Un virus d’insecte au service des hommes

ARTICLE

Auteur(s) : G. Devauchelle*

* Laboratoire de pathologie comparée, INRA-CNRS-UMII, Équipe Baculovirus et Thérapie, 30 380 Saint-Christol-lèz-Alès

Quelques rappels sur le baculovirus 

Il est bien connu que les insectes, eux aussi, ont leurs maladies à virus. La sériciculture a, au siècle dernier, payé un lourd tribut par une mortalité importante des vers à soie, mortalité liée à différents agents pathogènes, dont certaines viroses spécifiques de ces papillons. Aujourd’hui, on peut aussi constater une recrudescence de maladies virales chez les abeilles, recrudescence peut-être liée à un environnement défavorable à ces insectes. Cependant, si les virus d’insectes peuvent causer des dégâts importants aux arthropodes utiles, il est au moins un groupe dont la connaissance ouvre des perspectives particulièrement intéressantes et nouvelles : ce sont les Baculovirus. Dans le monde de la virologie, au-delà d’aspects fondamentaux entièrement originaux que présentent ces virus, leur maîtrise, grâce aux techniques modernes de la biologie, en fait des « outils » performants pour lutter contre les insectes nuisibles, pour fabriquer des protéines recombinantes et même pour vectoriser des molécules d’ADN dans des cellules de mammifères.
Chez les insectes, la transmission des virus se fait essentiellement per os. Les chenilles de papillons s’infectent par ingestion de feuilles contaminées par le virus. L’infection peut alors se développer, entraînant la mort des larves. Ce mode de transmission implique que les virions soient largement disséminés dans la nature. Pour résister à des conditions extérieures parfois défavorables, les virus d’insecte ont développé deux stratégies essentielles : 1) la stratégie du très grand nombre, plusieurs milligrammes de particules virales par chenille, comme c’est le cas pour les iridovirus, 2) la formation de véritables structures de résistance sous forme de matrices protéiques synthétisées dans la cellule en fin du cycle d’infection pour protéger les virions et en assurer la transmission. Trois familles de virus d’insectes ont adopté cette deuxième stratégie : les entomopoxvirus dont de nombreux virions sont inclus dans des sphérules formées d’une matrice cristalline de grande taille, les cypovirus, agents de la polyèdrose cytoplasmique inclus quant à eux dans une matrice à contour polygonal, et les baculovirus, agents de la polyédrose nucléaire, qui sont inclus dans des polyèdres. C’est ce dernier groupe, dont certaines propriétés sont uniques dans le monde des virus, qui nous intéresse ici. Nous en présenterons quelques aspects. Strictement inféodés aux arthropodes, et plus particulièrement aux insectes, les baculovirus sont retrouvés présents dans plusieurs familles comme les Lépidoptères dont ils infectent les chenilles. Du point de vue taxonomique, la famille Baculoviridae se subdivise en plusieurs genres. Le génome est constitué d’une molécule d’ADN bicaténaire, circulaire dont la taille est comprise entre 80 et 200 kbp. La particule virale se présente sous forme d’un bâtonnet de 40 à 60 nm de diamètre pour une longueur de 250 à 350 nm. Ce sont les seuls virus à ADN, de grande taille, dont le génome nu est infectieux et dont la capside a une symétrie hélicoïdale. Cela pourrait expliquer la variabilité de la taille de leurs génomes et permettre d’y inclure de très grands fragments d’ADN étranger : la longueur de la nucléocapside est proportionnelle à la quantité d’ADN encapsidée.

