé et l’infection par le virus de l’hépatite C (VHC).
Notre travail a porté sur 1 628 sérums parvenus à notre laboratoire durant l’année 2005. Les marqueurs sériques suivants ont été recherchés par technique immunoenzymatique : antigène HBs, anticorps anti-HBs, anticorps anti-HBc. Tous les sérums présentant des anticorps anti-HBc isolés ont été retenus (99 sérums). Parmi ces derniers, les anticorps anti-VHC ont été recherchés sur 83 sérums et les Ig M anti-HBc sur 46 sérums. Le profil des anticorps anti-HBc isolés représente 6 % de tous les sérums. Les anticorps anti- VHC ont été retrouvés dans 4/83 cas ce qui représente 4.8 % des sérums testés. Toutes les Ig M anti- HBc testées étaient négatives.
Le profil anti-HBc isolé est relativement fréquent dans notre région. La prévalence des marqueurs de l’infection par le VHC chez les patients ayant ce profil est plus importante que dans la population générale en Tunisie (0,4). Malgré une faible endémicité de l’hépatite C, la présence isolée d’anti-HBc doit faire rechercher les marqueurs de l’infection VHC.

P112
Evaluation du test Herpeselect pour la détection des anticorps anti-HSV2 chez des femmes africaines souffrant d’ulcérations génitales herpétiques associées à des récurrences ou une primo-infection

Legoff J¹, Bouhlal H1, Chemin C¹, Weiss HA², Khonde N³, Gresenguet G⁴, Malkin JE⁵, Si-Mohamed A¹, Mayaud P², Belec L¹

¹Inserm U743, Equipe immunité et biothérapie muqueuses, Centre de recherches biomédicales des cordeliers, et Unité de virologie, Hôpital europeen Georges Pompidou, Paris ; ²Department of Infectious & Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine, UK ; ³West Africa Project to Combat AIDS (WAPTCAS), Ghana ; ⁴Centre national de référence pour les maladies sexuellement transmissibles et le sida (CNRMST/SIFDA) Bangui, Central African Republic ; ⁵Clinique de l’Institut Pasteur, Paris
<jerome. le-goff@egp.aphp.fr>

Des données récentes de différentes trousses commerciales sur les performances des tests sérologiques pour la détection des anticorps anti-HSV2 ont identifié des différences dans la sensibilité et la spécificité sur des sérums de sujets d’Afrique subsaharienne. Ces données ont été établies en comparant les résultats obtenus avec le western blot qui constitue la méthode de référence. Pour des sérums africains, le test Herpeslect est considéré comme très sensible, et spécifique si la valeur index de positivité est> 3, alors que le fabricant considère comme positive toute valeur> 1. Toutefois, peu d’études ont pris en considération les données cliniques et la possibilité d’une infection herpétique génitale récente. L’objectif de cette étude a été de préciser les données existantes par des résultats de sérologie obtenus avec les trousses Herpeselect et Kalon chez des femmes présentant des ulcérations génitales herpétiques, dont certaines en primoinfection.
Des sérums et des prélèvements génitaux, effectués chez 94 femmes africaines du Ghana et de la République centrafricaine présentant des ulcérations génitales, ont été testés respectivement pour la sérologie HSV2 et la détection de l’ADN-HSV2. Les tests sérologiques ont été réalisés avec les trousses Herpeselect (Focus technologies) et Kalon assay (Kalon Biologicals). Les résultats des sérologies ont été interprétés comme suit : index (densité optique échantillon/densité optique calibrateur) < 0,9, négatif ; > 1,1, positif ; et entre 0,9 et 1,1, douteux. L’ADN-HSV2 a été détecté sur les lésions ulcérées pour établir l’étiologie et quantifié dans les lavages cervicovaginaux par PCR en temps réel, avec des amorces et des sondes d’hybridation ciblant l’ADN polymérase. Les femmes présentant une sérologie négative avec une détection positive de l’ADN-HSV2 ont été considérées comme présentant une primoinfection herpétique génitale. Pour ces patientes de nouvelles sérologies ont été réalisées afin d’observer une séroconversion au 14e et 28e jour suivant le début des symptômes quand les prélèvements étaient disponibles.
65 femmes étaient séropositives pour le HSV2 avec Herpeselect et 44 % d’entre elles présentaient une ulcération génitale à HSV2. Dix femmes séronégatives pour le virus HSV2 avaient une ulcération génitale positive pour HSV2, suggérant une primoinfection génitale herpétique. Pour 6 d’entre elles, des sérologies ont pu être réalisées à J14 et J28 après l’ulcération. Toutes étaient séropositives avec le test Focus, démontrant la séroconversion HSV2. La concordance globale entre les tests Focus et Kalon était de 93,5 %. Les résultats discordants correspondaient à des échantillons positifs avec le test Focus et négatifs ou douteux avec le test Kalon. Tous les résultats concordants avaient des valeurs d’index Focus comprises entre 1,3 et 15 (3 valeurs < 3). Parmi 6 échantillons positifs en Focus et négatifs en Kalon, 2 sérums avec des index Focus de 1,5 et 4,8 correspondaient à des femmes avec une détection de l’ADN HSV2 génital positive. Pour 4 des 10 femmes avec une primo-infection, des sérums à J14 et J28 ont pu être testés avec le test Kalon. Tous les résultats étaient interprétés négatifs avec cette technique mais avec une augmentation d’un facteur de 2,3 à 4,9 des densités optiques était observée entre deux sérums successifs.
Ces résultats confirment la bonne spécificité du test Herpeselect pour des sérums africains avec un seuil de positivité établi avec un index> 3. Ils suggèrent aussi que le test Herpeselect permet une détection des anticorps anti-HSV2 très précoce après le début de l’infection. Ensemble ces données indiquent que les résultats sérologiques pour des index < 3 doivent être interprétés en fonction du contexte clinique.

P113
Infection maternofœtale par un variant du virus de la chorioméningite lymphocytaire

Meritet JF¹, Lewin F², Poissonnier MH², Poizat R³, Loget P⁴, Krivine A¹, Lebon P¹, Rozenberg F¹

¹Hôpital Cochin Saint-Vincent-de-Paul, service de virologie et EA 3622 Université Paris 5, Paris ; ²Service d’obstétrique, Cochin-SVP, Paris ; ³Clinique du Tertre Rouge, Le Mans ; ⁴Laboratoire d’anatomie pathologique, CHR, le Mans

Le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), membre de la famille des Arenaviridae, est une cause reconnue d’infections maternofœtales et de fœtopathies.
Nous rapportons un cas d’infection par le LCMV d’une femme enceinte exposée professionnellement aux rongeurs. La particularité de ce cas est sa révélation par une image d’anasarque fœtoplacentaire à l’examen échographique de la 24^e semaine d’aménorrhée, suivie d’une ventriculomégalie cérébrale développée dans les quatre semaines suivantes.
L’infection virale maternelle est prouvée par la séroconversion, celle du fœtus par l’isolement viral du liquide amniotique et la positivité de la PCR sur l’ARN extrait du sang fœtal et du liquide amniotique. Une réponse interféron de type 1 est aussi détectée. L’analyse de séquences partielles des gènes codant la nucléocapside et la protéine GP1 indiquent une homologie de 87 et 88 % respectivement avec les souches de LCMV Armstrong et WE. De nouvelles amorces ont été choisies pour la mise au point d’une nouvelle RT-PCR permettant un criblage plus large de ces virus.

P114
Virémies du virus d’Epstein-Barr évaluées par PCR quantitative en temps réel : la question des inhibiteurs de PCR

Schvoerer E, Guidicelli G, Fafi-Kremer S, Fritsch S, Freitag R, Fuchs A, Nourreddine F, Stoll-Keller F

Institut de virologie,CHU, 67000 Strasbourg
<evelyne.schvoerer@viro-ulp.u-strasbg.fr>

La virémie du virus d’Epstein-Barr (EBV) évaluée par PCR quantitative en temps réel est un marqueur de plus en plus souvent prescrit à l’hôpital, en particulier dans le cadre des suspicions de syndromes lymphoprolifératifs post-transplantation (SLPT) EBV-induits après greffe de moelle osseuse ou d’organe solide. Une difficulté technique, représentée par la présence éventuelle d’inhibiteurs de PCR dans les extraits d’acides nucléiques, empêche parfois de rendre un résultat de PCR de l’EBV aux cliniciens et impose une explication motivée auprès des prescripteurs.
Un modèle d’inhibition expérimentale a été imaginé, utilisant l’héparine à des concentrations décroissantes dans des mélanges réactionnels contenant les réactifs de la trousse de quantification de l’ADN de l’EBV par PCR en temps réel proposée par Roche. Les analyses sont effectuées en étudiant l’effet inhibiteur de l’héparine sur des réactions de PCR ciblant à la fois l’ADN de l’EBV et un contrôle interne d’inhibition. Les PCR sont considérées comme positives à partir du moment où la fluorescence des sondes d’hybridation moléculaire devient supérieure au bruit de fond, point déterminé en nombre de cycles de PCR. Les quantités d’ADN de l’EBV sont estimées par rapport à une courbe étalon externe. Les résultats montrent qu’à partir d’un retard du « point de sortie » du contrôle d’inhibition de deux cycles de PCR, une sous-estimation de la quantité d’ADN de l’EBV de 0,5 log est réalisée, écart qui est considéré comme significatif en quantification moléculaire.
Les données obtenues sur ce modèle d’inhibition seront présentées de façon exhaustive, justifiant l’importance de prendre en compte ces phénomènes d’inhibition de PCR pour éviter de rendre des résultats de quantification d’ADNémies de l’EBV sous-estimés ou faussement négatifs. Des conditions de validation précises de ce marqueur moléculaire seront proposées. Des seuils et/ou des cinétiques aidant à prédire la survenue de SLPT pourront ainsi être abordés de façon plus robuste.

P115
Evaluation d’une nouvelle trousse de quantification de la charge virale EBV par PCR en temps réel EBV R-gene™ Quantification Kit

Fafi-Kremer S¹, Bargues G¹, Magro S², Barranger C², Bes J², Bourgeois P², Joannes M², Morand P¹, Seigneurin JM¹

¹Laboratoire de virologie médicale, CHU Michallon, Grenoble ; ²Argene, Varilhes
<samira. fafi-kremer@chru-strasbourg.fr>

La détermination de la charge virale EBV dans le sang apparaît comme importante dans le suivi des patients transplantés à risque de syndrome lymphoprolifératif lié à l’EBV. Son intérêt a été également démontré dans les cancers associés à l’EBV chez l’immunocompétent et chez le patient infecté par le VIH, ainsi que dans les MNI graves. Dans cette étude nous avons testé une nouvelle trousse de quantification EBV par PCR en temps réel EBV R-gene™ Quantification Kit (Argène).
Nous avons déterminé la sensibilité du kit sur 3 instruments de PCR en temps réel (LightCycler^® 1.0, SmartCycler® 2.0 et AbiPrism^® 7900) en utilisant l’ADN des cellules lymphoïdes Namalwa et un sang total EBV-positif dilué en série dans un sang total EBV-négatif. La reproductibilité et la répétabilité du kit seul puis du kit associé à 3 techniques d’extraction différentes (Qiamp^® DNA isolation mini kit, the MagNAPure^® compact LC instrument, ou Qiagen’s BioRobot EZ1 System), avec une amplification sur l’appareil SmartCycler^® 2.0, ont été évaluées sur 5 sangs totaux contenant des charges virales EBV qui varient entre 500 et > 100 000 copies/mL (détermination par notre PCR EBV « maison »). L’utilisation du kit pour 150 sangs totaux (greffés de moelle, greffés de rein, greffés de foie, greffés de poumon, greffés cardiaques, MNI, patients infectés par le VIH) reçus dans notre laboratoire et stockés à -80°C a été comparée à celle de notre technique PCR en temps réel « maison ».
La sensibilité du kit varie de 3,9 à 18 copies/réaction avec une meilleure sensibilité obtenue avec l’ABI. La reproductibilité du kit varie de 0,66 à 13,8 % et la répétabilité varie de 0,56 à 18,8 %, les coefficients de variation (CV) les plus élevés étant associés aux plus faibles charges virales. Sur les 150 échantillons testés nous avons observé une bonne corrélation entre les deux techniques (r2 = 0,87). Certains échantillons étaient discordants (deltalog > 0,5 log copies/mL) entre les deux tests, avec des valeurs plus fortes obtenues avec la technique maison.
Le test EBV R-gene™ Quantification Kit a montré une très bonne sensibilité, la reproductibilité et la répétabilité du test varient légèrement en fonction de la technique d’extraction utilisée, avec des meilleurs CV obtenus par les deux techniques Qiagen^® (cela est probablement dû à la qualité du tampon de lyse). Les valeurs un peu plus fortes observées entre notre technique maison et la trousse Argene sont probablement dues à la conservation du sang total ; pour une meilleure stabilité des acides nucléiques il serait intéressant de congeler le sang total après ajout du tampon de lyse. Enfin, par cette étude nous avons montré que dans le cadre du suivi d’un patient, il est primordial d’utiliser la même technique d’extraction, le même instrument PCR et la même technique d’amplification.

P116
Aspects épidémiologiques et virologiques des diarrhées à rotavirus

Akoua-Koffi C¹, Akran V¹, Peenze I³, Faye-Kette H², de Beer MC³, Dosso M², Ehouman A², Steele AD³

¹Département des virus épidémiques, Institut pasteur de Côte d’Ivoire 01, BP 490, Abidjan ; ²Laboratoire de bactériologie-virologie, Institut pasteur de Côte d’Ivoire ; ³MRC/Medunsa, Diarrhoeal Pathogens Research Unit Medical University of Southern Africa, Pretoria, SA.

Les Rotavirus humains sont responsables dans plus de 80 % des cas de diarrhées aigus de l’enfant. Dans le but de déterminer leur place dans les gastroentérites infantiles et les génotypes impliqués, 642 échantillons de selles ont été recueillis sur différentes périodes entre 1997 et 2000 dans les formations sanitaires urbaines et les centres hospitaliers universitaires (CHU) d’Abidjan chez des enfants diarrhéiques de 0 à 5 ans. La détection antigénique des Rotavirus de groupe A, réalisée par test Elisa commercial (Rotavirus Pathfinder Kallestad, Sanofi-Pasteur), a été suivie par la caractérisation antigénique (protéine VP6) et moléculaire, électrophorèse en gel de polyacrylamide et typage génomique VP4. La prévalence de la diarrhée à Rotavirus de groupe A variait entre 20,4 et 32,8 % avec une moyenne de 28 %. Parmi les enfants trouvés positifs, ceux de la tranche d’âge 0-11 mois représentaient 30,1 % contre 27,5 et 2 3,9 % pour ceux des tranches d’âges 1-2 ans et 3-5 ans respectivement, démontrant ainsi la précocité de l’infection à Rotavirus. Du point de vue électrophorétypique et antigénique, 71 % de 134 souches détectées (27,9 %) avaient un profil « long » et étaient de sous-groupe VP6 II contre 28,35 % de profil court et du sous-groupe I. Les ilectrophoritypes de profil « court » ont été identifiés chez les enfants de 0 à 2 ans majoritairement. Par rapport au gène VP4, les 115 souches analyses ont permis d’obtenir une proportion majoritaire de génotypes P[8] (45,73 %) suivie du génotype P[6] (37,4 %) et P[4] (1,7 %).
Ces résultats devront être complétés par la détermination des génotypes VP7 afin de fournir des informations indispensables à la formulation des vaccins anti-Rotavirus.

