Rôle de la glycosylation des protéines d’enveloppe dans la morphogenèse des Flaviviridae et son inhibition par

ARTICLE

Auteur(s) : C. Chapel¹, I. Vuillermoz¹, N. Zitzmann², C. Trépo¹, F. Zoulim¹, D. Durantel¹

¹ Virus hépatiques et pathologies associées, Inserm U271, 151, cours Albert-Thomas, 69424 Lyon
² Glycobiology Institute, Université d’Oxford, South park road, Oxford, Angleterre

N-glycosylation

Les protéines d’enveloppe des Flaviviridae sont N-glycosylées dans le réticulum endoplasmique des cellules infectées. Les N-glycanes jouent un rôle important au cours des phases précoces de la morphogenèse que sont le repliement et l’assemblage des glycoprotéines d’enveloppe. Ils jouent également un rôle important dans les virions libres, puisqu’ils habillent les particules virales et sont impliqués dans l’attachement des virions aux cellules. Dans ce paragraphe, nous proposons une brève revue générale sur la N-glysosylation et l’importance des glycanes pour le repliement, la dégradation des protéines, ainsi que pour le processus de l’entrée virale. Des informations plus précises peuvent être obtenues dans des revue récentes [3, 4].

Synthèse et maturation des N-glycanes dans le réticulum endoplasmique

La synthèse des oligosaccharides, qui sont destinés à être transférés sur les polypeptides naissant dans la lumière du réticulum endoplasmique (RE), commence sur la face cytosolique de ce dernier par l’addition de sucres simples sur le dolichol, un transporteur lipidique membranaire (figure 1). Quand l’oligosaccharide est composé de 5 mannoses et 2 N-acétylglucosamines (Man₅GlcNAc₂), il est alors transloqué vers le côté luminal grâce à une flipase. Une fois dans le RE, l’oligosaccharide est encore modifié par l’ajout de quatre résidus mannose et trois résidus glucose. L’oligosaccharide Glc₃Man₉GlcNAc₂ ainsi pré-assemblé est ensuite transféré en bloc du dolichol-bi-phosphate sur une chaîne polypeptidique en cours de synthèse. L’oligosaccharyl transférase responsable de ce transfert reconnaît un motif consensus spécifique Asn-X-Ser/Thr de la chaîne polypeptidique naissante [3, 4]. Les glucosidases I et II du RE modifient encore ce motif oligosaccharidique en enlevant deux résidus glucose terminaux (figure 1). Le motif Glc₁Man₉GlcNAc₂ ainsi obtenu joue un rôle prépondérant pour le repliement de certaines protéines, dont les glycoprotéines virales. Il est en effet directement reconnu par certaines protéines chaperons résidentes du RE et permet l’interaction de ces dernières avec la partie polypeptidique de glycoprotéines en cours de repliement. D’autres modifications des N-glycanes, telles que l’enlèvement du dernier glucose et de résidus mannose, sont également observées dans le RE comme nous le verrons ci-dessous [3, 4]. Les N-glycanes sont ensuite modifiés quand les protéines transitent dans l’appareil de Golgi. D’une structure tri-antennaire riche en mannose, les N-glycanes sont transformés en structure complexe le plus souvent bi-antennaire que l’on retrouve dans les protéines sécrétées [3]. Il faut noter que, sur certaines glycoprotéines, on retrouve des structures N-glycanes très variées, glycanes complexes et riches en mannose pouvant coexister sur une même protéine. Par ailleurs, une certaine variabilité peut être observée d’une protéine à une autre ; ainsi plusieurs « glycoformes » peuvent être observées pour un même type de protéine.

Rôle des N-glycanes dans le repliement, le contrôle de qualité et la dégradation des protéines cellulaires et virales

