Analyse structurale de l’ARN‐polymérase ARN‐dépendante du virus de l’hépatite C

ARTICLE

Auteur(s) : S. Bressanelli

Virologie moléculaire et structurale, UMR CNRS-INRA 2472, 1, avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex

Le HCV : classification et organisation du génome

Le HCV est un virus enveloppé à ARN positif, seul membre du genre Hepacivirus au sein de la famille des Flaviviridae [6]. Son génome d’environ 9,6 kb comprend, comme celui des autres Flaviviridae, un seul cadre ouvert de lecture. Celui-ci est traduit en une polyprotéine de quelque 3 000 acides aminés qui est clivée co- et post-traductionnellement en une dizaine de protéines (figure 1). La partie N-terminale de la polyprotéine comprend les protéines structurales qui forment la particule virale, tandis que la partie C-terminale comprend les protéines non structurales (NS), pour lesquelles plusieurs activités enzymatiques indispensables à la réplication virale ont été identifiées et partiellement caractérisées sur les protéines recombinantes. Ainsi, NS3 porte des activités ATPase et ARN-hélicase dans sa partie C-terminale et protéase à sérine dans sa partie N-terminale [7]. NS5b porte une activité ARN-polymérase strictement dépendante de l’ARN [8] et constitue l’élément clé du complexe de réplication du virus. C’est cette enzyme qui copie le génome du virus, synthétisant d’abord le brin complémentaire de l’ARN génomique, puis utilisant ce brin complémentaire comme matrice pour produire de nouveaux génomes du HCV.

Un virus très variable

Une caractéristique du HCV qui est très vite apparue aux chercheurs est sa très grande variabilité, qu’on peut décrire en trois niveaux hiérarchiques : quasi-espèces, sous-types et types [9]. Tout d’abord, les séquences isolées par RT-PCR du sérum d’un même patient montrent un manque d’homogénéité des génomes de HCV, fortement apparentés mais distincts, qui infectent celui-ci. Ce phénomène, commun à de nombreux virus à ARN, a été associé chez le HCV à une véritable distribution en quasi-espèces. Il n’est pas sûr toutefois que ce fait soit un déterminant majeur de la capacité du HCV à provoquer des infections persistantes. En second lieu, le HCV présente une très grande diversité géographique, avec de nombreux sous-types regroupés en six grands génotypes. Cela a une grande importance dans la mesure où ces génotypes diffèrent beaucoup quant à leur sensibilité au traitement actuel. Ainsi, le génotype 1, majoritaire en Europe occidentale, aux États-Unis et au Japon, est particulièrement résistant à ce traitement (dans le meilleur des cas, 34 à 42 % de réponses virologiques soutenues).