P117
Evaluation d’une RT PCR en temps réel multiplex (PCR ProFlu-1 LC Real Time Assay) pour la détection des virus VRS, influenza A et influenza B

Legoff J1,2, Chemin C1, Charpentier C1, Matta M1, Si-Mohamed A1, Belec L1, Lebon P2

1Unité de virologie, Hôpital Européen Georges Pompidou ; Laboratoire de virologie, Hôpital Cochin-Saint-Vincent-de-Paul, Paris
<jerome. le-goff@egp.ap-hop-paris.fr>

Les techniques de biologie moléculaires sont plus sensibles que la culture ou les tests antigéniques pour détecter les infections respiratoires virales, en particulier chez les adultes et pour des liquides de lavage broncho-alvéolaire. Des traitements antiviraux spécifiques et efficaces sont actuellement disponibles pour la grippe ou en développement pour le virus respiratoire syncytial (VRS), les virus para-influenzae et les rhinovirus. Ces traitements sont d’autant plus efficaces qu’ils sont donnés précocement après le début des symptômes, soulignant la nécessité de disposer d’un diagnostic rapide. Une technique de transcription inverse combinée à une PCR en temps réel a été développée (ProFlu-1 LC Real Time Assay, Prodesse, Waukesha, Wis) pour détecter l’ARN du VRS et des virus influenza A (IA) et B (IB).
Nous avons testé 48 échantillons nasopharyngés d’enfants et de lavage bronchoalvéolaire d’adultes connus pour être infectés par le VRS (n = 16) ou les virus influenza (A, n = 18 ; B, n = 14) par un diagnostic établi par culture ou PCR spécifique, et 10 échantillons positifs pour les virus parainfluenzae ou négatifs pour tout virus respiratoire. Un contrôle interne (CI) a été introduit dans chaque échantillon avant extraction. Nous avons réalisé les réactions de transcription inverse et d’amplification dans des capillaires en verre sur l’automate Light Cycler 2.0 (Roche Applied Science, Meylan, France). Le mélange réactionnel de PCR contenait la transcriptase inverse MulV (Applied Biosystems, Foster City, CA) et la Taq Polymerase Platinium (Invitrogen, Carlsbad, CA), des amorces complémentaires de régions conservées des cibles virales et du contrôle interne et des sondes d’hydrolyse marquées par des fluorophores : VRS (FAM, BHQ1), IA (Cal Orange, BHQ1), IB (Cal Red, BHQ2) et CI (Q670, BHQ2). Les signaux de fluorescence ont été mesurés pour les cibles VRS, IA, IB et CI sur les canaux 530 nm, 560 nm, 610 nm et 705 nm respectivement.
Tous les échantillons positifs pour le VRS, influenza A, influenza B ont été détectés par le test ProFlu-1 LC avec des valeurs de Ct variant de 13 à 31. Les déterminations de l’espèce virale suivant l’analyse des canaux correspondants étaient en parfaite concordance avec celles attendues. Aucun échantillon n’a été interprété double positif. Aucune amplification n’a été détectée pour les échantillons négatifs ou infectés par des virus para-influenzae. Le temps analytique de la technique était d’environ 80 minutes.
Ces résultats suggèrent que le test ProFlu-1 LC est une technique PCR multiplex rapide et spécifique pour le diagnostic des infections respiratoires à VRS, influenza A ou influenza B. Ces données préliminaires doivent être validées sur des séries prospectives de prélèvements respiratoires.

P118
Détection d’anticorps dirigés contre un peptide synthétique mimant une boucle de la protéine de capside L1 du HPV16 chez des femmes tunisiennes présentant une lésion à HPV

Hassen E¹, Hoebeke J², Briand JP², Kacem R³, Chaieb A³, Khairi H³, Remadi S⁴, Chouchane L¹

¹Laboratoire d’immuno-oncologie moléculaire, Faculté de médecine, Monastir, Tunisie ; ²Institut de biologie moléculaire et cellulaire, CNRS, Strasbourg ; ³Service d’Obstétrique et des maladies féminines, Hôpital Universitaire Farhat Hached, Sousse, Tunisie ; ⁴Laboratoire Cytopath, Sousse, Tunisie
<elham_tn@yahoo.fr>

Les papillomavirus humains (HPV) sont les principaux agents étiologiques du cancer du col utérin. Ce cancer est le deuxième cancer chez la femme, aussi bien au monde qu’en Tunisie. Les méthodes classiques de diagnostic des infections virales sont d’utilisation limitée pour la détection de l’infection à HPV. Ces techniques ne sont pas adaptées aux tests en grande série et il n’existe actuellement aucun test sérologique standardisé pour la détection des anticorps. Le développement de tests sérologiques pour la recherche d’anticorps produits au cours des infections à HPV oncogènes serait d’un grand apport aussi bien pour les études épidémiologiques que pour les études de la réponse au traitement.
Nous nous sommes proposés dans le présent travail d’effectuer une étude séroépidémiologique de l’infection par le HPV16 au sein d’une population de 43 femmes tunisienne présentant des lésions de haut et de bas grade du col de l’utérus. L’étude de la prévalence moléculaire de l’infection à HPV au sein de ce groupe montre que le HPV le plus fréquent est le HPV oncogène de type 16. Ainsi, nous avons recherché par un test Elisa, des anticorps dirigés contre un peptide synthétique, le P3L1/HPV16, mimant une boucle de la protéine de capside L1 qui est une région spécifique du HPV de type 16. Les anticorps recherchés sont d’isotype IgG et IgA au niveau des sérums et des sécrétions des patientes.
Au niveau sérique la fréquence de détection des anticorps (IgG et IgA) anti-P3L1/HPV16 est significativement plus élevée chez les femmes présentant une lésion de haut ou de bas grade (42 %), que chez les femmes contrôles (17 %), ne présentant pas de lésion à HPV (p = 0,003). Au niveau des sécrétions cervicales la fréquence de détection des anticorps est faible et est quasiment identique chez ces deux populations. Les femmes à lésion présentent une faible fréquence d’anticorps sécrétoire par rapport aux fréquences sériques, ce qui pourrait être expliquée par une absence de stimulation antigénique due à la disparition de la protéine L1 avec la progression de la maladie du cancer. L’étude de la fréquence de la séropositivité vis-à-vis de P3L1/HPV16 en fonction du grade de la lésion révèle au niveau sérique une fréquence significativement plus élevée chez les femmes à lésions de bas grade que celles à lésions de haut grade (p = 0,03). L’étude de la fréquence de la séropositivité en fonction de la présence d’ADN de HPV16 au niveau des lésions, révèle que les femmes HPV16 positives ne présentent pas d’anticorps sérique anti-P3L1/HPV16.
La faible fréquence d’anticorps chez les femmes à lésion de Haut Grade en plus de l’absence d’anticorps sérique chez les femmes HPV16-positives suggérerait que le peptide P3L1/HPV16 pourrait être un épitope neutralisant du HPV16.

P119
Développement et validation d’une trousse commerciale en PCR temps réel pour la détection des virus de la grippe de types A et B et l’identification spécifique des isolats H5 positifs

Laue T, Raith S, Cramer SO

Qiagen Hambourg GmbH, Hambourg, Allemagne
<Yann. Louis@qiagen.com>

La grippe demeure un problème majeur de santé publique dans le monde. Les virus de type A ou B sont à l’origine d’infections graves des voies respiratoires supérieures pouvant être fatales, tout particulièrement le virus de la grippe aviaire (H5N1) responsable de plusieurs infections chez l’homme qui pourrait être à l’origine d’une prochaine pandémie associée à une forte mortalité. Le diagnostic de grippe durant la phase initiale de la maladie (jours 1-4) est important dans la cadre d’un traitement antiviral dont l’efficacité est optimale dans les premiers jours de l’infection. Qiagen a développé une trousse RT-PCR en temps réel (artus^® Influenza/H5 LC RT-PCR KIT) pour la détection rapide de tous les virus de types A et B et de l’identification spécifique du type A sous-type H5 à partir d’échantillons cliniques sur le système LightCycler^® (Roche Diagnostics).
La trousse RT-PCR en temps réel contient deux mélanges réactionnels différents. Le premier permet l’amplification et la détection d’une région génomique conservée et présente chez tous les virus de types A et B. Il contient un « contrôle Interne » nécessaire pour vérifier l’efficacité de l’extraction de l’ARN et l’absence d’inhibiteurs de PCR. Le second mélange réactionnel cible une région conservée du H5 et permet la détection spécifique de tous les virus de type A sous-types H5 connus à ce jour. La détection générique des virus de types A et B comme celle plus spécifique des sous-types H5 peuvent être réalisées dans la même série avec le même profile de température.
La sensibilité clinique du système de détection des types A et B a été déterminée rétrospectivement sur 400 écouvillons collectés lors de la dernière saison grippale en Allemagne. Les ARN ont été extraits avec la trousse QIAamp^® Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Allemagne). Pour la détection H5, les souches aviaires de références prélevées entre 1997 et 2005 ont été analysées. Le système H5 a été aussi testé avec un panel de référence de souches non H5. Les réactions croisées ont été analysées à partir d’extraits de pathogènes potentiellement interférents et d’écouvillons testés négatifs pour le virus de la grippe. La sensibilité analytique est déterminée par une série de dilutions de fragments d’ARN transcrits in vitro. La sensibilité clinique et la spécificité du système de détection des types A et B sont respectivement de 91 % et 96 %. Tous les sous-types A et B testés ont été détectés avec la même efficacité. La spécificité du système H5 testée à partir d’extraits ARN\ADN de pathogènes potentiellement interférents et d’écouvillons négatifs pour la grippe est de 100 %. Le système H5 a permis la détection de tous les échantillons H5N1 isolés entre 1997 et 2005.
La trousse Artus^® Influenza/H5 LC RT-PCR KIT est un outil sensible et spécifique pour la détection des virus grippaux A et B et pour l’identification du type A sous-type H5 à partir d’échantillons cliniques.

P120
Contrôle interne pour la détection des norovirus par PCR en temps réel

Scipioni A¹, Bourgot I¹, Ziant D¹, Peeters P¹, Daube G¹, Thiry E¹

¹Service de virologie et pathologie des maladies virales, Département des maladies infectieuses et parasitaires ; ¹Service de microbiologie des denrées alimentaires, Département des sciences des denrées alimentaires d’origine animale, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Liège, boulevard de Colonster, 20, Bât B43b, 4000 Liège
<Alexandra.scipioni@ulg.ac.be>

Les calicivirus de genre norovirus, appartenant à la famille des Caliciviridae, sont responsables chez l’homme de gastroentérites légères très contagieuses, dont la transmission emprunte la voie fécale-orale. Ils sont à l’origine de la part la plus importante des toxi-infections d’origine alimentaire, en particulier dues à la consommation de mollusques bivalves. Les matrices principalement testées pour la détection de ces virus sont donc les matières fécales et les mollusques. C’est la technique moléculaire de RT-PCR qui est la méthode de choix pour leur détection. Afin de vérifier la non-inhibition des enzymes de RT-PCR par un ou plusieurs composés présents dans la matrice alimentaire ou les matières fécales testées, un contrôle interne, constitué d’ARN, a été mis au point et évite les résultats faux négatifs [1]. Ce travail valide son utilisation pour la détection des norovirus dans les échantillons de matières fécales et de mollusques par PCR en temps réel. Le contrôle interne a été employé avec des échantillons de matières fécales issues d’épidémies et de mollusques naturellement contaminés. Il est mélangé au produit d’extraction d’acides nucléiques et une RT-PCR en une étape, utilisant les amorces génériques JV12I et JV13Y [2] dégénérées afin d’augmenter le panel de norovirus détectés, est employée. La méthodologie choisie ici utilise le SYBR green comme agent fluorescent et une courbe de fusion est ensuite réalisée. Celle-ci permet la discrimination entre amplicons possédant une température de fusion différente. Pour notre application, on distingue deux amplicons de taille différentes, ceux dus aux norovirus, de 327 pb (paires de bases), avec une température de fusion de 87 °C et ceux dus au contrôle interne, de 533 pb à 82 °C. Ce contrôle interne permet donc l’utilisation de la PCR en temps réel pour détecter les norovirus, par l’utilisation des amorces présentées, dans les matrices mollusques et matières fécales. En effet, les échantillons donnant des résultats faux négatifs par inhibition des enzymes de RT-PCR sont retestés soit par dilution ou utilisation d’une autre technique d’extraction.
Cette méthode peut être utilisée pour l’analyse de mollusques impliqués dans des épidémies et le contrôle de contaminations virologiques ainsi que dans des matières fécales de patients suspects ou lors d’enquêtes épidémiologiques. Une détection en multiplex avec d’autres pathogènes pourrait être envisagée, comme le virus de l’hépatite A. Ce contrôle interne peut également être utilisé lors de l’extraction de l’acide nucléique viral pour démontrer son efficacité.
1. Scipioni A, Ziant D, Bourgot I, Peeters P, Daube G, Thiry E. Detection of noroviruses, rotaviruses and hepatitis A virus in bivalve molluscs, setting up of an internal control for noroviruses. 8th conference on food microbiology, June 2003.
2. Vennema H, de Bruin E, Koopmans M. Rational optimization of generic primers used for Norwalk-like virus detection by reverse transcriptase polymerase chain reaction. J Clin Virol 2002 : 233-5.