Le réticulum endoplasmique offre un environnement propice au repliement des protéines en termes physicochimique (pH, potentiel redox, etc.) et biochimique. De nombreuses protéines cellulaires, dites chaperons, participent et permettent le repliement des protéines qui transitent dans le RE. Elles contrôlent la qualité du processus et retiennent dans le RE les protéines qui n’ont pas encore acquis leur structure tertiaire ou quaternaire [5, 6]. Les chaperons et autres censeurs moléculaires du repliement incluent entre autres les protéines Bip, GRP64 (glucose regulated protein), PDI (protein disulphide isomerase), ERp57 (thiol-disulphide oxidoreductase), calnexine (CNX) et calréticuline (CRT). Ces protéines sont regroupées en deux classes. La première classe regroupe les molécules chaperons telles que BiP ou GRP64 qui ont une affinité pour les acides aminés ou les parties hydrophobes des protéines. La seconde classe regroupe la CNX et la CRT, deux lectines qui reconnaissent non la partie polypeptidique mais les motifs N-glycanes monoglucosylés. Ces chaperons n’ont pas uniquement comme fonction d’assister le repliement des protéines ; ils servent également à retenir dans un environnement favorable des protéines immatures afin qu’elles acquièrent une conformation native. La rétention par ce système de contrôle de qualité repose sur des propriétés générales biophysiques communes aux protéines incomplètement repliées comme la présence de surfaces hydrophobes, de boucles mobiles ou un manque de compactibilité. Les protéines nouvellement synthétisées n’interagissent pas avec toutes les protéines chaperons du RE. Certaines se lient en premier lieu avec BiP puis avec la CNX ou CRT, d’autres ne se lient qu’avec CNX ou CRT ; enfin, certaines s’associent séquentiellement avec BiP puis GRP94. Molinari et al. [7] ont montré que le choix initial d’une protéine chaperon dépend de la localisation de groupements N-glycanes dans la chaîne polypeptidique naissante. Une interaction directe avec CNX et CRT a été observée quand les N-glycanes étaient situés dans les 50 premiers résidus de la partie N-terminale des glycoprotéines p62 et E1 du virus de la forêt de Semliki (SFV). Une étude précise de la localisation des sites de glycosylation dans la séquence linéaire d’une protéine nouvellement synthétisée pourrait donc permettre de déterminer la nature de la molécule chaperon qui assistera le repliement de cette protéine.
L’exemple le mieux connu de contrôle de qualité dans le RE est le cycle CNX-CRT (figure 2). La CNX est une protéine transmembranaire alors que la CRT est soluble dans la lumière du RE. Ces molécules chaperons retiennent dans le RE des glycoprotéines non natives jusqu’à ce qu’elles soient correctement repliées et, dans quelques cas, dirigent ces glycoprotéines mal conformées vers le protéasome [5, 6]. L’interaction de ces lectines avec les N-glycanes a lieu grâce à leur site de liaison se trouvant dans leur domaine globulaire. La spécificité de CNX et CRT à lier des glycanes monoglycosylés conduit à une association transitoire d’une ou des deux protéines chaperons avec quasiment toutes les glycoprotéines synthétisées dans le RE. Par ailleurs, la protéine ERp57s’associe à la CNX et à la CRT liées aux glycoprotéines par des ponts disulfures transitoires [7]. Deux enzymes indépendantes permettent le fonctionnement du cycle CNX-CRT. D’une part, en hydrolysant le résidu glucose du motif N-glycane de la glycoprotéine substrat, la glucosidase II permet la dissociation entre la glycoprotéine et la CNX ou la CRT. D’autre part, la UDP-glucose-glycoprotein glucosyltransferase (GT) est responsable de la reglycosylation du substrat protéique qui peut alors se réassocier avec la CNX ou la CRT. Il est intéressant de noter que l’exposition de groupements hydrophobes et du « premier » résidu GlcNAc sont les caractéristiques reconnues par la glycoprotéine glucosyltransférase [5, 6]. Les études in vivo et in vitro ont montré que la re-glycosylation par cette enzyme n’avait lieu que si la glycoprotéine relarguée par CNX ou CRT était incomplètement repliée. Ainsi, une protéine ne peut quitter ce cycle que si la glucosyltransférase ne peut pas la re-glycosyler. Le résidu glucose est donc un marqueur moléculaire des glycoprotéines mal repliées. Les cycles de glycosylation-déglycosylation ont lieu jusqu’à ce que la glycoprotéine substrat ait atteint sa forme native ou soit dirigée vers une voie de dégradation.