La polymérase du HCV

Par homologie avec les autres Flaviviridae et à cause de la conservation de courts motifs caractéristiques d’une grande famille de polymérases à une sous-unité [10], il a été très tôt soupçonné que la polymérase du HCV devait être NS5b, l’extrémité C-terminale de 591 résidus de la polyprotéine (figure 1). Cependant, ce n’est qu’en 1996, soit 7 ans après l’isolement du génome du virus, que la preuve a été apportée que ce polypeptide, produit en système baculovirus et purifié, possédait in vitro l’activité ARN-polymérase ARN-dépendante attendue [8].
De très nombreuses études in vitro menées depuis sur cette enzyme recombinante ont permis de dégager ses propriétés fonctionnelles (après 1999, la plupart des études ont été conduites sur des protéines délétées de leur extrémité C-terminale hydrophobe et produites en Escherichia coli, cf. ci-après) : tout d’abord, la synthèse d’ARN par NS5b est strictement dépendante de la présence d’un ARN matrice et NS5b n’accepte que des ribonucléotides comme substrats. Cette activité ARN-polymérase ARN-dépendante exige la présence de magnésium ou de manganèse, conformément au mécanisme postulé pour l’ensemble des polymérases [11]. En deuxième lieu, NS5b est très processive et peut par exemple synthétiser d’un seul trait un antigénome (9,6 kb) si on lui fournit le génome du HCV comme matrice [12]. En troisième lieu, NS5b a in vitro une spécificité lâche vis-à-vis de la séquence de l’ARN matrice. Elle est capable par exemple de copier certains ARN non viraux (cellulaires ou homopolymériques). Cependant, elle montre une préférence pour certaines séquences [13-15]. Reigadas et al. ont ainsi pu montrer que l’extrémité 3’ du brin négatif était une meilleure matrice que celle du brin positif, ce qui est conforme au fait que le brin positif (utilisé comme ARN messager et incorporé dans les virions néosynthétisés) doit être produit en plus grande quantité que le brin négatif. Une quatrième propriété de NS5b concerne l’étape d’initiation de synthèse d’ARN. On a longtemps pensé que NS5b était capable d’allonger un brin amorce apparié à la partie 3’ de l’ARN matrice, mais non d’induire la synthèse d’ARN de novo. Dans ce dernier mode d’induction, commun à de nombreux virus à ARN, la polymérase virale est capable de se lier à l’extrémité 3’ d’un ARN simple brin, puis à deux nucléotides dont la condensation constitue le début de la synthèse du brin complémentaire. Il a été depuis établi que NS5b pouvait de fait effectuer cette synthèse de novo dans des conditions suffisamment proches des conditions physiologiques (en particulier, non dépendantes de la présence de manganèse) pour convaincre la communauté des « hépacivirologues » [16]. Une cinquième propriété de NS5b in vitro est la faiblesse de son activité spécifique d’incorporation de nucléotides dans des tests classiques d’élongation d’amorce (seulement 0,1 à 5 nucléotides par minute). On a pu montrer que la faiblesse de cette activité moyenne est entièrement attribuable au fait que seule une fraction (moins de 1 %) des molécules de polymérase prend part à la réaction dans ce type de test [17]. Cela semble dû à une étape limitante lors de l’induction de la synthèse d’ARN, alors que l’élongation elle-même se ferait avec une vitesse comparable à celle d’autres polymérases comme la transcriptase inverse du VIH ou l’ARN-polymérase ARN-dépendante du poliovirus (plusieurs centaines de nucléotides incorporés par minute). On aurait donc en solution un équilibre entre une forme inactive majoritaire et une forme catalytiquement compétente, la transition de la première vers la seconde étant lente.
Il a fallu attendre trois ans après la mise en évidence de l’activité spécifique de NS5b pour disposer de la structure tridimensionnelle de cette enzyme, déterminée indépendamment par plusieurs groupes de cristallographie biologique et publiée simultanément par trois d’entre eux [18-20]. La principale difficulté, dans l’obtention de la protéine recombinante comme dans sa cristallisation, a été la présence d’un segment C-terminal très hydrophobe, vraisemblablement impliqué in vivo dans l’association du complexe de réplication aux membranes du réticulum endoplasmique. La démonstration que ce segment d’une vingtaine d’acides aminés n’est pas indispensable pour l’activité in vitro et que son élimination permet de produire en grandes quantités une enzyme soluble et active [21, 22] a permis la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X. Important aussi est le résultat selon lequel de plus grandes délétions de la région C-terminale sont possibles (jusqu’à 63 résidus sans inactivation de l’enzyme), ce qui montre qu’on a une quarantaine de résidus intercalés entre le segment d’amarrage aux membranes et le domaine polymérase proprement dit.