P121
Détection d’Astrovirus dans les selles d’enfants diarrhéiques en Tunisie

Fodha I^1,2, Chouikha A², Peenze I³, De Beer M³, Dewar J³, Geyer A³, Messaadi F⁴, Trabelsi A^1,2, Boujaafar N¹, Taylor MB⁵, Steele D³

¹Laboratoire de bacteriologie-virologie, CHU Sahloul, Sousse, Tunisie ; ²Laboratoire MDT-01, Faculté de pharmacie, Monastir 5000, Tunisie ; 3MRC/Medunsa DPR Unit, University de Limpopo, Afrique du Sud : ⁴Laboratoire d’hygiène, CHU Hedi Chaker, Sfax, Tunisie ; ⁵Département de virologie médicale, Université de Pretoria, Pretoria, Afrique du Sud.
<imenefodhaàlycos. com>

Les diarrhées virales représentent à ce jour une cause incontestable de morbidité et de mortalité infantiles dans le monde entier. Les virus impliqués sont, d’après la littérature les rotavirus, les astrovirus, les adénovirus entériques et les calicivirus. En Tunisie, seules des données concernant l’épidémiologie des infections à rotavirus sont actuellement disponibles. Aucune étude n’a jusqu’ici été réalisée pour rechercher les astrovirus chez les enfants diarrhéiques tunisiens.
Six cent trente huit selles ont été prélevées à partir d’enfants de moins de 5 ans se présentant dans un service de soins hospitaliers du centre-est tunisien pour diarrhée aiguë entre octobre 2002 et septembre 2005. Tous les prélèvements ont été testés par technique immunoenzymatique commercialisée (Dako) pour la détection d’antigènes spécifiques des astrovirus. Les prélèvements positifs en Elisa ont été contrôlés par technique de RT-PCR maison. Résultats : Les Astrovirus ont été retrouvés dans 7,2 % des selles testées par Elisa. La RT-PCR a permis de vérifier cette fréquence relativement élevée sur les selles conservées en 2004 et 2005, mais les conditions de conservation des prélèvements de 2002 et 2003 n’ont pas permis de conserver une intégrité du génome suffisante pour rendre possibles l’amplification génomique.

P122
Evaluation d’une RT-PCR en temps réel pour la quantification des métapneumovirus aviaires (aMPV) et application à l’étude expérimentale de l’excrétion des aMPV de sous-groupe C chez le canard

Toquin D¹, Guionie O¹, Sellal E², Bouley S², Eterradossi N¹

¹Unité de virologie immunologie et parasitologie aviaires et cunicoles (VIPAC), Agence française de sécurité sanitaire des aliments (Afssa), BP53, 22440 Ploufragan ; ²LSI, Laboratoire service international, Le Bois Dieu, 1 bis allée de la Combe, 69380 Lissieu
<d.toquin@ploufragan.afssa.fr>

Les métapneumovirus aviaires (aMPV, famille des Paramyxoviridae, sous-famille des Pneumovirinae) sont responsables d’affections respiratoires et de chutes de ponte, notamment chez la dinde, le poulet, la pintade et le canard. Sur des bases antigéniques et moléculaires, quatre sous-groupes notés A, B, C et D ont été définis, parmi lesquels le sous-groupe C a été récemment mis en évidence chez des dindes et des oiseaux sauvages aux Etats-Unis, ainsi qu’en France chez des canes reproductrices. Le diagnostic des infections par les aMPV est basé soit sur la sérologie qui donne des résultats 2 à 3 semaines après l’infection, soit plus rarement sur des techniques lourdes d’isolement viral. Des techniques rapides de détection et d’identification moléculaires par RT-PCR à l’aide d’amorces oligonucléotidiques communes ou, au contraire, spécifiques des différents sous-groupes ont été décrites. Un développement récent de ces techniques est représenté par la RT-PCR en temps réel, dans laquelle l’accumulation des amplicons au cours des cycles successifs est suivie grâce à l’augmentation de l’intensité d’un signal fluorescent. Cette méthodologie a récemment été appliquée pour le développement du test TaqVetTM Avian Metapneumovirus (AMPV) kit (LSI, Lissieu), dont la capacité à détecter et identifier spécifiquement les différents sous-groupes d’aMPV a déjà été rapportée [Lemière et al., 2005].
Dans le présent travail, les auteurs décrivent la validation du test TaqVetTM Avian Metapneumovirus (AMPV) kit pour la quantification de la charge virale dans des écouvillons trachéaux. Le test a d’abord été utilisé pour analyser des gammes de dilutions préparées soit à partir d’ARN viraux extraits des dilutions décimales de suspensions virales de titre connu, soit à partir d’ARN transcrits in vitro, de quantités connues, dérivés de plasmides dans lesquels les gènes cibles avaient été clonés sous la dépendance du promoteur de l’ARN polymérase T7. Quel que soit le sous-groupe d’aMPV analysé, les résultats ont fait apparaître une bonne reproductibilité et ont révélé une corrélation linéaire très significative entre le signal observé et le nombre de doses infectieuses extraites (linéarité entre 10-1,50-100,50 et 104,50-105,50 DICT50/ml, R2 = 0,979 à 0,997) ou le nombre de copies de matrice (linéarité de 105-106 à 1012 copies par ml, R2 variant de 0,972 à 0,997). Le test a ensuite été utilisé pour quantifier l’excrétion virale trachéale observée après inoculation intra nasale de 103,50 DICT50/sujet d’une souche d’aMPV de sous-groupe C à des canetons de Barbarie exempts d’organismes pathogènes spécifiés (EOPS) maintenus en animaleries protégées. Deux essais ont été réalisés chez 5 puis 20 canetons, chez lesquels des écouvillons trachéaux ont été prélevés à J + 3, J + 5, J + 7 et J + 11 après inoculation. Les écouvillons ont été maintenus dans du milieu de culture, puis l’ARN viral extrait a été analysé à l’aide du kit TaqVetTM Avian Metapneumovirus, en parallèle d’une gamme de référence préparée à partir d’une suspension virale d’aMPV-C de titre connu.
Les résultats de l’essai préliminaire suggèrent une hétérogénéité dans les quantités d’ARN retrouvée chez les différents individus, quelle que soit la date de prélèvement, et un arrêt rapide de l’excrétion entre J + 5 et J + 11. Les résultats du deuxième essai sont en cours de traitement. Bien que tous les sujets se soient avérés excréteurs à J + 3, une variation importante a été de nouveau observée avec des quantités d’ARN récupérées équivalant à 75 à 5 500 DICT50 par sujet. Les résultats complets du suivi seront présentés et discutés. Ils semblent en accord avec les essais d’isolement sur cellules lors d’essais précédents ou de pathologie survenant en élevage. En effet, s’il est possible d’isoler le virus dès l’apparition des symptômes (J + 3), l’isolement plus tardif devient délicat sur un nombre restreint de sujets à partir de J + 5, et quasiment impossible à J + 7 et au delà.
Cette étude préliminaire montre l’intérêt de la PCR quantitative en temps réel pour la quantification de la charge virale dans des écouvillonnages trachéaux réalisés pour l’étude de l’excrétion des aMPV. Le test pourrait être utilisé pour des enquêtes de prévalence virale à plus large échelle en élevage ou sur la faune sauvage, pour étudier la réplication des virus vaccinaux ou sauvages chez des sujets vaccinés ou non, ou pour quantifier l’excrétion virale lors de passage de virus en élevage avant de tenter l’isolement viral.

P123
Etude de l’antigénicité de la protéine VP1 recombinante du virus de la fièvre aphteuse pour la réalisation d’un test de diagnostic sérologique spécifique de type

Breard E¹, Lebreton F¹, Nobiron I², Delmas B², Rémond M¹, Zientara S¹

¹UMR 1161 AFSSA-ENVA-INRA, 23 avenue du Général De Gaulle 94706 Maisons-Alfort Cedex ; ²Unité de recherche de virologie et immunologie moléculaires, INRA, 78350 Jouy-en-Josas
<ebreard@vet-alfort>

La fièvre aphteuse est provoquée par un virus appartenant à la famille des Picornaviridae, genre Aphtovirus. Le virus se présente sous la forme d’une capside de symétrie icosaédrique, (30 nm de diamètre), constituée des protéines VP1 (viral protein 1), VP2, VP3 et VP4. La protéine VP1 est localisée en cinq exemplaires autour des sommets de la capside et présente un déterminant antigénique majeur au niveau d’une boucle (boucle G-H) qui est à la surface de la capside. Les anticorps neutralisants sont dirigés contre cette boucle. Le virus montre une variabilité antigénique importante qui se manifeste par l’existence de sept sérotypes : O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 et Asia 1, ainsi que de nombreux sous-types. Ces sérotypes sont distribués inégalement dans les différentes parties du monde. Il est primordial de typer rapidement le virus prévalent dans un foyer ou une épidémie. Les méthodes d’épidémiologie moléculaire qui sont appliquées font appel aux techniques d’amplification en chaîne (PCR) après rétro-transcription de l’ARN viral et de séquençage d’une partie du gène codant pour la VP1. Des Elisa de capture existent également, utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques de type pour caractériser les isolats viraux.
Concernant le diagnostic sérologique, le test de neutralisation virale permet de distinguer les différents sérotypes. En technique plus rapide, seul un test Elisa de type permet de mettre en évidence les anticorps de type O. Cet Elisa nécessite comme antigène du virus de type O inactivé.
Dans le cadre du projet européen Improcon et dans le but de décentraliser les activités de diagnostic sérologique dans les laboratoires départementaux, nous avons exprimé la protéine VP1 de différents sérotypes du virus de la fièvre aphteuse afin d’étudier leur potentiel antigénique et de réaliser des Elisa spécifiques de type. La protéine VP1 et la séquence de la boucle GH ont également été fusionnées en amont d’une protéine présentatrice d’antigène, la protéine VP4 du virus de la bursite infectieuse aviaire (IBDV). Ces différentes constructions ont été insérées dans un plasmide p28 et exprimées en E. Coli. Après induction de l’expression de ces protéines recombinantes, elles ont été purifiées sur colonne de nickel et des plaques Elisa ont été sensibilisées. A l’aide de sérums de référence, le potentiel antigénique de ces protéines recombinantes a été étudié.
Les résultats montrent que ces protéines recombinantes (VP1 ou épitope) sont des antigènes permettant la discrimination des sérotypes du virus de la fièvre aphteuse et pourraient être utilisées pour des tests de diagnostic.

P124
Développement d’une PCR en temps réel pour la détection et la quantification du génome des 24 sérotypes du virus de la fièvre catarrhale ovine

Sailleau C, Trolle A, Breard E, Zientara S

Unité mixte de recherche en virologie 1161 Afssa-Enva-Inra 7 avenue du Général-De-Gaulle, 94704 Maisons-Alfort
<c.sailleau@afssa.fr>

La fièvre catarrhale ovine, aussi appelée bluetongue est une arbovirose transmise par un moucheron hématophage du genre Culicoïdes. Elle se manifeste cliniquement surtout chez les moutons, rarement chez les bovins et les chèvres et se traduit dans la première espèce par une infection généralisée et grave. Cette maladie réputée légalement contagieuse est inscrite sur la liste A de l’OIE (Office international des épizooties). Depuis sa réapparition en Europe en 1998, 5 sérotypes sur les 24 existants ont été recensés dans de nombreux pays du pourtour méditerranéen. En France, la Corse a été le lieu, depuis 2000, de 4 épizooties impliquant les sérotypes 2, 4 et 16. Le diagnostic de laboratoire est la plupart du temps indispensable pour la confirmation des suspicions cliniques. Le diagnostic par les méthodes dites « conventionnelles » (isolement du virus sur œufs embryonnés et culture de cellules BHK21) nécessite un délai de 15 jours à 1 mois. Depuis plusieurs années, des techniques de RT-PCR ont largement été développées pour palier ce manque de rapidité.
Dans ce travail nous présenterons le développement d’une PCR en temps réel (PCR-Q) pour la détection et la quantification du génome des 24 sérotypes du virus bluetongue. La séquence cible a été choisie après alignement des gènes codant les protéines les plus conservées. Plusieurs couples d’amorces et une sonde TaqManR MGB ont ainsi pu être sélectionnées sur le segment génomique 1 codant l’ARN polymérase VP1. La spécificité de cette PCR a été vérifiée à partir d’ARN extraits d’autres virus du même genre (Orbivirus) : 5 sérotypes du virus de la maladie hémorragique du cerfs (EHDV) et 9 sérotypes du virus de la peste équine (AHSV). La PCR-Q développée a été par la suite testée sur des ARNS extraits de prélèvements biologiques positifs et négatifs (en RT-PCR classique). Enfin le seuil de détection a été estimé à partir d’un ARN standard synthétisé par la transcription (à l’aide de l’ARN polymérase T7) du segment cible amplifié à l’aide d’une amorce sens modifiée par l’ajout en 5’ de la séquence du promoteur T7.

Pathogenèse et virulence

Vendredi 21 avril 2006, 14 h à 15 h 15

Communications orales O125 à O129
Communications affichées P130 à P148

O125
Localisation fine du locus Tmevp3

Mas M¹, Levillayer F¹, Levi-Acobas F¹, Kerzerho J¹, Szatanik M², Brahic M¹, Bureau JF¹

¹Unité des virus lents, ²Unité de génétique des mammifères, Institut Pasteur, Paris
<jfb@pasteur.fr>

La démyélinisation induite par la persistance du virus de Theiler dans le système nerveux central (SNC) de la souris est étudiée comme un modèle de sclérose en laques. La sensibilité à cette infection dépend principalement de la capacité du système immunitaire des souris à contrôler l’infection. Deux locus de sensibilité, Tmevp2 et Tmevp3, ont été localisés à l’extrémité du chromosome 10 murin à proximité du locus Ifng dans un croisemenent entre les souris B10.S et SJL/J. Nous avons décidé de caractériser le locus Tmevp3. Ce locus contrôle non seulement la charge virale à 45 jours p.i. mais aussi le risque de développer une paralysie flasque au cours de la maladie aiguë. Un groupement de cytokines est localisé à l’extrémité télomérique de l’intervalle contenant ce locus. Les trois gènes Tmevpg1, Ifng et Il-Tif/Il-22 de ce groupement de cytokines constituent d’excellents gènes candidats. Différentes analyses génétiques dont l’haplotypage de la région confirme la localisation du locus dans une petite région de 400 kb contenant le groupement de cytokines.
Aucun polymorphisme dans les régions codantes de ces gènes ne peut expliquer l’effet du locus Tmevp3. A l’inverse, des polymorphismes sont retrouvés dans les régions régulatrices (promoteur, CNS, ilots CpG) de ces deux gènes. Des différences d’expression des gènes Tmevpg1, Ifng et Il-Tif/Il-22 ont été mises en évidence dans le SNC au cours de l’infection par le virus de Theiler et ex vivo dans les populations lymphocytaires T CD4 + et CD8 +. L’interferon gamma est exprimé à des taux plus élevés chez les souris résistantes B10.S que chez les souris sensibles SJL/J et l’inverse est vrai pour la cytokine Il22. Des différences d’épissage alternatif ont été mis en évidence pour le gène Tmevpg1. Toutes ces différences dépendent de l’haplotype au locus Tmevp3.
L’ensemble de nos résultats suggère que l’effet du locus Tmevp3 s’explique par des différences d’expression combinées des deux cytokines Ifng et Il22. Ces différences seraient apparues dans deux sous-espèces de souris sous l’action des mutations et de la selection par différents facteurs d’envirronnement comme les infections.