Actuellement, toutes les glycoprotéines virales étudiées subissent le même « traitement » que les protéines cellulaires lors de leur passage dans le RE. Notamment, toutes s’associent avec la CNX et/ou la CRT. Une différence notable est que la plupart des glycoprotéines virales sont plus fortement glycosylées que les glycoprotéines cellulaires [12]. Dans le cas du virus de l’hépatite C (HCV), les deux glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 présentent 6 et 11 sites potentiels de N-glycosylation respectivement [13, 14]. Par ailleurs, contrairement à ce qui est observé pour les protéines cellulaires, le repliement de nombreuses glycoprotéines virales est particulièrement sensible et n’accepte que de faibles « déviations » par rapport à la forme native. Cela pourrait être dû aux contraintes bio et physicochimiques associées à l’assemblage macromoléculaire des virions et à leur bourgeonnement. Il semblerait par ailleurs que ce manque de flexibilité en termes de repliement et d’assemblage des glycoprotéines d’enveloppe soit plus important pour les virus bourgeonnant à partir du RE tels que les Flaviviridae. Ce raisonnement donne une base théorique intéressante pour expliquer la spécificité de l’effet inhibiteur des α-glucosidases sur le repliement des glycoprotéines virales dont nous parlerons dans la dernière partie de cette revue.

Importance des N-glycanes matures dans les particules virales

Outre leur fonction de protection des particules virales, les N-glycanes sont parfois impliqués dans les processus d’attachement aux cellules et même de pénétration. Récemment, il a été montré que le VIH interagissait avec une lectine membranaire spécifique des cellules dendritiques, la protéine DC-SIGN, via ses structures N-glycanes riches en mannose présentes sur gp120 [15]. Dans ce cas, l’interaction n’aboutit pas à l’entrée virale mais permet le transport vers les lymphocytes TCD4+ et favorise l’entrée du virus dans ces cellules [16]. Depuis cette découverte, il a été montré que de nombreux virus, dont le virus Ebola et le cytomégalovirus, interagissaient également avec DC-SIGN [17]. Dans le cas du virus Ebola, il a de plus été montré que cette interaction permettait l’entrée et la réplication virales [18]. Ce résultat est très important car il suggère que les N-glycanes peuvent être directement responsables de l’entrée virale.
Très peu de données sont disponibles en ce qui concerne la structure des N-glycanes associés aux virions libres chez les Flaviviridae, y compris pour certains flavivirus (DEN et WNV) pour lesquels la structure des particules virales a été analysée en détails [19, 20]. En fait plusieurs structures N-glycanes, complexes et riches en mannose, seraient présentes sur les glycoprotéines d’enveloppe. La présence de structures riches en mannose est suggérée de manière indirecte par la capacité de certains Flaviviridae à interagir avec DC-SIGN ou L-SIGN [15, 21, 22]. En effet deux membres des Flaviviridae, le virus de la dengue et le HCV, interagissent respectivement avec les lectines DC-SIGN et L-SIGN qui présentent des affinités importantes pour les structures riches en mannose [21, 22]. De plus, dans le cas du virus de la dengue, cette interaction permettrait la pénétration et la réplication du virus dans des cellules de moustiques [21, 22].

Morphogenèse et structure des virions chez les Flaviviridae

Les virus de la famille Flaviviridae sont des virus enveloppés contenant un génome sous forme d’ARN simple brin de polarité positive long de 9 à 12 kb, qui comprend un seul cadre de lecture ouvert flanqué de deux régions non codantes, en 5’ et 3’. Leur organisation génomique est très similaire : les régions codant les protéines de structure sont toujours situées en 5’ et précèdent les régions codant les protéines non structurales qui assurent les fonctions enzymatiques essentielles à la réplication du génome viral (figure 4). Le cycle de réplication des virus de cette famille est très similaire (figure 5). La réplication du génome ainsi que l’assemblage des particules virales sont étroitement associés à la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Les particules virales bourgeonnent dans ce dernier et transitent par l’appareil de Golgi puis les vésicules de sécrétion avant d’atteindre la membrane plasmique et d’être libérées dans le milieu extracellulaire [1]. La structure des virions est elle aussi comparable et inclut toujours les mêmes types de protéines : l’ARN génomique est complexé à une protéine virale très basique, la capside, pour former une nucléocapside et cette dernière est entourée d’une bicouche lipidique dérivée de l’hôte dans laquelle sont insérées les glycoprotéines d’enveloppe jouant un rôle fondamental dans l’entrée du virus dans la cellule.