Une architecture globale classique, mais des éléments très particuliers

La structure de la polymérase du virus de l’hépatite C (figure 2) présente deux caractéristiques originales par rapport aux autres polymérases à une sous-unité, dont de nombreuses structures étaient connues en 1999 [23]. L’architecture générale de ces enzymes est décrite dans une nomenclature définie d’abord pour le fragment de Klenow de l’ADN-polymérase I de E. coli, la première dont la structure a été connue [24] : cette enzyme ressemble à une main droite ouverte, où des sous-domaines en N-terminal (« doigts ») et en C-terminal (« pouce ») encadrent un troisième sous-domaine (« paume »). Cette disposition forme une profonde crevasse le long de laquelle vient se placer l’acide nucléique matrice. L’addition d’un nucléotide triphosphate pour allonger le brin amorce (ou le nucléotide initiateur dans le cas particulier de l’induction de novo) est alors catalysée par deux ions magnésium, dont la sphère de coordination comprend plusieurs acides aspartiques strictement conservés (figure 3). Ainsi, on peut concevoir la fonction biologique de ces polymérases comme le positionnement récurrent des substrats (matrice, amorce et nucléotide arrivant) vis-à-vis de deux ions magnésium qui sont les véritables agents de la catalyse. Les résidus contribuant à la fixation de ces deux ions sont situés au creux de la paume, tandis que le pouce interagit avec la partie double brin du duplex matrice-amorce, notamment par des contacts avec le petit sillon, et que les doigts interagissent avec la partie simple brin de la matrice. Il est à noter que les doigts participent aussi à la liaison au nucléotide arrivant et que ces interactions ne sont établies que lorsque ce sous-domaine se referme sur le site catalytique : ainsi, les polymérases pour lesquelles on dispose de structures de complexes incluant le nucléotide arrivant en plus de la matrice et de l’amorce (complexes ternaires) montrent que le sous-domaine des doigts a pivoté de 20° à 65° par rapport aux structures de complexes binaires polymérase-acide nucléique. La conformation « doigts fermés » n’avait été observée jusqu’en 1999 que dans des complexes ternaires [23]. Pourtant, la structure de NS5b en l’absence de tout substrat montre une telle conformation fermée, de sorte que le site de liaison au nucléotide arrivant est complètement préformé. Cette conformation est identique dans les trois formes cristallines initialement décrites [18-20], ainsi que dans plusieurs autres formes rapportées depuis [25-29]. Cela exclut qu’on ait là un artefact de cristallisation, où une conformation particulière minoritaire en solution serait sélectionnée lors de la nucléation et de la croissance des cristaux.
Cette première originalité dans la structure de NS5b nous amène à considérer la seconde : les doigts comportent une extension qui consiste en deux insertions dans ce sous-domaine (résidus 14 à 41 et 141 à 157). Or, cette extension vient se lier à l’arrière du pouce (figure 2), principalement par l’intermédiaire d’une courte hélice (A) qui complète le faisceau d’hélices constituant la charpente du pouce chez NS5b. Une telle connexion doigts-pouce n’avait jamais été observée auparavant chez une polymérase. D’une part, elle ferme l’arrière de l’enzyme, laissant un tunnel bordé de résidus lysines et arginines qui constitue la voie d’accès des nucléotides arrivants. D’autre part, elle solidarise les doigts et le pouce. Cette observation est de prime abord surprenante si l’on se rappelle que, chez toutes les autres polymérases de structure connue, ces deux sous-domaines étaient apparus capables de mouvements indépendants et de grande amplitude. Cependant, on a déterminé depuis la structure de deux autres ARN-polymérases ARN-dépendantes [30, 31] et on retrouve une telle connexion chez ces deux enzymes. On peut aussi se rendre compte rétrospectivement [19] que cette connexion est présente chez l’ARN-polymérase ARN-dépendante du poliovirus, même si la structure partielle publiée en 1997 [32] n’avait pas permis de le voir, les doigts étant en grande partie désordonnés dans les cristaux. La présence d’une connexion entre doigts et pouce suggère que, chez les ARN-polymérases ARN-dépendantes, les mouvements de ces sous-domaines se produisent de façon concertée. Ils sont aussi certainement plus restreints dans leur amplitude que pour la plupart des autres polymérases. Cependant, la superposition des structures dont les coordonnées sont disponibles fait apparaître une légère différence entre les conformations des pouces (figure 4). Cela montre que le couplage doigts-pouce n’est pas rigide, la boucle Λ1 étant flexible et capable d’accommoder une certaine différence de positions relatives entre doigts et pouce.

Une dernière observation surprenante concerne les quelque 40 résidus intercalés entre le segment transmembranaire et le domaine polymérase (connecteur) : l’une des enzymes recombinantes initialement décrites (5b-ΔC55) ne comprend pas ces résidus [19], mais les deux autres constructions (5b-ΔC21) les ont conservés [18, 20]. Les structures cristallines montrent que le connecteur est ordonné et forme une longue boucle qui vient s’insérer dans la crevasse contenant le site catalytique (figure 2, en vert). Cette conformation est incompatible avec la présence d’un duplex ARN, il faut donc supposer que le connecteur sort de la crevasse lors de la polymérisation. Cette observation permet de comprendre le résultat curieux selon lequel des délétions de 40 à 60 résidus du C-terminal de NS5b sont environ 40 fois plus actives qu’une délétion de seulement 21 résidus dans les tests d’élongation in vitro [25, 33, 34]. Ce phénomène a été analysé précisément par Adachi et al. [25], qui ont montré que le gain d’activité est bien dû à la libération de la crevasse catalytique par le connecteur : dans les structures cristallines où les trois résidus clés pour l’interaction connecteur-crevasse sont absents ou mutés en alanine, le connecteur ne se trouve plus dans la crevasse et les enzymes ont une activité identique à celles qui sont complètement dépourvues du connecteur. Ces observations laissent ouverte la question de l’éventuelle fonction de l’interaction connecteur-crevasse. Les interactions du connecteur avec l’épingle 17-18 contribuent à la conformation plus fermée du pouce dans 5b-ΔC21 par rapport à 5b-ΔC55. Ranjith-Kumar et al. [35] ont émis l’intéressante hypothèse selon laquelle ces interactions, en excluant la fixation d’un ARN double brin au site actif de NS5b, favorisent le mode initiation au détriment du mode élongation. Ces deux étapes de la synthèse d’ARN par NS5b sont discutées ci-après à la lumière de comparaisons avec des enzymes homologues.