O126
Structure de l’oncogène BARF1 du virus d’Epstein-Barr

Tarbouriech N¹, Ruggiero F², De Turenne-Tessier M³, Ooka T (3), Burmeister W¹

¹Institut de virologie moléculaire et structurale, Grenoble ; ²Institut de biologie et chimie des protéines, Lyon ; ³Laboratoire de virologie moléculaire, Faculté de médecine RTH Laennec, Lyon
<tarbour@embl.fr>

Le virus d’Epstein-Barr est un herpesvirus humain qui infecte de manière permanente plus de 90 % de la population mondiale. Il est surtout associé à de nombreux cancers épithéliaux, principalement le carcinome indifférencié du nasopharynx et le carcinome gastrique. Le gène BARF1 est exprimé dans une forte proportion de ces cancers. Des activités oncogène, mitogène et immortalisante ont déjà été montrée pour BARF1. C’est une glycoprotéine sécrétée. Nous avons résolu la structure de cette forme sécrétée exprimée en cellule humaine par cristallographie aux rayons X à 2,3 A de résolution.
La protéine est composée de deux domaines immunoglobuline (Ig). Le domaine N-terminal appartient à la sous-famille des domaines variables alors que le domaine C-terminal fait partit des domaines constants. BARF1 montre une hexamérisation inhabituelle impliquant deux contacts principaux, l’un entre les domaines C-terminaux et l’autre entre les domaines N-terminaux. Le contact C-terminal à une surface particulièrement importante et étend le sandwich bêta d’une molécule à l’autre. Le contact N-terminal implique les domaines Ig avec une orientation relative inusuelle mais une surface de contact plus classique et plus proche de celle observée pour d’autres interactions entre domaines Ig.
La structure de BARF1 est proche de celle de CD80, ou B7-1, une molécule costimulatrice présente à la surface des cellules présentant les antigènes, et en est probablement dérivée au cours de l’évolution. Néanmoins, l’orientation des domaines et l’oligomérisation diffèrent entre BARF1 et CD80. Il a été montré que BARF1 fixe le CSF1 mais son interaction doit être différente de l’interaction CSF1-récepteur CSF1.

O127
La protéine Tax du rétrovirus HTLV3 est exprimée in vivo et partage des propriétés transcriptionnelles avec la protéine Tax d’HTLV1

Chevalier SA, Meertens L, Pise-Masison C, Calattini S, Park H, Brady JN, Gessain A, Mahieux R
< schevali@pasteur.fr>

Les rétrovirus HTLV et STLV appartiennent au groupe des virus T lymphotropes de primates. Les génomes des virus HTLV1 et HTLV2 codent chacun une protéine transactivatrice (Tax1 et Tax2 respectivement). A la différence de Tax2, Tax1 possède un pouvoir oncogène et est responsable de la transformation des cellules qui l’expriment. Nous avons récemment découvert l’existence d’un nouveau membre de la famille des virus HTLV, HTLV3 [1]. Nous avons détecté la présence d’anticorps anti-Tax3 dans le sérum de l’individu infecté par HTLV3, mais aussi chez certains singes africains porteurs de STLV3, l’équivalent simien d’HTLV3. Nous avons aussi montré que l’ARNm de tax3 était présent dans les PBMC d’un singe infecté par STLV3. Ces résultats démontrent que la protéine Tax3 est exprimée in vivo chez les primates infectés. In vitro, Tax3 présente une localisation intracellulaire principalement nucléaire, similaire à celle de Tax1.
Nos résultats montrent que comme Tax1, Tax3 a la capacité de lier les coactivateurs de la transcription CBP et p300. En utilisant de la protéine Tax3 purifiée, nous avons montré que celle-ci était capable de recruter la machinerie de transcription cellulaire pour réaliser une réaction de transcription in vitro à partir d’une matrice contenant des éléments de réponse à Tax (TRE). Dans tous les types cellulaires testés, Tax3 a la capacité d’activer la transcription de son promoteur viral (HTLV3 LTR) mais aussi des promoteurs hétérologues (HTLV1 et HTLV2 LTR). Tax3 active aussi la voie NFkB. Enfin, nous avons montré que comme Tax1, la partie C-terminale de Tax3 contenait une séquence de liaison aux protéines contenant un domaine PDZ. Ce domaine, qui est absent de Tax2, est sans doute critique pour que Tax1 ait des propriétés transformantes.
Nos résultats démontrent donc que Tax3 est un transactivateur viral exprimé in vivo, et que ses propriétés le rapprochent davantage de Tax1 que de Tax2. Cela suggère la possibilité de l’existence de maladies lymphoprolifératives chez les personnes infectées par HTLV3.

Référence

1. Calattini et al. Retrovirology 2005 ; 2 : 30.

O128
Acides aminés impliqués dans la réduction du pouvoir pathogène d’une souche du virus de la bursite infectieuse aviaire apparentée aux virus hypervirulents

Le Nouen C¹, Rivallan G¹, Toquin D¹, Morin Y², Amelot M², Eterradossi N¹

¹Unité de virologie immunologie et parasitologie aviaires et cunicoles (Vipac) ; ²Service d’élevage et d’expérimentation en pathologie aviaire (Seepa), Agence française de sécurité sanitaire des aliments (Afssa), Ploufragan
<n.eterradossi@ploufragan.afssa.fr>

Le virus de la bursite infectieuse aviaire (IBDV) (Avibirnavirus, Birnaviridae) est un virus non-enveloppé avec pour génome deux segments d’ARN bicaténaire notés A (3,2 kpb) et B (2,8 kpb). Le segment A code une polyprotéine précurseur des protéines structurales (VP2 et VP3) et de la protéase virale (VP4) ainsi qu’une protéine à rôle mal connu, VP5, alors que le segment B code la polymérase virale (VP1). L’IBDV est un pathogène économiquement important pour l’industrie aviaire et notamment pour l’espèce poule Gallus Gallus. Sa distribution est mondiale. Des souches virales hypervirulentes (notées vvIBDV) sont apparues à partir de 1987 et induisent plus de 30 % de mortalité. Le segment A occupe une place prépondérante dans le pouvoir pathogène de ces souches, mais il a été démontré que VP2 n’était pas le seul déterminant de la virulence. De récents travaux suggèrent que le segment B occupe une place non négligeable dans le pouvoir pathogène. Malgré ces récents progrès, les bases moléculaires du pouvoir pathogène de l’IBDV sont encore méconnues.
Les travaux antérieurs du laboratoire ont permis d’identifier une souche d’IBDV dont les segments génomiques A et B sont phylogénétiquement reliés aux souches hypervirulentes mais qui néanmoins induit peu de morbidité et pas de mortalité. Afin de déterminer les bases moléculaires impliquées dans la réduction du pouvoir pathogène de cette souche, nous avons développé pour celle-ci un système de génétique inverse selon le principe mis au point pour l’IBDV [Mundt et Vakharia, 1996]. Nous avons donc déterminé puis confirmé par transcription inverse – réaction de polymérisation en chaîne puis séquençage nucléotidique la séquence complète des segments génomiques A et B de la souche étudiée. Nous avons ensuite cloné ces deux segments dans des plasmides contenant le promoteur T7 en amont de l’insert et un site de linéarisation à son extrémité 3’. Les ARN transcrits in vitro à partir des plasmides contenant les segments A et B ont été transfectés à des fibroblastes d’embryon de poulet, et – la souche virale étudiée n’étant pas adaptée à la culture cellulaire – le surnageant des fibroblastes transfectés a ensuite été inoculé par voie intramusculaire à des poulets exempts d’organismes pathogènes spécifiés (EOPS). Quatre jours après inoculation, le virus régénéré a été récolté dans la bourse de Fabricius (organe de réplication de l’IBDV) des poulets injectés.
Le pouvoir pathogène in vivo et l’antigénicité du clone moléculaire de la souche étudiée ont été comparés à ceux de la souche virale parentale dans des conditions expérimentales standardisées : le clone moléculaire s’est avéré présenter le même phénotype que son virus parental. Les séquences des deux segments génomiques de cette souche ont alors été comparées avec les séquences consensus dérivées de 4 souches vvIBDV au pouvoir pathogène clairement établi. Une, 5 et 3 mutations ont été mises en évidence dans respectivement la région non codante (RNC) 5’, la RNC 3’ et la région codante du segment A. Cinq mutations dans la région codante du segment B de 94432 ont également été identifiées. Le rétablissement par mutagénèse dirigée de la séquence consensus des vvIBDV dans tout le segment A, puis la régénération de particules virales avec le segment B non modifié, ont permis de rétablir au moins partiellement le pouvoir pathogène (100 % de morbidité et 10 % de mortalité). Afin de préciser quelle région du segment A était impliquée dans la réduction du pouvoir pathogène, trois plasmides ont alors été construits dans lesquels uniquement la RNC 5’, la RNC 3’ ou la région codante ont été corrigées. La régénération de virus recombinants à partir de ces segments A modifiés et du segment B original, suivie de l’évaluation in vivo du pouvoir pathogène de ces virus recombinants, révèle que les mutations présentes dans la région codante sont responsables de la réduction du pouvoir pathogène du virus étudié. La position et les mécanismes par lesquels ces mutations peuvent influencer le pouvoir pathogène seront discutés.

O129
Un alphavirus recombinant de salmonidé est totalement atténué et protecteur chez la truite

Moriette C, Leberre M, Lamoureux A, Lai TL, Brémont M.
< michel.bremont@jouy.inra.fr>

Le virus de la maladie du sommeil (VMS) est un membre du nouveau genre des Alphavirus de Salmonidés, au sein de la famille des Togaviridae. Son génome à ARN simple brin positif est de 11 894 nucléotides. Un ADNc complet a été généré, fusionné à un ribozyme ’hammerhead’ en 5’ et inséré dans un vecteur de transcription pcDNA3 donnant le pVMS. Du virus recombinant rVMS a été produit par transfection du pVMS dans des cellules de poissons. La récupération de virus recombinant a été démontrée par des tests d’immunofluorescence et par la présence d’un tag dans le génome du rVMS. Cet ADNc infectieux a été exploité pour différentes applications. Ainsi, l’impact de mutations ciblées dans nsP2 sur le cycle de réplication du rMVS viral a été étudié. Parmi ces mutations, un changement I vers V (position 435) n’a pas d’effet notable sur la réplication et la transcription du génome mais diminue considérablement l’empaquetage du génome dans la particule virale. La pathogénicité du rVMS a été évaluée chez la truite. Alors que le virus sauvage tue 80 % des truitelles en 2 mois, nous montrons que le rVMS est totalement atténué. Lorsque ces truites infectées par le rVMS ont été confrontées à une épreuve avec le virus sauvage, une protection à long terme (> 7 mois) est démontrée. Un variant thermorésistant (14 °C au lieu de 10 °C) du rVMS a été produit et s’est avéré être pathogène chez la truite. Le séquençage du génome de ce variant rVMS14 par comparaison avec le rVMS10 et le virus sauvage, a mis en évidence plusieurs changements d’acide aminé dans la polyprotéine structurale et en particulier dans les deux glycoprotéines externes E2 et E1 et dans la protéine 6K. Certains de ces changements sont probablement impliqués dans la pathogénicité.

P130
La gravité de la dengue est-elle liée au sérotype viral ?

Thomas L¹, Carmes S¹, Cabie A², Lagathu G³, Plumelle Y⁴, Césaire R³ et les médecins du SAU¹

¹Service d’accueil des urgences, ²Service des maladies infectieuses et tropicales, ³Laboratoire de Virologie, ⁴Laboratoire d’hématologie, CHU, 97200 Fort-de-France
<laurent.thomas@chu-fortdefrance.fr>

Une épidémie de dengue est survenue en Martinique en juin 2005, caractérisée par la cocirculation des sérotypes DEN2 et DEN4. Une étude publiée dans le bulletin d’alerte et de surveillance Antilles Guyane (n° 11, août 2005, http ://www.martinique.sante.gouv.fr/) a révélé que la prévalence de la dengue de sérotype DEN4 était prédominante (70 % des cas de dengue) mais que les patients infectés par le sérotype DEN2 étaient plus souvent hospitalisés que les patients infectés par le sérotype DEN4 (taux d’hospitalisation respectifs de 81 % et 19 % ; p < 0,001). La présente étude a pour but de déterminer si une gravité particulière était reliée à un sérotype viral.
La population étudiée est une cohorte des patients admis aux urgences entre le 1^er juin et le 30 novembre 2005 et qui présentaient des signes et symptômes compatibles avec une fièvre dengue. Parmi ceux-ci n’ont été inclus dans cette étude que les patients pour lesquels la détection de génome viral de la dengue par RT-PCR était positive pour le sérotype DEN4 (48 patients) et pour le sérotype DEN2 (29 patients). Deux autres patients étaient positifs pour le sérotype DEN3 et n’ont pas été inclus. Pour chaque patient, un questionnaire dédié aux signes et symptômes de la dengue était renseigné dans le dossier médical informatisé dès l’admission aux urgences et un bilan sanguin était réalisé. L’analyse a porté sur les données recueillies le jour de la consultation aux urgences en comparant les patients des sérotypes DEN2 et DEN4. Les comparaisons statistiques ont été réalisées selon les cas avec le test U de Mann-Whitney ou le test exact de Fisher. Les moyennes sont présentées avec leur écart-type.
La moyenne d’âge (36 +/- 17 ans) et la prépondérance du sexe féminin (58,4 %) ne différaient pas entre les deux groupes. Le délai moyen entre le jour d’apparition de la fièvre et la consultation aux urgences était < 2 jours, plus court dans le groupe DEN4 (1,1 +/- 1,5 jour) que dans le groupe DEN2 (1,9 +/- 1,5 jour ; p < 0,01). La fréquence des signes évocateurs de dengue (céphalée, fièvre, douleurs, rash cutané) était identique dans les deux groupes. Des douleurs épigastriques et de l’hypochondre droit, des vomissements et une intolérance alimentaire totale étaient présents chez 72,4 % des patients DEN2 et 43,8 % des patients DEN4 (p < 0,02). La forme clinique de fièvre dengue non compliquée était observée chez 93,8 % des patients DEN4 et chez 51,7 % des patients DEN2 (p < 0,001). Des éléments de sévérité clinique (associant à des degrés divers syndrome confusionnel, hypotension, déshydratation, SGOT ou CPK > 10 fois le taux normal, plaquettes < 50 000 G/L avec ou sans syndrome hémorragique) étaient observés chez 3 patients DEN4 et chez 11 DEN2. Une gravité menaçant d’emblée le pronostic vital était observée chez 3 autres patients DEN2 : hémorragie cérébroméningée (1 cas), hépatite fulminante (1 cas), choc septique par cholécystite gangréneuse alithiasique (1 cas). Le taux moyen de plaquettes sanguines était de 120 +/- 66 G/L dans le groupe DEN2 et de 171 +/- 58 G/L dans le groupe DEN4 (p < 0,01, taux normal> 140 G/L). Le taux moyen de transaminases SGOT était de 810 +/- 2900 U/L dans le groupe DEN2 et de 50 +/- 41 U/L dans le groupe DEN4 (p < 0,01, taux normal < 37 U/L). Le taux moyen de CPK était de 1955 +/- 2484 U/L dans le groupe DEN2 et de 226 +/- 480 U/L dans le groupe DEN4 (p < 0,01, taux normal < 190 U/L). Le taux d’hospitalisation à l’issue de la consultation aux urgences était de 55,2 % dans le groupe DEN2 et de 22,9 % dans le groupe DEN4 (p < 0,01). Les 3 patients gravement atteints d’emblée sont ultérieurement décédés en moins d’une semaine, tous les autres ont évolué favorablement.
En Martinique, lors de l’épidémie de dengue débutée en juin 2005, le risque de développer une forme grave ou sévère de dengue était plus important avec le sérotype DEN2 qu’avec le sérotype DEN4 (risque relatif = 7,7 ; intervalle de confiance 95 % : 3,1 – 19,3).