Flavivirus

Les flavivirus apparaissent en microscopie électronique sous la forme d’une particule sphérique de 40 à 60 nm de diamètre, composée d’une nucléocapside d’environ 30 nm de diamètre entourée d’une membrane lipidique dérivée de l’hôte. Trois protéines structurales sont associées aux virions : la capside et deux protéines membranaires, une petite protéine M non glycosylée et la protéine majeure de surface E, qui, elle, est souvent glycosylée. L’étude détaillée de l’enveloppe des virus DEN, TBE et WN a montré que la surface des flavivirus présente une structure très ordonnée dépourvue de spicules projetées vers l’extérieur [19, 20]. En effet, la protéine E est ancrée à la membrane virale et forme, à la surface du virion, des homodimères disposés parallèlement, et non perpendiculairement, à cette membrane. L’analyse de l’architecture moléculaire des virions du virus de la dengue a montré que 90 de ces dimères E, associés trois par trois de manière presque parallèle, forment une enveloppe très structurée à symétrie icosaédrique [20]. La structure tertiaire de l’ectodomaine de la protéine E, obtenue par cristallographie, est divisée en trois domaines : le domaine I central qui porte l’extrémité N-terminale ainsi que le site de N-glycosylation commun à tous les flavivirus, le domaine II, qui est composé de deux longues boucles formant une structure de type « doigt » et permet la dimérisation, et le domaine III, de type immunoglobuline et dont l’axe est orienté perpendiculairement à la membrane [19, 20]. Cette protéine E joue probablement un rôle dans l’entrée du virus dans la cellule, à la fois dans l’interaction avec le ou les récepteurs de surface, qui ne sont pas encore clairement identifiés, et dans la fusion des membranes virales et cellulaires à pH acide après endocytose [1]. Le domaine III, projeté vers l’extérieur et ayant une structure de type immunoglobuline propice aux interactions protéine-protéine, pourrait reconnaître le récepteur cellulaire. De plus, à pH inférieur ou égal à 6,5, les dimères E-E se réorganisent en trimères afin d’exposer un peptide hydrophobe de fusion qui semble être localisé à l’extrémité distale du domaine II [20].
Les protéines d’enveloppe prM et E jouent un rôle majeur dans l’assemblage et la morphogenèse des flavivirus. En effet, l’expression des seules protéines prM et E des virus TBE et JEV en culture cellulaire suffit à la formation et à la sécrétion de particules subvirales, ayant des caractéristiques structurales et fonctionnelles similaires à celles de l’enveloppe de virions complets [23]. Ces particules subvirales représentent un matériel intéressant pour des applications vaccinales. Le clivage et la formation de ces deux protéines virales se font dans le RE rugueux. En effet, bien que présentant un fort caractère basique en accord avec sa fonction d’encapsidation de l’ARN viral, la protéine C porte à son extrémité C-terminale un domaine hydrophobe permettant de façon temporaire son ancrage à la membrane du RE. Ce domaine sert de séquence signal pour la translocation de la protéine suivante, prM, dans la lumière du RE. Le clivage de ce domaine hydrophobe en N-terminal par la protéase virale NS3, puis en C-terminal par une signal peptidase du RE, génère une protéine C mature et libère la protéine prM de son peptide signal. La protéine C mature reste néanmoins associée aux membranes cellulaires, probablement par une courte séquence hydrophobe dans sa partie centrale [1]. Les deux autres protéines structurales, prM et E, portent à leur extrémité C-terminale deux segments hydrophobes séparés par quelques résidus hydrophiles. Lorsque la protéine prM a traversé la membrane du RE, le premier de ses segments hydrophobes C-terminaux interrompt le transfert dans le RE et permet son ancrage à la membrane du RE. Le second segment hydrophobe sert de séquence signal pour la protéine E en aval et permet donc sa translocation dans le RE. La protéine E est elle aussi séparée de son peptide signal par une signal peptidase du RE et poursuit sa translocation. Comme pour prM, deux segments hydrophobes C-terminaux stoppent son transfert dans le RE et déclenchent celui de la protéine NS1, respectivement. [1]. Une fois transférées dans la lumière du RE et clivées, les protéines prM et E se replient et acquièrent leur conformation native, grâce à la formation de ponts disulfures intramoléculaires. Si la maturation de la protéine prM est rapide, il n’en est pas de même pour la protéine E qui doit s’associer avec prM pour achever sa maturation [24]. Cette hétérodimérisation implique des sites dans l’ectodomaine de ces deux protéines et semble stabilisée par les domaines transmembranaires. Les domaines transmembranaires de prM et E semblent également jouer un rôle dans les étapes plus tardives de la morphogenèse virale, peut-être lors de la multimérisation des hétérodimères permettant le bourgeonnement de la particule [25]. En s’associant avec la protéine E, la protéine prM joue non seulement un rôle de chaperon lors de la maturation de la protéine d’enveloppe mais également un rôle de protection des fonctions de cette enveloppe lors des étapes tardives de la morphogenèse, en empêchant l’exposition prématurée du peptide de fusion lors de leur transit dans les compartiments acides de la voie de sécrétion [1]. Durant leur séjour dans le RE, les protéines prM et E ainsi que la protéine NS1 subissent des modifications post-traductionnelles, en particulier des N-glycosylations. Le taux de glycosylation de ces protéines varie cependant selon les flavivirus et les souches. La protéine prM, toujours glycosylée, contient 1 à 3 sites de N-glycosylation dans son segment N-terminal « pr » qui est clivé au cours de la maturation des virions dans l’appareil de Golgi ; c’est pourquoi la protéine M n’est pas glycosylée dans les virions libres. En revanche, si la plupart des flavivirus contiennent un site potentiel de N-glycosylation dans la séquence de la protéine E (Asn153/154), ce site n’est pas utilisé chez tous les virus et tous les isolats comme ont pu le montrer des études portant sur le virus Kunjin, les virus DEN ou YF [1, 23]. De plus, ce site est absent chez certains flavivirus, comme le virus WN dont la protéine E ne porte pas de N-glycosylation [1, 23]. La déglycosylation de la protéine E du virus TBE montre que les N-glycanes ne semblent pas jouer de rôle dans la structure antigénique et la fonction de la protéine E, ce qui est en accord avec la diversité des profils de glycosylation observés entre virus et entre souches pour cette protéine. Cependant, dans le modèle des particules subvirales du virus TBE reposant sur la simple expression des protéines prM et E, la formation de N-glycanes sur la protéine E semble essentielle à la formation des complexes prM-E et des dimères E-E. De plus, la modification de ces glycanes par les α-glucosidases du RE permet leur interaction avec les chaperons du RE qui assisteraient la multimérisation nécessaire au bourgeonnement de la particule [23]. Ainsi, la glycosylation des protéines d’enveloppe des flavivirus, bien que variable selon les souches, semble jouer un rôle important dans la morphogenèse virale.