Les baculovirus, objets d’étude en virologie

Compte tenu de leurs originalités, l’étude approfondie de leur cycle de multiplication est une mine de connaissances nouvelles pour la virologie. Soulignons deux aspects qui nous semblent intéressants. En premier, chez les Baculoviridae qui forment des polyèdres nucléaires, on distingue deux types de particules infectieuses per os : des particules qui ne renferment qu’un seul virion (single nucleo polyhedro virus ou SNPV) et d’autres qui renferment plusieurs virions (multiple nucleo polyhedro virus ou MNPV). Dans ce dernier cas, l’unité infectieuse renferme plusieurs génotypes. Au cours d’infections virales successives, il est fréquent de voir apparaître des particules défectives interférentes (DI) dont le génome plus petit peut souvent, grâce à la complémentation, se propager et envahir les cultures cellulaires. Or, récemment, l’équipe animée par Miguel Lopez-Ferber de notre laboratoire, en collaboration avec des chercheurs espagnols, a publié un travail particulièrement original [1], analysé et commenté dans Nature [2]. En bref, elle a démontré que, chez les MNPV, certaines unités infectieuses étaient constituées de deux types de virions : des particules avec un génome complet et des particules DI qui contiennent un génome amputé. Ces dernières ne sont pas infectieuses par ingestion, car elles sont amputées d’un gène essentiel à la pénétration dans les cellules intestinales de l’insecte (gène pif : per os infectivity factor) [3] ; or elles persistent au cours des infections d’insecte à insecte. Cette observation traduit un mutualisme entre deux types de particules virales, l’une infectieuse per os et dont le génome est de grande taille, l’autre non infectieuse per os, avec un génome plus petit mais dont l’association permet d’augmenter la pathogénicité. Nous essayons aujourd’hui de comprendre pourquoi. Un deuxième aspect concerne l’existence au cours du cycle de multiplication du virus de deux types de virions (figure 1) : l’un qui va permettre de transmettre l’infection d’insecte à insecte, il s’agira des particules virales incluses dans les polyèdres, et l’autre qui est responsable de la transmission des virus de cellule à cellule, ce sont les virus bourgeonnants. Si la composition des nucléocapsides de ces deux types est très semblable, il n’en est pas de même pour leurs enveloppes [2] : les virions inclus dans les polyèdres, seuls infectieux per os, possèdent dans leur enveloppe plusieurs protéines qui n’existent pas dans les virions bourgeonnants, ces derniers possédant une glycoprotéine absente de l’enveloppe des particules incluses.

Les baculovirus, outils pour la lutte biologique

Pathogènes pour quelques insectes seulement, non pathogènes pour les vertébrés, les baculovirus sont depuis plusieurs années considérés comme d’excellents candidats en lutte biologique ciblée contre certains insectes, en particulier les ravageurs des cultures. Cette utilisation entomopathogène est aujourd’hui répandue dans le monde entier mais le plus souvent à petite échelle en raison de plusieurs problèmes : 1) les caractéristiques propres du matériel vivant comme la spécificité d’hôte qui est un atout mais implique en contrepartie l’utilisation de plusieurs agents pathogènes pour traiter une même culture parasitée par plusieurs hôtes différents ; 2) le problème de la production du produit actif qu’est le virus : il faut le produire sur larves d’insectes ou sur cultures cellulaires, ce qui représente souvent un « coût » important, de 15 à 50 $ par hectare à traiter ; 3) la nécessité d’une formulation des produits et de techniques d’administration spécifiques ; 4) le contrôle de qualité du bio-insecticide. Tous ces problèmes sont en cours d’étude aujourd’hui dans différents laboratoires. L’intérêt d’utiliser ces agents biologiques - comme on le fait avec d’autres agents pathogènes d’insectes tels que les bactéries, les champignons, les nématodes ou les trichogrammes - est évident à notre époque où l’utilisation des insecticides chimiques produit les effets néfastes que l’on sait. Il est paradoxal que l’état d’esprit des industriels spécialisés dans la protection des cultures, de même que celui des grands agriculteurs, soient un frein réel à l’utilisation de ces insecticides biologiques. La tradition et l’expérience de l’utilisation des insecticides chimiques d’une part et les contraintes nouvelles liées à un matériel biologique d’autre part en sont certainement responsables. Si ces méthodes de lutte biologique, à l’aide de virus, n’ont pas apporté de résultats importants dans les pays développés, elles fournissent aujourd’hui des résultats remarquables dans les pays en voie de développement, pays dans lesquels les producteurs n’ont pas d’a priori sur la façon d’entretenir les cultures et où le coût de la main d’œuvre n’est pas un facteur limitant [4]. Aujourd’hui il y a sur le marché plus de 15 préparations à base de virus d’insectes, principalement des virus pathogènes des chenilles de papillon. De très bons résultats ont été encore récemment obtenus à Madagascar par une société française ainsi qu’en Égypte et en Équateur où nous travaillons en collaboration avec quelques chercheurs de l’Institut de recherche pour le développement (IRD). Toutefois, un important travail reste à faire d’abord pour mieux connaître ces virus, leur stratégie d’infection et de multiplication, optimiser les méthodes d’obtention en automatisant la chaîne de production, mieux contrôler les méthodes de préparation et de pulvérisation en champ. Il existe une véritable alternative à l’usage exclusif et intensif des insecticides chimiques, dans une perspective d’agriculture propre et de développement durable ; il serait dommage de ne pas développer les recherches visant à optimiser l’utilisation de ces virus entomopathogènes.