P131
ADN VIH1 et VIH2 dans la phase précoce de l’infection : quantification in vitro par PCR en temps réel en utilisant un plasmide combiné VIH1 + VIH2

Gueudin M, Plantier JC, Braun J, Simon F

Unité de virologie, GRAM IFR23, CHU C. Nicolle, Rouen
<mariegueudin@yahoo.fr>

Les charges virales plasmatiques observées chez les patients infectés par un VIH de type 2 sont significativement inférieures à celles observées lors de l’infection par un VIH de type 1. Notre objectif est d’étudier les premières étapes de l’infection lors de la réplication in vitro du VIH1 et du VIH2.
Pour mesurer la production d’ADN VIH1 et VIH2 pendant la phase précoce de l’infection in vitro, nous avons produit un plasmide standard intégrant de l’ADN VIH1 et VIH2. Deux fragments de la région LTR des VIH1 et VIH2 ont été liés à l’aide d’amorces recouvrant en partie chaque fragment à lier puis l’ensemble a été intégré dans un plasmide pCR 2,1-TOPO. Les TCID50 de surnageants de culture VIH1 NL4-3 et VIH2 ROD utilisés pour l’inoculation ont été déterminées. Des cellules ont été infectées avec 500 TCID50 de VIH1 NL4-3 ou 500 TCID50 de VIH2 ROD. Les cultures ont été réalisées sur PBMC de 3 donneurs de sang différents et sur deux lignées cellulaires : MT4-CXCR4 et Hela-P4-CCR5. La réinfection ultérieure par de nouveaux virions formés a été empêchée par du saquinavir et la cinétique de production d’ADN a été évaluée à 6, 24, 48 et 72 heures post-infection. ADN VIH1 et VIH2 ont été quantifiés par PCR en temps réel en utilisant le plasmide VIH1/VIH2 comme standard. Les résultats sont exprimés en log du nombre de copies d’ADN VIH/μg l’ADN total extrait.
Des différences importantes dans la production d’ADN ont été enregistrées entre les deux types de VIH bien que des doses infectieuses équivalentes aient été utilisées. À 6 heures post-infection, quelles que soient les cellules, la quantité d’ADN obtenue avec VIH2 ROD (2,0 log) a été 2 Log plus basse que la quantité obtenue avec VIH-1 NL4-3 (4,0 log). Cette différence reste observée durant toute la cinétique en dépit d’une augmentation faible de l’ADN VIH2 entre 24 et 72 heures. Ces résultats sont indépendants des donneurs de PBMC. Les résultats sont strictement semblables sur MT4-P qui n’exprime pas le corécepteur CCR5 et sur les cellules HeLa-P4-CCR5 qui expriment le CCR5 et le CXCR4.
Nous avons observé une différence importante in vitro entre la production d’ADN VIH1 et VIH2 pendant la première partie de l’infection. La quantification par des PCR en temps réel utilisant un plasmide contenant les séquences amplifiées VIH1 et VIH2 nous permet une comparaison parfaite entre les deux types de VIH, évitant des différences artificielles liées à l’amplification. L’ADN synthétisé dépend de la disponibilité de l’ARN du VIH dans la cellule et/ou de l’efficacité de la transcription inverse de cet ARN viral. Notre expérience ne nous permet pas de déterminer si seulement une ou si les deux étapes sont déficientes pour VIH2 mais il donne une voie sérieuse pour expliquer plus complètement la physiopathologie de l’infection.

P132
Localisation des zones génomiques impliquées dans la recombinaison chez un alphaherpèsvirus, l’herpèsvirus bovin 1

Muylkens B¹, Keil G², Meurens F, Schynts F³, Dams L¹, Thiry E¹

¹Département des maladies infectieuses et parasitaires, laboratoire de virologie, faculté de médecine vétérinaire, université de Liège, Belgique ; ²Institut Friedrich Loeffler, Centre de recherche fédéral des maladies virales animales, Greifswald-île de Riems, Allemagne ; ³Division de virologie animale, CERgroup, Marloie, Belgique
<bmuylkens@ulg.ac.be>

La recombinaison est une caractéristique importante du cycle de multiplication des herpèsvirus dont le génome est constitué d’une molécule linaire d’ADN double brin. Chez les génomes de classe D dont font partie le virus de la varicelle et du zona et l’herpèsvirus bovin 1 (BoHV1), deux répétitions directes inversées, l’une interne et l’autre terminale délimitent deux segments uniques, l’un long (UL) et l’autre court (US). Par recombinaison homologue entre les séquences répétées inversées, des inversions de l’orientation des séquences uniques se produisent au cours de la réplication de l’ADN. Il a été démontré chez différents alphaherpèsvirus que les intermédiaires de réplication (concatémères) présentaient des quantités équimolaires des quatre orientations relatives possibles des segments UL et US adjacents [1]. À la lumière de ces résultats, la recombinaison se produirait de manière prépondérante à la jonction des sous-unités UL-US des alphaherpèsvirus. Afin de confirmer la localisation de ce point chaud de recombinaison, deux approches expérimentales ont été développées en utilisant le BoHV1 comme modèle. La première repose sur la caractérisation phénotypique et quantitative des virus de nouvelle génération issus de trois situations de co-infection. Les BoHV1 parentaux sont porteurs chacun d’une délétion dans un gène codant pour une glycoprotéine non essentielle (gC/UL44, gM/UL10 et gE/US8). La fréquence élevée de virus recombinants obtenus au sein de l’UL démontre que la recombinaison n’est pas confinée à la jonction UL-US. Afin d’éviter le biais lié aux délétions utilisées comme marqueurs de recombinaison et dans une perspective de définition plus fine des points de crossing-over, une deuxième approche a été envisagée. Elle repose sur la détection de polymorphisme nucléotidique isolé (single nucleotide polymorphism, SNP) entre différentes souches du BoHV1. Le suivi de ces SNP chez les virus de nouvelle génération clonés à partir des surnageants de co-infections réalisées in vitro permet d’établir une carte de recombinaison du BoHV1.

Référence

1. Schynts F, McVoy MA, Meurens F, Detry B, Esptein AL, Thiry E. The structures of bovine herpesvirus 1 virion and concatemeric DNA : implications for cleavage and packaging of herpesvirus genomes. Virology, 2003 ; 314 : 326-35.

P133
La colocalisation de la protéine de capside du VHC et des gouttelettes lipidiques intracellulaires est indépendante du génotype ou du caractère stéatogène du VHC

Piodi A¹, Chouteau P¹, Christov C², Hezode C³, Pawlotsky JM¹

¹Laboratoire de virologie, Inserm U635, hôpital Henri-Mondor, Université Paris XII, Créteil ; ²Plateforme d’imagerie IM3, Faculté de Médecine, Créteil ; ³Service d’Hépato-gastro-entérologie, hôpital Henri-Mondor, Créteil
<aurelie.piodi@hmn.aphp.fr>

La stéatose hépatocytaire est caractérisée par l’accumulation intracellulaire de triglycérides. C’est une lésion fréquente au cours des hépatites chroniques C, où elle peut être sévère et semble être un cofacteur de progression de la maladie hépatique. Il existe en fait deux types de stéatoses au cours de l’hépatite chronique C : l’une associée au génotype 1, non induite par le virus et observée chez des malades ayant des facteurs métaboliques de stéatose ; l’autre, associée au génotype 3, qui est une lésion cytopathique d’origine virale. Le rôle de la protéine de capside du VHC dans l’induction de la stéatose viro-induite a été suggéré in vitro, du fait d’une colocalisation de la protéine de capside et des gouttelettes lipidiques intracellulaires dans le compartiment cytoplasmique. Cependant, ces travaux ont été réalisés à partir de séquences de capsides de génotype 1, génotype non stéatogène in vivo.
Le but du travail était d’étudier la colocalisation de la protéine de capside du VHC et des gouttelettes lipidiques intracellulaires en fonction du génotype et de la présence d’une stéatose viro-induite in vivo. La séquence des variants majoritaires codant la protéine de capside du VHC a été isolée du sérum de 3 groupes de patients : 4 patients infectés par un VHC de génotype 3a avec une stéatose hépatocytaire viro-induite (sans facteurs métaboliques de stéatose) ; 4 patients infectés par un VHC de génotype 3a sans stéatose ; 4 patients infectés par un VHC de génotype 1b sans stéatose. Les séquences codant la protéine de capside ont été exprimées en cellules Huh7 et leur expression a été recherchée par IF directe. Les gouttelettes lipidiques ont été visualisées soit par IF indirecte grâce à un anticorps monoclonal dirigé contre l’ADRP (adipose differentiation-related protein), protéine associée aux gouttelettes lipidiques, soit par coloration au Bodipy 493/503, marqueur des lipides neutres contenus dans les gouttelettes lipidiques. L’analyse microscopique confocale et les reconstructions 3D ont été utilisées pour localiser protéines de capside et gouttelettes lipidiques intracellulaires.
Le marquage par IF des protéines de capside et des gouttelettes lipidiques a révélé des structures annulaires intracytoplasmiques et ce, quel que soit le génotype du VHC et, pour le génotype 3, que le virus soit stéatogène in vivo ou pas. La microscopie confocale et la coloration au Bodipy ont également révélé l’expression de chacune des protéines de capsides issues des patients des 3 groupes à la surface des gouttelettes lipidiques.
Ce travail : 1) confirme la colocalisation de la protéine de capside du VHC de génotype 1 (génotype non stéatogène) et des gouttelettes lipidiques en culture cellulaire hépatocytaire ; 2) démontre la colocalisation des protéines de capside de génotype 3 et des gouttelettes lipidiques, et ce en présence ou en l’absence d’induction in vivo de la stéatose par les souches de VHC correspondantes. Ces résultats ne sont pas en faveur d’un rôle de la localisation de la protéine de capside à la surface des gouttelettes lipidiques dans la survenue de la stéatose viro-induite par le VHC.

P134
Développement d’un système cellulaire permettant l’étude des modalités traductionnelles de l’IRES du VHC

Lourenco S¹, Boni S¹, Mangeot PE², Cahour A¹

¹Cervi (virologie), Upres EA 2387, IFR113 Immunité et infection, G.H Pitié-Salpêtrière, Paris ; ²Laboratoire de vectorologie rétrovirale et thérapie génique, IFR128 BioSciences Lyon-Gerland, École normale supérieure, Lyon.
<sofiacdslourenco@yahoo.fr>

Le virus de l’hépatite C (VHC) est l’agent majoritairement responsable des hépatites chroniques, évoluant dans la plupart des cas vers un carcinome hépatocellulaire. Plus de 170 millions d’individus de la population mondiale sont infectés, ce qui représente un problème important de santé publique. Puisqu’il n’existe toujours pas de vaccin et que les traitements antiviraux actuellement utilisés ont une efficacité limitée, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques reposant sur l’approfondissement des connaissances des différentes étapes du cycle viral, notamment la traduction de l’ARN génomique.
La région 5’non codante (5’NC) du génome viral fonctionne comme une séquence d’entrée interne des ribosomes (IRES) de façon coiffe indépendante. Elle est constituée de domaines structurés en tiges-boucles permettant la fixation des ribosomes à proximité du codon d’initiation par l’interaction avec le facteur d’initiation eIF3. Ce mécanisme, différent de celui de la plupart des ARN messagers cellulaires, et la conservation de la séquence nucléotidique de la région 5’NC entre les différents génotypes du VHC, font de l’IRES une cible antivirale privilégiée. Nous disposons actuellement d’un système bicistronique contenant le promoteur du bactériophage T7, et deux gènes rapporteurs de la luciférase entre lesquels est insérée la séquence IRES du VHC. La luciférase F (Fluc = Firefly) est exprimée de façon coiffe-dépendante et la luciférase R (RLuc = Renilla), sous la dépendance de l’IRES du VHC. Le rapport entre les activités luminométriques de RLuc/FLuc représente l’activité relative de l’IRES. Ce système nous permet d’étudier in vitro, après transcription et traduction en lysats de réticulocytes de lapin : 1) l’activité traductionnelle de différents variants de l’IRES du VHC, et 2) les modulations de cette activité sous l’effet de facteurs cellulaires ou viraux, ainsi que celui d’inhibiteurs potentiels de la traduction.
Notre objectif étant de mettre en place un modèle d’étude capable de mesurer l’activité traductionnelle de l’IRES du VHC dans un contexte cellulaire suffisamment proche de celui de l’infection, nous avons opté pour une stratégie différente du système précédemment décrit. En effet, celui-ci, bien qu’utilisable ex vivo du fait de la présence du promoteur CMV, s’est révélé impropre à refléter l’activité traductionnelle effective de l’IRES du fait de l’observation d’une activité promotrice d’une partie de la région 5’NC du VHC sous forme ADN. Nous avons donc développé un système cellulaire éliminant l’étape nucléaire du vecteur rapporteur afin de supprimer toute activité promotrice de l’IRES du VHC. Il consiste à exprimer de façon constitutive l’ARN polymérase T7, permettant ensuite l’expression du vecteur rapporteur contenant le promoteur T7 dans le cytoplasme, après transfection sous forme d’ADN. Ce système présenterait deux avantages : 1) éviter la co-infection avec le virus vaccine vTF7-3 vaccine et par conséquent le stress cellulaire provoqué par une infection virale, et 2) la transfection par un ARN coiffé et polyadénylé.
Une variante de cette stratégie a consisté à exprimer constitutivement l’ARN polymérase T7 en présence du gène rapporteur de l’EGFP dans un système bicistronique, de façon à faciliter le clonage de la lignée établie exprimant l’enzyme par analyse en Facs. Ce système est validé par l’étude de l’activité de mutants connus de l’IRES du VHC et de l’effet modulateur de certains agents antiviraux tels que les interférons. Il est proposé pour tester d’autres inhibiteurs potentiels spécifiques de l’IRES du VHC, et peut en outre être utilisé comme outil de substitution du système vaccine VTF7-3 pour l’expression de gènes sous le contrôle du promoteur T7.