L’association des protéines structurales des flavivirus avec la membrane du RE, en particulier l’orientation des protéines d’enveloppe prM et E et leur topologie dans la bicouche lipidique, suggère un assemblage de la nucléocapside à la face cytosolique de la membrane du RE suivie du bourgeonnement de la particule dans la lumière du RE permettant l’acquisition de l’enveloppe. La multimérisation des protéines prM et E permettrait la formation d’un treillage qui induirait ce bourgeonnement. Bien qu’un tel processus d’assemblage de la particule virale n’ait jamais été observé directement chez les flavivirus, l’infection de cellules de mammifères par le virus Kunjin a en effet permis d’observer, par microscopie électronique et immunomarquage, la présence de particules virales dans le RE rugueux [26]. Ces observations concordent avec le modèle envisagé. De plus, les cellules infectées présentent, en continuité avec la membrane du RE, une accumulation de membranes intracytoplasmiques, parfois circonvolutées, où sont colocalisées les protéines prM et E [26]. Ces modifications ultrastructurales pourraient être le site du clivage de la polyprotéine et de l’assemblage des virions. Une fois formés, les virions quittent probablement le RE pour rejoindre l’appareil de Golgi où ils achèvent leur maturation. En effet, certains des N-glycanes portés par les glycoprotéines virales sont modifiés en glycanes complexes. De plus, juste avant la libération des virions matures dans le milieu extracellulaire, la protéine prM est clivée par une protéase de l’appareil de Golgi, probablement une furine, libérant ainsi le fragment pr glycosylé et laissant la protéine M associée à l’enveloppe virale [1]. Ce clivage permet à la protéine E de devenir compétente pour l’activité de fusion. Les virions doivent alors se regrouper dans la région trans de l’appareil de Golgi et s’accumuler dans de grandes vésicules d’exocytose qui vont permettre leur libération dans le milieu extracellulaire [1, 26].