Comparaison avec la transcriptase inverse du VIH : comment NS5b allonge un brin complémentaire de la matrice

La biologie structurale apporte des informations sur la parenté entre les protéines car elle permet de détecter des homologies plus éloignées que la seule comparaison de séquences. En effet, la conservation détaillée des structures, et en particulier celle des topologies de repliement tridimensionnel, est aisément reconnaissable et permet de reconnaître des protéines homologues alors même que l’identité de séquence est devenue indétectable. Ce fait revêt une importance particulière en virologie, où l’évolution des séquences peut être très rapide, surtout chez les virus à ARN. Ainsi, la question de l’éventuelle parenté entre polymérases de Picornaviridae, Flaviviridae et Retroviridae n’a pu être résolue avec certitude par comparaison de séquences [36]. Cependant, la comparaison des structures de polymérases du poliovirus (3Dpol), du virus de l’hépatite C (NS5b) et du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-RT) montre que ces trois polymérases descendent d’un ancêtre commun. Non seulement les paumes, mais aussi les doigts admettent le même repliement [19]. Les doigts de NS5b (et très vraisemblablement de 3Dpol) ont seulement des parties supplémentaires insérées par rapport à VIH-RT (les boucles Λ1 et Λ2 et un faisceau d’hélices alpha, figure 5). Le fait que NS5b soit dans une conformation « doigts fermés » permet ainsi une comparaison détaillée avec la structure de complexe ternaire (polymérase + matrice-amorce + nucléotide arrivant) disponible pour VIH-RT [37]. La superposition des substrats de ce complexe avec la structure de NS5b (figure 5) permet d’identifier la plupart des résidus fonctionnellement importants. En outre, elle permet de se rendre compte que NS5b ne peut pas, dans la conformation du pouce observée dans les cristaux, accommoder le brin néosynthétisé (même la forme 5b—ΔC55, dépourvue de connecteur et avec un pouce plus ouvert). Si l’ARN néosynthétisé reste apparié à la matrice dans un complexe d’élongation, il faut d’une part que le pouce s’écarte d’environ 10° autour de l’épingle bêta 15-16 (indiquée figure 4), ce qui amène l’hélice P dans la position de l’hélice H du pouce de VIH-RT (figure 5), hélice donc la fonction est de suivre le petit sillon du duplex [38]. De façon intéressante, ce mouvement de charnière autour de l’épingle bêta 15-16 est celui qui est observé entre les différentes formes cristallines de NS5b (figure 4) [25]. Il faut d’autre part que la deuxième structure en feuillet bêta présente dans le pouce, l’épingle bêta 17-18 qui plonge vers le site actif, s’écarte légèrement de celui-ci.

Comparaison avec la polymérase du phage à ARN double brin j6 : comment NS5b induit de novo la synthèse d’ARN