P135
Augmentation de la réplication du VIH dans le réservoir génital féminin au cours des ulcérations herpétiques génitales

Le Goff J¹, Bouhlal H¹, Grésenguet G³, Weiss H², Khonde Z⁴, Chemin C¹, Malkin J¹, Pepin J⁴, Mayaud P⁵, Belec L¹

¹Inserm U743, Paris ; ²LSHTM, London, United Kingdom ; ³CNRMST, Bangui, Central African Republic ; ⁴WAPTCAS, Accra, Ghana ; 5LHSTM, London, United Kingdom
<jerome. le-goff@egp.ap-hop-paris.fr>

De nombreuses données biologiques et épidémiologiques indiquent que le virus herpes simplex de type 2 (HSV2) est un cofacteur majeur de l’acquisition sexuelle du VIH. En revanche l’impact du rôle du HSV2 dans la facilitation de la transmission génitale du VIH est moins argumenté. Il a été observé chez des femmes présentant une réactivation asymptomatique du HSV2 une corrélation positive entre les quantités d’ARN VIH1 et ADN HSV2 dans les sécrétions cervicovaginales. Il a aussi été rapporté l’observation de charges virales VIH élevées dans des ulcérations herpétiques masculines. Ces données suggèrent que le virus HSV2 peut accroître l’infectivité génitale du VIH. Toutefois, il n’est pas déterminé si des ulcérations herpétiques influencent la réplication VIH uniquement au niveau lésionnel ou aussi au niveau de tout le réservoir viral du tractus génital.
Nous avons évalué la réplication du VIH (ARN et ADN) et du HSV2 par PCR en temps réel quantitative dans les sécrétions cervicovaginales de 154 femmes souffrant d’ulcérations génitales au Ghana et en République centrafricaine. Le diagnostic de l’ulcération herpétique a été réalisé sur un écouvillonnage de la lésion par PCR en temps réel.
La prévalence des infections VIH et HSV2 étaient de 44 et 77 %. Les femmes séropositives pour le VIH étaient significativement plus fréquemment infectées par le HSV2 que les femmes séronégatives pour le VIH (95 versus 59 %, p < 0,01), et les femmes séropositives pour le HSV2 étaient plus fréquemment infectées par le VIH que les femmes séronégatives pour le HSV2 (57 versus 7 %, p < 0,01). Parmi les femmes séropositives pour le HSV2, celles infectées par le VIH avaient deux fois plus fréquemment un portage génital en HSV2 (71 versus 29 %, p < 0,01). Parmi les 57 femmes séropositives sécrétant du HSV2, les quantités d’ADN HSV2 dans les sécrétions génitales ne différaient pas significativement entre les femmes séropositives et séronégatives pour le VIH (5,7 log copies/ml versus 5,4 log copies/ml, p = 0,44). Parmi les 58 femmes co-infectées par le VIH et le HSV2, celles avec une ulcération herpétique étaient plus susceptibles d’avoir une réplication VIH génitale que les femmes ne réactivant pas le HSV2 (30/41 [73 %] versus 7/17 [41 %], p < 0,01), et la moyenne de charge virale génitale en ARN VIH1 était significativement plus élevée chez les femmes sécrétant le HSV2 (4,5 log copies/ml) que chez celles ne le sécrétant pas (3,1 log copies/ml, p = 0,01). Chez les 31 femmes qui présentaient une réplication génitale des deux virus, une corrélation significative a été observée entre les quantités d’ARN VIH1 et ADN HSV2 (Spearman’s rank correlation r = 0,43, p = 0,04). En revanche, nous n’avons observé de différence significative entre les femmes avec et les femmes sans ulcération herpétique ni pour l’ARN VIH1 plasmatique (5,1 versus 5,6 log copies/ml, p = 0,5) ni pour l’ADN VIH1 proviral génital (2,8 versus 2,1 log copies/106 cellules, P = 0,1).
Ces observations sont les premières issues d’une cohorte prospective d’ulcérations génitales. Les résultats suggèrent que la réplication du virus HSV2 est associée à l’augmentation de l’infectivité génitale du VIH en multipliant par un facteur 10 la charge virale ARN. Des données issues de cohorte de femmes présentant des réactivations génitales herpétiques asymptomatiques montraient une augmentation plus faible de l’ARN VIH, d’environ un facteur 2,5. Ces données soutiennent l’hypothèse de l’utilisation aciclovir chez les femmes avec une ulcération génitale herpétique comme stratégie de réduction de l’infectiosité VIH.

P136
Caractéristiques biologiques in vitro des souches d’herpèsvirus bovin 1 circulant en Belgique

Kirten P, Muylkens B, Thiry J, Thiry E

Laboratoire de virologie, Département des maladies infectieuses et parasitaires, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Liège, 4000 Liège, Belgique.
<Philippe.Kirten@ulg.ac.be>

L’herpèsvirus bovin 1 (bovine herpesvirus 1, BoHV1) est responsable de la rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR). Il est également à l’origine de lourdes pertes économiques suite aux restrictions du commerce international imposées par les pays indemnes de l’infection. En Belgique une séroprévalence de 35.9 % a été mesurée au sein de la population des animaux non vaccinés durant la saison d’hiver 1997-1998 [1], la Belgique se classant ainsi parmi les pays européens où la séroprévalence est la plus élevée. Dans ce cadre, une analyse de la virulence des souches de BoHV1 circulant actuellement en Belgique a été entreprise. Pour ce faire, une banque de souches de terrains isolées en Belgique a été créée et une étude de leurs caractéristiques biologiques a été entreprise. Quatre critères de virulence ont ainsi été retenus, à savoir : le titre des clones amplifiés, la taille des plages de lyse, les courbes de multiplication virale et l’analyse par profil de restriction. Une étude clinique rétrospective a été menée en parallèle afin de quantifier les signes cliniques des animaux sur lesquels les souches ont été isolées et de corréler les résultats à ceux obtenus en laboratoire.

1. Boelaert P, Biront P, Soumare B, et al. Prevalence of bovine herpesvirus-1 in the Belgian cattle population. Prev Vet Med 2005 : 285-95.

P137
Tropisme extra-hépatique du virus de l’hépatite B

Belkhiri D, Mackiewicz V, Dussaix E, Ferey MP, Beaulieux F, Roque-Afonso AM

Virologie, hôpital Paul Brousse, Inserm CHB, Villejuif
<anne-marie.roque@pbr.ap-hop-paris.fr>

Le virus de l’hépatite B (VHB) a un tropisme hépatocytaire cependant la présence de l’ADN viral dans les cellules circulantes a déjà été montrée. Cette forme extra-hépatique pourrait avoir un rôle dans la persistance virale et être un réservoir secondaire.
Neuf patients ont été étudiés : trois porteurs chroniques et une infection aigüe (six échantillons AgHBs positifs), trois transplantés hépatiques sous immunoglobulines anti-HBs, une infection résolutive (anti-HBc positif) et un témoin non VHB (cinq échantillons AgHBs négatifs). Les cellules mononucléées du sang périphérique ont été isolées sur gradient de Ficoll. Les sous populations CD19+, CD14+, CD8+ et CD4+ ont été séparées par tri cellulaire immunomagnétique positif. L’ADN du VHB a été recherché par amplification de la région S, et analysé par séquençage. Les charges virales sériques et cellulaires ont été déterminées par PCR quantitative en temps réel (région préC).
Les charges virales des six échantillons AgHBs positifs étaient comprises entre 1,34 × 10⁴ et 7,22 × 10¹⁵ cp/ml. Chez les patients ayant une charge virale sérique élevée, l’ADN viral était détectable dans trois ou quatre compartiments cellulaires avec des valeurs inférieures à 1 cp/10⁶ cellules. L’ADN viral cellulaire était indétectable chez deux patients AgHBs + avec des charges virales inférieures à 2 × 10⁴ cp/ml et dans tous les échantillons AgHBs négatifs. Dans un cas, les séquences majoritaires de l’AgHBs (positions 79 à 198) ont pu être analysées, montrant l’existence de 1 à 4 mutations entre sérum et compartiments cellulaires. Cela suggère pour cette région de l’AgHBs exposée à la réponse immunitaire, des antigénicités très différentes selon le compartiment.

P138
Transfection d’un clone viral infectieux du circovirus porcin de type 2 : influence de la voie d’inoculation

Grasland B, Blanchard P, Oger A, Bigarre L, Loizel C, Cariolet R, Jestin A

Agence française de sécurité sanitaire des aliments, Unité de génétique virale et biosécurité, Les Croix, BP 53, 22440 Ploufragan
<b.grasland@ploufragan.afssa.fr>

Le circovirus porcin de type 2 (PCV2) est l’agent étiologique de la maladie d’amaigrissement du porcelet (MAP). Sa réplication en culture cellulaire est faible rendant difficile la production d’un inoculum infectieux. Pour pallier cette difficulté, une stratégie utilisant un clone infectieux de PCV2 a été élaborée. Il a été montré que ce clone était infectieux lorsqu’il était injecté par voie intramusculaire. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo l’efficacité de la transfection de ce clone infectieux chez des porcelets selon différentes voies d’inoculation : intramusculaire, intratrachéale et oronasale.
Trente-cinq porcelets exempts d’organismes pathogènes spécifiés (EOPS) âgés de sept semaines sont répartis en quatre lots, le premier servant de témoin. Dans les trois autres groupes, chaque animal reçoit 400 μg d’ADN génomique de PCV2 cloné en tandem. L’ADN est inoculé dans les groupes 2, 3 et 4, par voies intramusculaire (IM), intratrachéale (IT) et oronasale (ON) respectivement. Dans ces trois derniers groupes, un porcelet est sacrifié avant l’inoculation. Puis deux porcelets par groupe sont euthanasiés à 13 jours post-transfection (jpt) et également à 23 jpt. Les températures rectales des porcelets et les signes cliniques sont enregistrés jusqu’à 34 jpt. Des échantillons de tissus (organes lymphoïdes, poumons et foie) sont prélevés à l’autopsie. La séroconversion des porcelets vis-à-vis du PCV2 est suivie par un test Elisa. Le nombre de copies de génomes de PCV2 ainsi que le nombre de particules infectieuses sont évalués par PCR quantitative en temps réel et par IPMA en culture cellulaire.
1) Aucun signe clinique n’est relevé tout au long de l’étude à l’exception d’une diminution significative du gain de poids moyen quotidien chez les animaux transfectés par voies IM et ON au cours de la seconde semaine post-transfection.
2) A l’autopsie, aucune lésion macroscopique n’est observée quelle que soit la voie de transfection utilisée, à l’exception d’une légère hypertrophie des ganglions trachéobronchiques dans les trois lots.
3) Les premières séroconversions vis-à-vis du PCV2 apparaissent à 20 jpt dans les trois lots. La semaine suivante, tous les porcelets transfectés par la voie IM ont séroconverti. Au contraire, parmi les animaux transfectés par voies IT et ON, seule la moitié des animaux a séroconverti à la fin de l’expérimentation.
4) La charge génomique de PCV2 est élevée dès 13 jpt chez les porcelets transfectés par voie IM et IT (1011 copies de génome/g de tissu), puis est constante jusqu’à 34 jpt. À l’opposé, la charge génomique chez les animaux transfectés par voie ON augmente progressivement de 13 jpt à 34 jpt pour atteindre une valeur finale équivalente.
5) L’évolution des titres viraux infectieux est superposable à celle de la charge génomique.
En conclusion, l’ADN génomique de PCV2 cloné en tandem peut induire la production de particules virales infectieuses de PCV2 après transfection par voie intramusculaire, intratrachéale et oronasale. Toutefois, la voie intramusculaire reste la voie de transfection la plus efficace dans l’étude in vivo de la pathogénie de la MAP par rapport aux voies intratrachéale et oronasale.

P139
Effet non synergique entre le virus influenza A et Mycobacterium tuberculosis chez la souris

Louveau C^1,2, Lagranderie M², Ramisse F¹, Garnier L¹, Marchal G²

¹Division d’analyse biologique, Centre d’Etudes du Bouchet, Vert-le-Petit ; ²Laboratoire de référence des mycobactéries, Institut Pasteur, Paris
<celine.louveau@dga.defense.gouv.fr>

Les infections virales sont connues depuis longtemps pour favoriser les surinfections bactériennes. Pour évaluer l’existence ou non d’un effet synergique entre le virus de la grippe influenza A (VIA) et Mycobacterium tuberculosis, nous avons mis au point un modèle d’infection séquentielle IAV/mycobactérie chez la souris BALB/c. Les souris, pré-infectées avec une dose sublétale (160 PFU) de VIA par voie intranasale, sont exposées à un aérosol de mycobactéries au sein d’un caisson d’aérosolisation dans un laboratoire de sécurité biologique niveau 3. De façon inattendue, la pré-infection grippale accroît la résistance des souris vis-à-vis de l’infection à M. tuberculosis. Cette absence de synergie est caractérisée par un meilleur taux de survie, une absence de perte de poids et une plus faible inflammation des poumons. Ce phénotype atténué de l’infection à Mt chez la souris grippée est observé en dépit de la persistance des bactéries dans les organes cibles. Nous avons observé que la consolidation des poumons due à l’infection grippale était défavorable à l’étendue des lésions pulmonaires spécifique de Mt chez la souris. Par ailleurs, nos résultats ont démontré que l’infection grippale modifie la balance des cytokines Th1 et inflammatoires impliquées dans le contrôle des infections respiratoires avec M. tuberculosis. Dans notre modèle, l’infection grippale ne prédispose pas les souris aux surinfections à mycobactéries. Pour la première fois, il a été montré qu’une infection virale n’exerce pas d’effet synergique vis-à-vis d’un agent bactérien à tropisme respiratoire, responsable d’infection subaiguë ou chronique.