Pestivirus

Les pestivirus ont un faible taux de réplication et de synthèse protéique en culture cellulaire. Leur sécrétion dans le milieu de culture est peu efficace et ils sont souvent associés à des débris cellulaires, ce qui complique la purification et la visualisation de ces virus. Néanmoins, des systèmes de culture adaptés ont permis d’observer des virions dont la structure est similaire à celle des flavivirus : une particule sphérique enveloppée de 40 à 60 nm de diamètre contenant une nucléocapside de 30 nm de diamètre [1]. Quatre protéines structurales composent ces virions : la protéine C de capside et trois glycoprotéines d’enveloppe, Erns, E1 et E2. La protéine Erns est appelée ainsi car elle possède une activité ribonucléase. Son rôle dans le cycle des pestivirus est cependant encore mal compris mais il semble essentiel puisque des anticorps dirigés contre cette activité neutralisent l’infectiosité des pestivirus [1]. Cette particularité n’est pas partagée par les autres membres de la famille des Flaviviridae. Les glycoprotéines d’enveloppe forment en particulier des hétérodimères E1-E2 liés par des ponts disulfures qui semblent représenter le complexe majeur à la surface des virions [1, 27]. Contrairement aux protéines E1 et E2, Erns ne possède pas de domaine d’ancrage à la membrane lipidique formant l’enveloppe virale et elle est en partie sécrétée dans le milieu extracellulaire. Cependant, cette protéine est également retrouvée sur les virions [1]. En effet, des analyses d’immunoprécipitation des protéines d’enveloppe du VDBV en conditions réductrices et non réductrices ont montré récemment que Erns et E2 étaient associées de manière covalente par des ponts disulfures intermoléculaires sur les virions matures sécrétés dans le milieu extracellulaire comme dans les cellules infectées [28]. Les protéines Erns et E2 semblent jouer toutes les deux un rôle important dans l’attachement et l’entrée des pestivirus dans les cellules cibles puisqu’elles interagissent avec des molécules de la surface cellulaire [29]. De plus, elles peuvent induire une réponse humorale neutralisante. La structure détaillée de l’enveloppe des pestivirus n’est cependant pas connue.
Le clivage et la formation des protéines d’enveloppe des pestivirus ont lieu, comme pour les flavivirus, dans le RE. L’extrémité C-terminale de la protéine de capside contient en effet un peptide signal dirigeant la chaîne naissante du précurseur Erns-E1-E2 dans la lumière du RE. Le clivage entre la capside et ce précurseur, effectué par une signal peptidase du RE, intervient alors rapidement. L’extrémité C-terminale des protéines E1 et E2 est constituée de deux segments hydrophobes. Comme dans le cas des protéines prM et E des flavivirus, le premier segment stoppe le transfert de la protéine en amont et permet son ancrage à la membrane du RE tandis que le second déclenche le transfert de la protéine en aval dans le RE. Le précurseur Erns-E1-E2 est rapidement clivé par une signal peptidase du RE. La protéine E2 est libérée du précurseur Erns-E1 dans un premier temps et le clivage Erns-E1 intervient plus tardivement [1]. Entre les protéines structurales et non structurales se trouve un petit peptide hydrophobe de 7 kDa (p7) requis pour la production de particules infectieuses. Le clivage entre E2 et p7 est cependant incomplet et les deux formes, E2 et E2-p7, sont stables et coexistent dans les cellules infectées, formant toutes les deux des complexes avec Erns. Une seule des deux formes cependant est retrouvée en association avec Erns à la surface des virions [28].
Dans la lumière du RE, les trois protéines d’enveloppe Erns, E1 et E2 acquièrent des N-glycanes. La protéine Erns, la plus glycosylée, porte 7 à 9 sites potentiels de N-glycosylation dont la plupart semblent être utilisés en culture cellulaire. La protéine E1 porte 2 à 3 sites potentiels tandis que E2 en porte 4 à 6. Des modifications de la chaîne oligosaccharidique de ces protéines doivent intervenir au cours de leur transit à travers l’appareil de Golgi comme l’atteste la réduction de leur mobilité électrophorétique lors de leur sécrétion [1]. Ces trois glycoprotéines s’associent en complexes stabilisés par des ponts disulfures : elles forment des homodimères Erns-Erns et E2-E2 ainsi que des hétérodimères E1-E2. Bien que ces trois formes semblent présentes également à la surface des particules, l’hétérodimère E1-E2 semble représenter le complexe majeur et le composant fonctionnel des virions matures [1, 27]. L’analyse détaillée du processus d’assemblage de cet hétérodimère dans des cellules infectées par le VDBV montre que l’étape limitante est la formation de la protéine E1. Alors que les espèces protéiques E2 et E2-p7 acquièrent pendant ou dès la fin de la traduction une conformation compacte, le repliement de E1 se déroule lentement [27]. La formation de ponts disulfures intramoléculaires est cruciale pour l’acquisition d’une conformation native et stable [30]. Durant la formation de ces ponts disulfures intramoléculaires, les glycoprotéines E1 et E2/E2-p7 s’associent avec la CNX. L’association de E1 avec cette chaperon dure plus longtemps que pour E2/E2-p7 et la dissociation E1-CNX coïncide avec le début de la formation de l’hétérodimère E1-E2. La formation des hétérodimères E1-E2 dépend du repliement correct de ces deux glycoprotéines et donc de leur interaction avec la CNX. La réduction des glucoses à l’extrémité des N-glycanes des glycoprotéines du VDBV est nécessaire pour que cette interaction ait lieu. En l’absence de ce réarrangement de la chaîne oligosaccharidique, l’interaction avec la CNX n’a pas lieu et la formation d’hétérodimères E1-E2 est fortement diminuée, entraînant une réduction de la formation de particules infectieuses [27]. À l’exception de l’assemblage des glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2, aucune donnée n’est disponible sur l’assemblage de la particule virale et le relarguage des virions de la cellule infectée. Cependant, la formation des complexes de glycoprotéines d’enveloppe ayant lieu dans le RE comme pour les flavivirus, il est probable que les pestivirus suivent le même schéma qu’eux et bourgeonnent dans le RE pour suivre ensuite la voie sécrétoire jusqu’à la membrane plasmique.