La comparaison avec la polymérase du VIH a été très riche d’enseignements quant aux mécanismes moléculaires en jeu chez NS5b lors de l’élongation d’un duplex matrice-amorce. Elle ne pouvait cependant pas résoudre les questions concernant l’étape d’induction de novo, puisque VIH-RT induit la synthèse d’ADN par un mécanisme différent (et tout aussi fascinant, [39]). Des informations importantes sur l’induction de novo sont venues de la comparaison avec une autre enzyme homologue : la polymérase du phage à ARN double brin j6 (j6pol). L’homologie entre NS5b et j6pol, révélée par la structure des deux protéines, a été une surprise considérable [30]. Bien que dépourvues d’identité de séquence significative, ces enzymes sont non seulement homologues, mais plus proches structuralement l’une de l’autre que d’aucune autre polymérase de structure connue. Comme NS5b, j6pol induit la synthèse d’ARN de novo et Butcher et al. ont pu déterminer la structure d’un complexe d’induction. Cette structure comprend un court acide nucléique simple brin auquel viennent s’apparier deux nucléotides, l’un au site catalytique C de l’enzyme, l’autre à un deuxième site, baptisé P et positionnant le nucléotide pour des interactions de Watson-Crick avec la base en 3’ de la matrice. Cette structure nous a permis d’interpréter les résultats obtenus au laboratoire sur les structures de complexes entre NS5b et des nucléotides [40]. Nous avons en effet montré qu’un nucléotide pouvait se fixer au site catalytique de NS5b, même en l’absence de matrice, mais aussi qu’une densité électronique supplémentaire dans cette région était interprétable comme la moitié triphosphate d’un second nucléotide, dont la moitié nucléoside est désordonnée en l’absence de matrice. Or, cette moitié triphosphate correspond exactement à celle du nucléotide P décrit par Butcher et al. (figure 6). Ce résultat établit que NS5b induit la synthèse de novo par un mécanisme identique à celui découvert pour j6pol. Il nous a permis aussi d’identifier certains des résidus formant le site P chez NS5b (ceux qui contactent la moitié triphosphate du nucléotide initiateur). La conservation de ces résidus chez des virus apparentés au HCV (flavivirus, pestivirus) ainsi que chez des virus pour lesquels l’induction de novo est un phénomène bien établi (bromovirus) nous amène à proposer que l’induction de novo par un mécanisme identique à celui de j6pol est une propriété d’une large classe de virus à ARN positif. Deux de ces résidus conservés (Ser367 et Arg386) sont situés à la base de l’épingle 15-16, précédemment identifiée comme la charnière autour de laquelle le pouce peut pivoter [19]. Nous avons émis l’hypothèse qu’un changement de conformation du pouce se produit aussi lors de l’induction de novo par NS5b, conduisant cette fois à une position plus fermée de ce sous-domaine [40]. Il viendrait ainsi, comme chez j6pol, apporter une « plate-forme d’induction » qui maintient la base du nucléotide au site P dans une position propre à établir des interactions de Watson-Crick avec la base en 3’ de la matrice [30]. Dans le cadre de cette hypothèse, c’est au moins en partie en maintenant le pouce en conformation fermée que le connecteur interviendrait dans la différenciation entre induction et élongation [35].

Une région périphérique de liaison à des petites molécules

Un dernier résultat de notre étude de complexes avec des nucléotides reste à ce jour inexpliqué : il s’agit de l’existence d’un site de liaison au GTP à la surface de NS5b, très loin de la région catalytique de l’enzyme et composé de résidus conservés (figure 7). Il pourrait être lié à l’activation in vitro de NS5b par le GTP [16, 41]. On a montré depuis que la fixation d’inhibiteurs non nucléosidiques de NS5b avait lieu dans une crevasse située sous ce site GTP (figure 7) [27, 28]. Cette observation suggère une régulation allostérique de l’enzyme, qui pourrait intervenir dans le basculement induction-élongation. Nous avons vu en effet que cette transition impliquait un changement de conformation important dans la partie C-terminale (pouce et connecteur). Une autre possibilité (n’excluant pas la précédente) est que le site GTP de surface intervient dans l’oligomérisation de NS5b. Ce phénomène et le lien entre oligomérisation et activation de NS5b ont été rapportés dans deux publications [26, 42]. Dans la première, deux résidus nécessaires à la fois à l’oligomérisation et à l’activité de NS5b ont été identifiés (positions 18 et 502). L’un deux se trouve à proximité du site GTP (figure 7). Quelle que soit la fonction de ce site, il peut représenter une nouvelle cible dans la recherche d’inhibiteurs contre NS5b.

Conclusion

Nous sommes à présent à un moment charnière de la lutte contre le HCV. Le traitement existant atteint les limites de son efficacité et seuls des essais cliniques permettront de déterminer la valeur des molécules candidates actuelles comme médicaments [43]. Dans la perspective de l’amélioration rationnelle des nouvelles molécules dirigées contre NS5b ou de la recherche de nouvelles pistes, les structures de complexes avec des ARN font pour l’instant cruellement défaut. La détermination de la structure d’un complexe d’induction ou d’élongation pour NS5b constituerait donc un grand pas en avant, non seulement pour la compréhension de la biologie du HCV, mais aussi pour la recherche pharmacologique dans la lutte contre ce virus.

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