P140
Etude des interactions entre le cytomégalovirus humain (HCMV) et le sixième herpèsvirus humain (HHV6) in vitro

Boutolleau D^1,2, André-Garnier E³, Bonnafous P¹, Agut H¹, Gautheret-Dejean A^1,4

¹Laboratoire de virologie, Groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, et UPRES EA 2387, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Paris : ²Laboratoire de Bactériologie-Virologie, Faculté de médecine Paris-Sud, CHU de Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre ; ³Laboratoire de virologie, CHU, et JE 2437 Génétique des interactions hôte-microorganismes, Université de Nantes, Nantes ; ⁴Laboratoire de microbiologie, Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques, Paris
<david.boutolleau@bct.aphp.fr>

Le cytomégalovirus humain (HCMV) et le sixième herpèsvirus humain (HHV6) sont deux bêta-herpèsvirus qui, à l’instar des autres membres de la famille des Herpesviridae, sont susceptibles de se réactiver chez les patients immunodéprimés. En particulier, les infections à HCMV et à HHV6 sont associées à de nombreuses complications, parfois graves, au cours de la période post-greffe d’organe solide ou de cellules souches hématopoïétiques. Chez les patients greffés, l’existence d’interactions entre ces deux virus et leurs conséquences en termes de pathogénicité sont de plus en plus évoquées. Certaines études suggèrent notamment que les infections à HHV6 pourraient favoriser la survenue d’infections à HCMV chez les patients au cours de la période post-greffe. Néanmoins, il n’existe pas à ce jour d’étude in vitro mettant en évidence un tel phénomène, et les mécanismes potentiellement impliqués sont méconnus. Nous avons donc étudié les interactions entre le HCMV et le HHV6 in vitro dans un système de culture de fibroblastes humains embryonnaires (FH). Les FH ont été infectés, séparément ou simultanément, par différentes souches de HCMV (AD169, Towne, Toledo) et de HHV-6 variant A (U1102, SIE, GS) ou variant B (HST, MAR). Les infections virales ont été suivies pendant six jours à l’aide de différentes méthodes : détection d’antigènes viraux par immunoperoxydase, mesure de la charge virale cellulaire par PCR en temps réel, et détection de transcrits viraux tardifs par RT-PCR. Seules les souches de HHV6A étaient capables de se répliquer dans les FH, avec une efficacité d’infection supérieure pour la souche U1102. Afin d’étudier les interactions potentielles entre le HCMV et le HHV6, des co-infections virales de FH ont été réalisées avec la souche U1102, d’une part, et différentes souches de HCMV, d’autre part. Nous avons montré que le HCMV, quelle que soit la souche, favorisait la réplication du HHV6A de façon dose-dépendante. En effet, à J6 post-infection, le nombre de cellules exprimant des antigènes du HHV6 était sensiblement augmenté (environ d’un facteur 20) en présence de HCMV, et la charge virale cellulaire HHV6 était supérieure d’un facteur 10 à 100 selon l’inoculum initial de HCMV. De plus, la détection du transcrit tardif du gène U100 du HHV6 était plus précoce dans les cultures de FH co-infectées par le HHV6 et le HCMV que dans celles infectées par le HHV6 seul (J3 versus J6). L’utilisation d’inserts de culture a permis de montrer l’implication d’interactions virales directes ou de stricte proximité, et de rejeter l’hypothèse de la participation de facteurs cellulaires solubles. En revanche, dans ces mêmes conditions expérimentales, le HHV6 n’influençait pas la réplication du HCMV. Au total, ces résultats montrent que le HCMV est capable d’accélérer et de favoriser la réplication du HHV-6. Les mécanismes moléculaires impliqués restent à élucider.

P141
Exploration du rôle des polynucléaires dans la physiologie de l’infection par le sixième herpesvirus humain (HHV6)

Palleau S¹, Boutolleau D^1,2, Bonnafous P¹, Boni S¹, El Hashimi H³, Masse MJ⁴, Agut H¹, Gautheret-Dejean A^1,5

¹Laboratoire de virologie, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, EA 2387, Groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris ; ²Laboratoire de Bactériologie-Virologie, Faculté de Médecine Paris Sud, CHU de Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre ; ³Inserm U616, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris ; ⁴Département de biologie cellulaire, Institut Jacques-Monod, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Paris ; ⁵Laboratoire de microbiologie, Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques, Paris
<agnes.gautheret@psl.aphp.fr>

Le HHV6 est un bêtaherpesvirus lymphotrope proche du cytomégalovirus humain (HCMV), largement répandu dans la population générale adulte. Certains auteurs ont montré que les polynucléaires (PN) pourraient jouer un rôle dans la physiopathologie de l’infection par le HCMV, mais la nature exacte de l’infection virale, véritable réplication ou simple transport passif, reste un sujet controversé. Au cours de l’infection par le HHV6, les PN pourraient également intervenir. À ce jour, seuls Luppi et al. (1999) ont mis en évidence le génome du HHV6 dans les granulocytes de trois patients atteints de lymphome de Hodgkin ou de sclérose en plaque. Nous ignorons si les PN de sujets sains ont la capacité de supporter la réplication du HHV6 ou de transmettre le virus entre cellules cibles. Le but de notre travail était de mettre au point un modèle d’infection des PN par du HHV6 in vitro, par coculture avec des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) préalablement infectées afin d’explorer, d’une part, si le HHV6 pouvait se répliquer dans les PN, et, d’autre part, si les PN pouvaient transmettre le virus aux cellules cibles habituelles (PBMC). De fortes quantités d’ADN viral et des antigènes viraux ont été mis en évidence dans les PN. Cependant, les antigènes étaient de localisation cytoplasmique et non nucléaire, comme ce qui est observé dans les PBMC productrices de HHV6. De plus, aucune particule virale n’a pu être mise en évidence par microscopie électronique après 60 heures de culture. L’analyse de la production d’ARN messagers viraux a indiqué que dès la première heure post-infection, les transcrits très précoces, précoces mais également tardifs étaient présents puis disparaissaient dès 48 heures Par ailleurs, aucune transmission de virus n’a été observée entre PBMC via les PN. Nous avons également étudié la présence du HHV6 dans les PN et les PBMC de patients pour lesquels une infection active était suspectée. La fréquence de détection de l’ADN génomique du HHV6 comme sa charge virale étaient supérieures dans les PN par rapport aux PBMC correspondants.
En résumé, nos résultats indiquent, d’une part, l’absence de réplication du HHV6 dans les PN in vitro et, d’autre part, l’absence de participation des PN dans la transmission du HHV6 entre cellules cibles. La présence de matériel viral dans les PN tant in vitro qu’in vivo résulte probablement d’un processus de phagocytose que nous étudions.

P142
L’environnement de réplication du virus respiratoire syncytial bovin est un déterminant de la pathogénicité pour le jeune veau

Meyer G¹, Deplanche M¹, Le Mercier P¹, Boxus M², Kerkhofs P², Baranowski E¹

¹Equipe interactions hôtes-virus et vaccinologie (INRA, UMR1225), Ecole nationale vétérinaire, 31076 Toulouse ; ¹Veterinary and Agrochemical Research Centre, Department of Virology, Groeselenberg 99, 1180 Brussels, Belgium
<g.meyer@envt.fr>

Le virus respiratoire syncytial bovin (VRSB) est un agent pathogène majeur du bétail responsable chez le veau de syndromes respiratoires modérés à sévères. La nature des facteurs qui déterminent l’intensité des manifestations cliniques chez l’animal infecté n’est pas connue, mais l’influence de facteurs liés à l’hôte est souvent évoquée.
Une série d’évidences suggèrent que l’amplification préalable du VRSB sur veaux nouveau-nés pourrait influencer le pouvoir pathogène de ce virus et favoriser le développement de signes cliniques et l’apparition de lésions caractéristiques lors d’infection expérimentale. La propagation du VRSB en cultures cellulaires, même limitée, serait par contre associée à une diminution du pouvoir pathogène.
Dans le but de démontrer l’influence de l’environnement de réplication utilisé pour la préparation de l’inoculum viral sur la pathogénicité du VRSB, des veaux âgés de 25,4 ± 7 jours ont été inoculés avec deux populations virales dérivées du même isolat de VRSB. Un groupe de 5 animaux a été inoculé avec 10⁵ UFP du virus 3761/veau, amplifié par trois passages successifs sur veaux nouveau-nés (groupe 3761-LBA). Un autre groupe de 5 animaux a été inoculé avec la même quantité de particules infectieuses, mais avec le virus 3761 amplifié par trois passages sur cellules de cornets naseaux (groupe 3761-C).
Les résultats du suivi clinique, virologique et immunologique montrent une différence de virulence entre les deux inoculums, qui se traduit principalement par un allongement de la période d’incubation de la maladie et par un retard de la multiplication du virus dans l’arbre respiratoire supérieur pour le groupe 3761-C. Des différences significatives ont en effet été enregistrées entre les groupes 3761-LBA et 3761-C quant au délai d’apparition des signes cliniques (4,8 +/- 0,7 versus 7,2 +/- 0,3 j). Le retard dans l’apparition de la pathologie pour le groupe 3761-C est corrélé à un retard dans l’apparition de la réponse en IgM (10,4 +/-4,8 versus 7,6 +/- 1,1 j) et dans la détection du virus par RT-PCR quantitative dans les écouvillons nasaux (4,8 +/-0,6 versus 2,8 +/-1 j).
Le séquençage complet du génome viral 3761 et la comparaison de la séquence consensus des populations 3761-LBA et 3761-C ont permis d’identifier quatre mutations. Ces mutations entraînent des changements d’acides aminés sur la protéine de matrice M2 (G70/E) et sur la polymérase L (Q1740/R, V1742/A et N1760/H). Ces protéines sont principalement impliquées dans la réplication virale. L’implication de ces modifications sur la virulence du VRSB reste à établir.
Cette étude montre que l’environnement de réplication du VRSB, même sur un faible nombre de passages en cultures cellulaires ou sur veaux nouveau-nés, peut influencer le pouvoir pathogène de ce virus. Des études sont actuellement en cours pour identifier les facteurs expliquant ces différences de pathogénicité observées pour le VRSB 3761

P143
L’expression de la protéine X du virus de l’hépatite B (VHB) augmente l’incidence du carcinome hépatocellulaire chez les souris transgéniques exprimant la polyprotéine du virus de l’hépatite C (VHC)

Lerat H^1,4, Keasler VV¹, Forbes SJ², Lemon SM³, Slagle BL¹

¹Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, Houston, Texas ; ²Division of Medicine, Imperial College, London ; ³Department of Microbiology and Immunology, The University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas ; ⁴Inserm U635, hôpital Henri-Mondor, Université Paris XII, Créteil
<herve.lerat@im3.inserm.fr>

Les infections chroniques par le VHB et par le VHC affectent respectivement 350 et 170 millions de personnes dans le monde. Bien que les mécanismes moléculaires en soient encore inconnus, la co-infection par le VHC et le VHB est associée à un risque accru de carcinome hépato-cellulaire (CHC) [Donato et al., Int J Cancer 1998 ; 75 : 347-54]. Nous avons montré que les souris transgéniques exprimant la polyprotéine entière du VHC (FL-N/35) développent des CHC [Lerat, et al., Gastro 2002 ; 122 : 352-65]. De la même façon, nous avons montré que la protéine X du VHB (HBx) est un cofacteur du développement des CHC chez la souris [Slagle, et al., Molec Carc 1996 ; 15 : 261-9]. Ces modèles ont été utilisés dans l’objectif d’étudier l’hypothèse selon laquelle la protéine HBx pourrait accélérer la progression des lésions hépatiques chez les souris transgéniques pour le VHC.
Les souris transgéniques pour l’HBx (ATX) ont été croisées avec les souris FL-N/35. À 16 mois, des CHC ont été observés chez 21 % des souris double transgéniques (HCV/ATX), mais chez aucune des souris simple transgénique (HCV ou ATX) et chez aucune des souris témoins. Des phénotypes prénéoplasiques ont été recherchés sur les foies des souris à 8 mois. Des changements significatifs ont été observés dans les souris HCV/ATX : augmentation du ratio poids du foie sur poids corporel, augmentation de l’incidence et de la sévérité de la stéatose et augmentation du nombre d’hépatocytes PCNA-positifs. Par ailleurs, une inhibition de l’apoptose induite par la voie fas a été observée chez les souris HCV/ATX mais pas chez les souris témoins. Les extraits protéiques de foies de souris HCV/ATX présentaient en outre une diminution d’expression de la protéine proapoptotique bid par rapport aux souris témoins.
Ces résultats montrent que l’expression de la protéine HBx augmente l’incidence du carcinome hépatocellulaire chez les souris transgéniqes exprimant la polyprotéine du VHC, par un mécanisme impliquant un déséquilibre entre la génération et la mort des hépatocytes dans un contexte de stéatose sévère.

P144
Démonstration in vitro de la réplication du lentivirus de l’arthrite encéphalite virale caprine (CAEV) par les cellules embryonnaires caprines

Fieni F¹, Ali Al Ahmad MZ¹, Pellerin JL¹, Guiguen F², Chebloune Y²

¹Unité propre soutien de programme 5301 DGER, Etude des risques sanitaires liés aux biotechnologies de la reproduction, Ecole nationale vétérinaire, BP40706, 44307 Nantes Cedex 3 ; ¹UMR 754 INRA/ENVL/UCBL, Lyon Cedex 07
<fieni@vet-nantes.fr>

Les tissus de l’appareil génital de chèvre peuvent être infectés par le CAEV [Fieni et al., 2003]. Les cellules de l’épithélium de l’oviducte, ainsi que celles de la granulosa, ont été démontré in vitro, comme sensibles à l’infection virale et aptes à répliquer le virus [Lamara et al., 2002a]. La pression de contamination de l’ovocyte puis de l’embryon, lors de son développement ovarien, tubaire et utérin est donc importante. L’infection précoce des cellules embryonnaires à un stade de totipotence pourrait entraîner l’endogénisation du CAEV à l’origine de porteurs sains tolérants. L’objectif de ce travail est d’étudier si les blastocystes caprins dépourvus de leur zone pellucide sont, d’une part, susceptibles à l’infection par le CAEV et, d’autre part si les blastomères infectés sont capables de réplication de ce virus.
Cent vingt et un embryons dépellucidés de 8 à 16 cellules, récoltés à J4 chez des donneuses certifiées CAEV négative, ont été contaminés par coculture dans un insert pendant 6 jours au-dessus d’un tapis cellulaire mixte de GSM/COEC produisant 104,75 TCID50/ml de CAEV. Après 6 jours les embryons sont lavés 10 fois puis cultivés dans un insert pendant 6 heures au-dessus d’un tapis de cellule indicatrice GSM. Ces cellules sont cultivées pendant 5 semaines ou jusqu’à observation d’un effet cytopathique caractéristique. Après lavage les embryons sont ensuite cultivés pendant 24 heures dans un milieu acellulaire dont la concentration virale est déterminée par titrage. Enfin après trypsination les blastomères sont cultivés à plat. Ces cultures sont utilisées pour rechercher le virus par PCR, le provirus ADN par RT-PCR et la protéine p28 de la capside par immunocytochimie. 64 embryons non infectés ont été utilisés comme témoins.
Après coculture l’ARN viral est détecté uniquement dans les 4 premiers bains de lavage. Les cellules GSM indicatrices de l’infection virale ont présenté un effet cytophatique caractéristique au 4e passage dont la spécificité a été confirmée par PCR. Le titre mesuré dans le milieu de culture acellulaire après 24 heures est supérieur à 103,25 TCID50/ml. Enfin après 8 jours de culture en monocouche des blastomères, l’ADN proviral du CAEV a été identifié par PCR, l’ARN du CAEV a été détecté par RT-PCR dans le surnageant de la culture des cellules embryonnaires infectées et l’analyse immunocytochimique des cellules embryonnaires, par utilisation d’un anticorps monoclonal anti-p28, a confirmé l’expression des protéines virales dans ces cellules.
L’ensemble de ces résultats montre clairement que les cellules embryonnaires précoces caprines qui ont été exposées au CAEV : 1) sont capables de transmettre le virus aux cellules GSM permissives, 2) répliquent et libèrent le CAEV à un titre élevé dans le milieu extérieur, 3) ont intégré le génome proviral du CAEV. Celui-ci a été ultérieurement exprimé en protéines qui ont été correctement transformées, assemblées en particules infectieuses et libérées hors de ces cellules. En conséquence les cellules d’embryons précoces dépellucidés de chèvre sont sensibles à l’infection par le CAEV et cette infection est productive. Cette possibilité d’infection virale des embryons précoces de chèvres sans altération de leur développement augmente le risque d’apparition des génomes endogènes de CAEV qui pourraient être transmis verticalement par des cellules germinales. Ces résultats, associés à ceux de Lamara et al., (2002b), démontrent le rôle primordial de protection que joue la zone pellucide contre l’infection des blastomères par le CAEV.