Virus de l’hépatite C

L’étude de la morphogenèse du HCV a été retardée par le fait qu’il n’existe pas de système cellulaire capable de propager efficacement le virus en culture. Malgré les nombreux systèmes d’expression mis au point pour pallier ce problème, il n’existe toujours pas de système cellulaire permettant la réplication de virus complets, nécessaire à l’étude de la structure et de la formation des particules virales. Quelques rares études ont réussi à visualiser en microscopie électronique des particules du HCV dans du plasma issu de donneurs infectés, dans les hépatocytes de chimpanzés infectés expérimentalement ou dans le cytoplasme de cellules en culture [1]. Elles présentent une structure sphérique de 50 à 65 nm de diamètre, contenant un core interne de 30 nm de diamètre environ et, contrairement aux flavivirus, des projections épineuses seraient présentes à leur surface. Cependant, cette dernière observation reste à confirmer. La composition de ces virions n’a pas pu être déterminée mais, à l’image des autres Flaviviridae, ils doivent contenir la protéine de capside (C) et les deux glycoprotéines d’enveloppe, E1 et E2 codées par le génome du HCV. En effet, ces deux glycoprotéines semblent impliquées dans l’entrée du virus dans la cellule puisque des chimpanzés immunisés avec ces protéines peuvent être protégés contre l’infection [1]. La protéine E2, exprimée sous une forme recombinante soluble, est capable de se fixer sur différents types de cellules et à différentes molécules de surface, suggérant son rôle dans l’interaction du virus avec son récepteur cellulaire, bien que celui-ci n’ait pas encore été clairement identifié. La protéine E1 serait plutôt impliquée dans la fusion des membranes virale et cellulaire lors de l’entrée du virus dans la cellule par endocytose [1].
Le HCV a en commun avec les pestivirus un petit peptide d’environ 7 kDa (p7) dont le clivage avec E2 est incomplet. L’efficacité du clivage E2/p7 dépend de la souche virale et les deux formes E2 et E2-p7 peuvent coexister dans la cellule. Le peptide p7, entièrement transmembranaire, pourrait jouer un rôle de canal ionique dans le bourgeonnement et/ou l’entrée virale des virions matures [31, 32]. Des travaux récents utilisant des pseudo-particules virales (PPV) du HCV produites en cellules d’insectes suggèrent que p7 pourrait être impliqué dans les processus d’internalisation de ces PPV [33]. Ce résultat suggère indirectement que p7 est associé aux particules virales. Cependant, la présence ou l’absence de ce polypeptide dans les particules virales natives du HCV reste à confirmer. La mise au point récente d’une stratégie originale de production de pseudo-particules HCV grâce à des vecteurs rétroviraux ou lentiviraux pourrait permettre également d’aller plus loin dans l’analyse du rôle de p7 dans l’entrée du virus [34, 35].
En raison des difficultés rencontrées pour propager le virus en culture cellulaire, l’étude de certains événements de la morphogenèse virale a été rendue possible grâce à l’expression transitoire des protéines du HCV dans des lignées cellulaires, à l’aide de vecteurs viraux ou non viraux. L’essentiel des connaissances acquises concerne la formation et l’assemblage des protéines d’enveloppe dans le RE et repose sur l’expression de ces deux seules protéines par un système hétérologue. Ces connaissances sont exposées en détails dans plusieurs revues récentes [13, 36, 37]. Il a ainsi été montré que les protéines E1 et E2 étaient dirigées, au cours de leur synthèse, vers le RE. En effet, l’extrémité C-terminale hydrophobe de la capside sert de séquence signal au