Les baculovirus, usines à produire des protéines recombinantes

Au cours des vingt dernières années, la technologie « baculovirus-cellules d’insectes » a permis de produire de très nombreuses protéines recombinantes aussi bien comme outils de laboratoire que pour le diagnostic de maladies humaines ou vétérinaires, voire pour la thérapie chez l’homme et chez l’animal. C’est à Loïs Miller que l’on doit l’idée d’utiliser ces virus comme vecteur d’expression de gènes étrangers. Dès 1981, elle indiquait que, si les polyèdres qui protègent les virions sont indispensables pour la multiplication du virus dans la nature, en culture cellulaire ils ne sont pas infectieux. Ainsi, la polyèdrine, protéine constitutive des polyèdres, produite tardivement et en très grande quantité dans le cycle viral, n’était pas utile. Dès lors, l’idée de remplacer le gène codant cette protéine par celui d’une protéine étrangère était envisageable, d’autant plus qu’il était aisé d’obtenir une recombinaison homologue chez ces virus [5]. Dès1983 l’équipe de Max Summers réussissait à produire de l’interféron β humain recombinant [6]. En 1987, nous démontrions que le promoteur du gène d’une autre protéine tardive fortement exprimée (P10), pouvait être aussi utilisé pour produire une protéine étrangère [7]. Depuis, plusieurs milliers de protéines recombinantes ont été produites dans le monde entier, dont plusieurs centaines dans l’équipe de Martine Cérutti de notre laboratoire. Le système permet de produire des molécules simples aussi bien que des assemblages protéiques complexes : ainsi cette équipe produit des anticorps monoclonaux chimériques, humanisés ou humains, en introduisant, dans les deux locus disponibles du gène de la polyédrine ou du polypeptide P10, les gènes codant pour les régions constantes des chaînes lourdes et des chaînes légères d’une immunoglobuline humaine. En outre un système de « cassettes » permet d’introduire en amont de ces régions constantes les régions variables des immunoglobulines voulues provenant soit d’hybridomes murins qui pourront être humanisés [8], soit directement de lymphocytes humains. Compte tenu de l’intérêt croissant de ce type de molécules pour le diagnostic et la thérapie, cet outil performant intéresse plusieurs partenaires. Avec ce même système, de nombreuses équipes ont obtenu des virus-like particles (VLP) à partir de protéines de capsides de différents virus. Ces VLP sont de bons candidats comme vaccin par exemple chez l’homme, avec les protéines L1 et L2 du virus du papillome ou encore chez le chat pour le FIV. De même, la coexpression de la protéine gag du HIV avec une glycoprotéine de surface de l’herpèsvirus porcin responsable de la maladie d’Aujeszky donne des VLP très immunogènes. Sur un plan industriel dans ce domaine de la vaccinologie, la société Protein Sciences Corporation dispose de vaccins recombinants contre l’influenza aviaire et porcin obtenus grâce à la technologie baculovirus-cellules d’insectes. Un candidat vaccin basé sur l’hémagglutinine de la souche aviaire H5N1 est en phase clinique III chez l’homme. De même, cette société espère pouvoir commencer en 2005 l’expérimentation chez l’homme d’un candidat vaccin à partir de la protéine S contre le coronavirus responsable du SARS.

Les baculovirus, vecteurs de gènes

Si les baculovirus sont totalement inoffensifs pour l’homme et les animaux supérieurs, ils sont aussi d’excellents vecteurs pour introduire des gènes étrangers dans des cellules de mammifères. Une particularité réside dans le fait que, dans la cellule de mammifères, aucun de leurs promoteurs précoces ou tardifs ne sont transcrits par les polymérases cellulaires. Cependant, si les gènes d’intérêt sont placés sous contrôle de promoteurs reconnus par les ARN polymérases cellulaires, ils peuvent être exprimés, faisant du baculovirus un candidat potentiel intéressant pour le transfert de gènes dans des cellules de vertébrés et chez l’homme en particulier. Des résultats particulièrement encourageants ont été obtenus par des chercheurs de GlaxoSmithKline [9]. Ce système présente de nombreux avantages, notamment : 1) un génome flexible permettant d’intégrer de très grands fragments d’ADN - jusqu’à 35 kbp dérivé du génome d’un autre virus dans notre laboratoire ; 2) la capacité d’infecter un très grand nombre de lignées cellulaires sans jamais s’y répliquer ; 3) l’absence de risques de recombinaison ou de complémentation avec d’autres virus. On peut aussi aisément modifier le tropisme de ces virus par pseudotypage à l’aide de glycoprotéines de surface d’autres virus comme celles du VSV. Quelques problèmes restent néanmoins à résoudre pour l’utilisation in vivo de ces vecteurs comme la sensibilité du virus à certains composants du complément lorsqu’on administre un baculovirus à l’animal. Ce problème peut cependant être résolu grâce à l’expression de la protéine DAF (decay accelerating factor) en fusion avec la glycoprotéine de surface gp64 du baculovirus. Parmi beaucoup d’autres, les travaux de l’équipe de J. Mallet (Pitié-Salpétrière) sont particulièrement prometteurs [10]. Il s’agit de la transformation de cellules neurales in vitro et in vivo dans le cerveau de souris et de rats à l’aide de baculovirus recombinants exprimant un gène rapporteur sous contrôle du promoteur CMV. Ainsi, une nouvelle génération de vecteurs dérivés des baculovirus pourrait être construite pour augmenter l’efficacité de la transformation et l’expression du transgène sur le long terme.