P145
La délétion de Bax ne protège pas les neurones de la mort induite par le prion

Coulpier M¹, Messiaen S¹, Hamel R¹, Fernandez De Marco M², Lilin T¹, Eloit M¹

¹UMR1161 Virologie Inra AFSSA Enva, École vétérinaire de Maisons-Alfort, 7 av. Général-de-Gaulle, 94704 Maisons-Alfort ; ²Departamento de Anatomϊa y A. Patológica Comparadas. Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales. 14014 Córdoba, Espagne
<mcoulpier@vet-alfort.fr>

Bien que la mort neuronale soit une figure bien connue des maladies à prions, les mécanismes moléculaires la sous-tendant sont, à ce jour, peu élucidés. L’implication d’un processus apoptotique a été suggérée après observation d’une dégradation de l’ADN par marquage TUNEL et activation des caspases dans des modèles naturels et expérimentaux d’infections à prions. BAX est une protéine proapoptotique appartenant à la famille Bcl2 qui joue un rôle central dans la régulation de la mort neuronale dans diverses situations. Récemment, BAX a été impliqué dans un modèle génétique de maladies à prions. Néanmoins, son rôle dans les maladies à prions d’origine infectieuse est inconnu. Dans le but de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans les maladies à prions, nous avons inoculé une souche d’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) adaptée à la souris (6PB1), à des souris dont le gène codant pour Bax a été invalidé. Nos résultats montrent que l’inactivation de Bax ne perturbe pas le développement de la maladie. Les souris contrôles et les souris Bax-/- infectées présentent les mêmes caractéristiques cliniques. Les dépôts de PrPres et l’astrogliose sont similaires. L’intégrité des neurones n’est pas modifiée et leur survie n’est pas améliorée. Ces résultats démontrent que BAX n’est pas indispensable à la mort des neurones provoquée par la souche ESB et suggèrent l’existence de voies multiples de mort dans les maladies à prions.

P146
Des virus dans le génome des plantes : l’ennemi intérieur

Iskra-Caruana ML

Cirad département AMIS/UMR BGPI, TA 41/K, Campus International de Baillarguet, 34398 Montpellier Cedex 5
<marie-line.caruana@cirad.fr>

Les pararétrovirus (PRV) sont des virus à génome ADN double brin, responsables de maladies des plantes, tempérées et tropicales, pouvant être économiquement importantes. Dernièrement l’accès aux génomes a révélé la présence de séquences virales intégrées dans le génome de nombreuses plantes correspondant à ce jour principalement à des virus à ADN dont les pararétrovirus. Rien n’est actuellement connu sur l’origine de ces fragments ; les pararétrovirus n’ont besoin à aucune étape de leur multiplication d’intégrer le génome hôte et ne développe aucune forme « provirale » connue pour les rétrovirus animaux. Les EPRV, dont l’origine semble relever d’une coévolution des génomes viraux et de ceux de leurs plantes hôtes, ont la capacité pour certains d’être à l’origine de la restitution de virions infectieux responsable de l’apparition soudaine de maladies. Ce phénomène incontrôlé à ce jour affecte les programmes d’amélioration génétique de nombreuses espèces d’intérêt agronomique. C’est le cas du petunia vein clearing virus (PVCV) pour le pétunia, du tabacco vein clearing virus (TVCV) sur tabac et du banana streak badnavirus (BSV) sur bananier. Ce dernier, responsable de la maladie en tirets des bananiers, est devenu ces dernières années la contrainte majeure de la filière banana du fait de la présence dans le génome des bananiers de l’espèce Musa balbisiana (notée B) d’EPRV infectieux. Il a été démontré que sous l’action d’un stress biotique et abiotique (culture in vitro et croisements génétiques), ces bananiers à l’origine sains, restituent des virions infectieux et développent la maladie [1, 2]. Les principales hypothèses expliquant l’origine de ces intégrations se basent sur de possibles recombinaisons illégitimes dues à l’accumulation d’ADN viral dans le noyau des plantes hôtes tolérantes au virus. Ainsi une tolérance de l’espèce M. balbisiana au BSV serait à l’origine de l’accumulation d’ADN dans le noyau, l’intégration serait la conséquence d’une pression continue de la maladie sur une même espèce. Au cours du temps et afin de préserver leur biologie propre, les bananiers de l’espèce M. balbisiana auraient développé un système de régulation empêchant toute nouvelle intégration fatale, et par là même un mécanisme de défense vis-à-vis des EPRV et PRV BSV. Des résistances naturelles aux majeures souches virales de BSV ont été observées pour deux bananiers diploïdes BB, Pisang Klutuk Wulung (PKW) et Pisang batu (PB). Les principaux résultats obtenus sur la caractérisation des EPRVS BSV [3], leur rôle potentiel et leur phylogénie parmi le germplasm Musa seront abordés au cours de la présentation.

Références

1. Dallot S, Acuña P, et al. Evidence that the proliferation stage of micropropagation procedure is determinant in the expression of Banana streak virus integrated into the genome of the FHIA 21 hybrid (Musa AAAB). Arch Virol 2001 ; 146 : 2179-90.

2. Lheureux F, Carreel F, et al. Identification of genetic markers linked to Banana streak disease expression in inter-specific Musa hybrids. Theor Appl Genetic 2003 : 106 : 594-8.

3. SafarJ, Noa-Carrazana JC, et al. Creation of a BAC resource to study the structure and evolution of the banana (Musa balbisiana) genome. Genome 2004 47 : 1182-91.

P147
Caractérisation des enzymes virales impliquées dans la formation de la « coiffe » des ARNm de flavivirus

Selisko B, Peyrane F, Decroly E, Egloff M-P, Alvarez K, Canard B

AFMB : Architecture et fonction des macromolécules biologiques, Département Réplication virale : structure, mécanismes, et drug-design, UMR6098, CNRS, Université de Provence, Université de la Méditerranée, Parc scientifique et technologique de Luminy, Case 925, 163 avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09
<Bruno.Canard@afmb.univ-mrs.fr>

Les ARNm de flavivirus sont coiffés à leur extrémité 5’. Cette coiffe, nécessaire à la réplication virale, régule l’expression des protéines virales et stabilise les ARNm. Trois activités enzymatiques distinctes sont impliquées dans la formation de la coiffe des flavivirus : 1) triphosphatase (RTPase), 2) guanynyltransférase (Gtase), 3) méthyltransférase (N7MTase et 2’O MTase). Les activités RTPase et 2’-O MTase ont été identifiées précédemment au laboratoire. Elles sont portées par les protéines NS3 et NS5 respectivement. Par contre, les protéines virales portant les activités GTase et N7MTase restent inconnues à ce jour. Afin d’identifier et de caractériser toutes les enzymes virales impliquées dans la formation de la coiffe des flavivirus, des méthodes de synthèse et de purification de petits ARN spécifiques ont été mises au point.
Nous avons synthétisé in vitro de petits ARN AC2 à AC7 ainsi que leurs homologues coiffés (GpppAC2 à GpppAC7) à l’aide de la T7 DNA primase en présence d’ATP, de GpppA ou de m7GpppA respectivement. Après optimisation des conditions de production et purification par CLHP, ils ont été caractérisés par spectroscopie de masse.
Nous avons, dans un premier temps, étudié l’action du domaine méthyltransférase NS5 du virus de la dengue sur ces différents substrats. La spécificité de l’enzyme vis-à-vis des différents ARN cibles à été déterminée par des études cinétiques et des mesures d’affinité. De plus, nous avons caractérisé les sites de méthylation. Enfin, nous caractérisons actuellement les propriétés inhibitrices de différentes molécules ciblant spécifiquement la 2’O MTase du virus de la dengue.

P148
Une ARN primase dépendante de l’ARN dans le monde viral :
la protéine Nsp8 du SARS-CoV

Imbert I¹, Guillemot JC¹, Dutartre H¹, Bourhis JM¹, Coutard B¹, Egloff MP¹, Ferron F², Canard B¹

¹AFMB : Architecture et fonction des macromolécules biologiques, Département Réplication virale : structure, mécanismes, et drug-design, UMR6098, CNRS, Université de Provence, Université de la Méditerranée, Parc scientifique et technologique de Luminy, Case 925, 163 avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09 ; ²Boston Biomedical Research Institute, 64, Grove St, Watertown 02472, MA, USA.
<Isabelle. Imbert@afmb.univ-mrs.fr>

Les coronavirus représentent un problème majeur de santé publique, illustré par l’émergence du SARS-CoV, et plus récemment par la caractérisation de nouveaux coronavirus pathogènes chez l’humain, responsables de bronchiolites, ou du syndrome de Kawasaki… Le génome des coronavirus s’illustre par sa grande taille, autour des 30 kb, et par le nombre de protéines impliquées dans le complexe de réplication. Après le séquençage du génome de ce virus, la détermination par analyse bio-informatique de la fonction potentielle de certaines des 16 protéines du complexe, plusieurs restent de fonctions inconnues. Le but à long terme de notre travail est d’élucider le fonctionnement du complexe réplicatif des coronavirus.
Nous avons cloné, exprimé, et purifié la majorité des protéines réplicatives du virus du SRAS. Parmi celles-ci, Nsp8 a été étudiée plus particulièrement pour son rôle auxiliaire à l’ARN polymérase ARN dépendante, Nsp12.
Résultats. Nous avons mis en évidence que la protéine Nsp8 du SARS-CoV est une ARN primase ARN-dépendante. C’est le seul exemple à ce jour d’une telle activité dans le monde vivant. Cette polymérase particulière synthétise des amorces de taille moyenne de 7 mer, à partir d’une séquence spécifique présente de nombreuses fois dans le génome des coronavirus. De par leur taille, les coronavirus possèdent un mécanisme de réplication particulier, qui s’illustre par la présence d’une primase, unique non seulement dans le monde viral mais aussi dans toutes formes de vies. L’analyse phylogénétique et structurale de nsp8 laisse penser que la fonction a été acquise après détournement de la fonction d’une protéine cellulaire de fixation à l’ARN, et non pas que la primase ait été conservée et survivante du monde primitif à ARN.

Dernière minute

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Impact du diagnostic rapide des méningites à entérovirus par PCR en temps réel sur la prise en charge des patients au CHU de Clermont-Ferrand

Archimbaud C^1,2, Chambon M^1,2, Mirand A^1,2, Regagnon C¹, Bailly JL², Petit I³, Peigue-Lafeuille H^1,2, Henquell C¹

¹CHU, Service de Virologie, Centre de biologie, 58, rue Montalembert, F-63003 Clermont-Ferrand ; ²Université d’Auvergne, Faculté de médecine, Service de virologie, 28 place Henri-Dunant, 63001 Clermont-Ferrand ; ³CHU, Services de pédiatrie, Hôtel-Dieu, bd Léon-Malfreyt, 63001 Clermont-Ferrand

Les entérovirus sont les causes majeures des méningites aseptiques aiguës. La certitude diagnostique est désormais apportée par la détection du génome viral dans le LCR. Les tests basés sur une méthode classique de RT-PCR nécessitent un temps de réalisation technique incompatible avec un rendu de résultat rapide. Le développement récent d’appareils de détection en temps réel des génomes viraux a augmenté la praticabilité de ces tests moléculaires. Cette étude a eu pour objectif d’évaluer en prospectif, sur l’épidémie de 2005 qui a donné lieu à une alerte sanitaire de l’Institut de veille sanitaire (InVS), l’impact de la mise en place dans l’activité quotidienne du laboratoire d’une technique entérovirus RT-PCR en temps réel, mise au point sur appareil Light-Cycler (Roche Diagnostic).
De janvier à novembre 2005, un diagnostic positif de méningite à entérovirus a été établi pour 66 patients (49 enfants, 17 adultes) par RT-PCR dans le LCR. Pour 33 patients (50 %), un entérovirus a été isolé sur culture de cellules à partir de prélèvements de gorge et/ou de selles. Le typage moléculaire des souches (VP1) a montré une co-circulation dans notre région en 2005 de plusieurs types : échovirus 30, 18 et 13, coxsackievirus 3 et 5. L’analyse globale des données clinicobiologiques a montré que les résultats du test RT-PCR étaient communiqués au médecin par téléphone dès la validation biologique : le jour même (soit 4 à 7 heures après réception du LCR au laboratoire) dans 37 % des cas, dans les 24 heures (64 %), sous 48 heures (82 %), dans les 3 jours incluant week-end et fériés (18 %) ; 24% des patients (15 enfants, 1 adulte) sont sortis 1 à 6 heures après communication des résultats.
Cette stratégie de réalisation du test moléculaire dans le LCR, le plus rapidement possible après l’admission, a permis d’éviter l’hospitalisation de 8 enfants (8/15) qui ont eu seulement un suivi ambulatoire lorsque l’environnement social était favorable. Le diagnostic prospectif, non plus d’élimination, des méningites à entérovirus autorise la non-prescription d’antibiotiques et d’examens complémentaires coûteux.