Conclusion

Il est normal que la France, comme d’autres pays, oriente une partie de son potentiel de recherche vers l’étude de virus qui posent des problèmes pour la santé humaine et auxquels sont associés les notions de maladies et de mort. À l’opposé, les baculovirus n’affectent en rien la santé humaine ou animale, mais se présentent plutôt comme des virus utiles à l’homme. Ils permettent déjà de produire de nombreuses protéines qui sont commercialisées pour le diagnostic ou qui le seront comme vaccins chez l’homme et chez l’animal. De même, il y a aujourd’hui plus de 70 anticorps monoclonaux en cours de validation en thérapie humaine, notamment pour l’immunothérapie passive contre certains virus. Le système baculovirus-cellules d’insectes offre d’intéressantes perspectives pour produire de tels anticorps recombinants, il en est de même en matière de « vectorologie »
Aujourd’hui les États-Unis, le Canada, le Japon et même la Chine ont beaucoup investi dans ces technologies issues des baculovirus. Plus près de nous, les Anglais, les Allemands, les Hollandais, les Espagnols s’intéressent beaucoup à leurs applications, aussi bien pour la lutte biologique (plusieurs milliers d’hectares de serre en cours de traitement) que comme système de production de protéines recombinantes. Tous investissent dans la recherche fondamentale, indispensable pour augmenter les connaissances de la génétique de la régulation de la transcription des promoteurs tardifs ou de « l’habillage » de l’ADN viral et ainsi être plus performant dans l’utilisation de ces virus. Il est dommage qu’en France seuls quelques trop rares chercheurs consacrent leurs travaux à l’étude de ces virus¹. En effet, si aujourd’hui de très nombreux laboratoires publics et privés utilisent cet « outil » exceptionnel dans les domaines d’application que nous avons évoqués, demain, nous dépendrons entièrement des connaissances, des améliorations technologiques et des brevets réalisées par des laboratoires étrangers pour pouvoir nous-mêmes l’utiliser.

Références

1. Lopez-Ferber M, Simon O, Williams T, Caballero P. Deffective or effective ? Mutualistic interactions between virus genotypes. Proc R Soc LondB 2003 ; 270 : 2249-55.

2. Frank SA. Deadly partnerships. Nature 2003 : 425 : 251-2.

3. Kikhno I, Gutierrez S, Croizier L, Croizier G, Lopez-Ferber M. Characterization of pif, a gene required for the per os infectivity of Spodoptera littoralis nucleopolyhedrovirus. J Gen Virol 2002 ; 83 : 3013-22.

4. Caballero P, Lopez-Ferber M, Williams T eds. Los baculovirus y sus plicaciones como bioinsccticidas en el control biologico de plagas.Universidad Publica de Navarra, Phytoma 2001.

5. Miller L. Construction of a genetic map of the baculovirus autographa californica nuclear polyhedrosis virus by marker rescue of temperature-sensitive mutants. J Virol 1981 ; 39 : 973-6.

6. Smith GE, Summers MD, Fraser MJ. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol Cell Biol1983 ; 3 : 2156-65.

7. Gonnet P, Devauchelle G. Obtention par recombinaison dans le gène du polypeptide P10 d’un baculovirus exprimant le gène de résistance à la néomycine dans des cellules d’insecte. CR Acad Sci Ser III 1987 ; 305 : 111-4.

8. Poul MA, Cerutti M, Chaabihi Het al. Cassette baculovirus vectors for the production of chimeric, humanized, or human antibodies in insect cells. Eur J Immunol 1995 ; 25 : 2005-9.

9. Kost TA, Condreay JP. Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors. Trends Biotechnol 2002 ; 4 : 173-80.

10. Sarkis C, Serguera C, Petres S, et al. Efficient transduction of neural cells in vitro and in vivo by a baculovirus-derived vector. Proc Natl Acad Sci USA 2000 ; 97 : 14638-43.

Quelques sites internet :
• Généralités :
http ://www.univ-montp1.fr/biotech/Baculovirus/BaculoStructure.htm
• Baculovirus et lutte biologique :
http ://www.biopesticide.org/Regulatory/Links.htm et
http ://www.sipweb.org/directorymcp/viruses.htm
• Baculovirus et protéines recombinantes :
http ://www.baculovirus.com et
http ://www.proteinsciences.com