précurseur E1-E2-p7-NS2 et déclenche sa translocation dans le RE. Ce précurseur est libéré de son peptide signal et la capside de son extrémité C-terminale ancrée dans la membrane du RE [38], par des signal peptidases du RE. De plus, les protéines E1 et E2, comme prM et E chez les flavivirus et E1 et E2 chez les pestivirus, portent à leur extrémité C-terminale deux segments hydrophobes séparés par quelques résidus chargés, le premier permettant l’arrêt du transfert dans le RE de la protéine en amont et le second servant de peptide signal à la protéine en aval. Après clivage par une signal peptidase du RE, il a été montré que le second segment hydrophobe se réoriente de telle sorte que les domaines TM passent d’une structure en épingle à cheveux à deux passages transmembranaires à une structure à un seul segment transmembranaire. Cette disposition particulière des domaines TM de E1 et E2 du HCV est nécessaire à leur multifonctionnalité. En effet, outre leur rôle de séquence signal et d’ancrage à la membrane du RE, ils servent de signaux de rétention des protéines E1 et E2 dans le RE. De plus, une fois clivées, les protéines E1 et E2 s’assemblent en hétérodimères et leurs domaines TM jouent un rôle important dans cette interaction. Les acides aminés chargés conservés situés entre les segments hydrophobes sont essentiels aux fonctions de ces deux domaines TM. Il est important de noter que ce type de réorientation des domaines transmembranaires n’a pas été observé chez les flavivirus [25, 39]. Cette différence de topologie entre les domaines transmembranaires des flavivirus et des hépacivirus n’a pour le moment aucune explication biologique. Dans la lumière du RE, le clivage E1-E2 est co-traductionnel tandis que le clivage E2-p7-NS2 intervient une fois la synthèse achevée. Les protéines E1 et E2 sont modifiées par des N-glycosylations au cours de leur formation dans le RE. Elles possèdent 6 et 11 sites potentiels respectivement. Quatre à 5 des 6 sites potentiels sont utilisés sur la protéine E1 en fonction des génotypes. Cependant, exprimée seule, la protéine E1 n’est pas correctement glycosylée, ce qui suggère la présence d’une séquence peptidique en aval nécessaire à sa glycosylation. L’état de glycosylation effectif de la protéine E2 n’a pas été déterminé, mais 9 des 11 sites potentiels sont très conservés entre souches. De plus, les analyses de déglycosylation de cette protéine montrent que la plupart de ces sites sont certainement utilisés [14]. Comme il a été mentionné plus haut, les protéines E1 et E2 s’associent en complexes, une fois synthétisées et clivées de leur précurseur. L’expression transitoire des protéines E1 et E2 sous forme recombinante dans des systèmes hétérologues aboutit à la formation de deux types de complexes : des hétérodimères liés de manière non covalente (voie de formation dite « productive »), impliquant les domaines TM des deux protéines, et des agrégats de protéines E1 et E2 liées par des ponts disulfures intermoléculaires (voie de formation dite « non productive ») [13, 36, 37]. Les hétérodimères non covalents semblent représenter la forme « prébourgeonnante » du complexe de protéines d’enveloppe car ils sont constitués de protéines correctement repliées et sont résistants aux protéases. Cependant, des expériences de cinétique montrent que ces hétérodimères se forment lentement. En effet, la maturation de E1 avec acquisition d’une conformation stable et compacte via des ponts disulfures intramoléculaires est lente alors que celle de E2 est concomitante avec le clivage E2-NS2. La formation de l’hétérodimère E1-E2 permet à la protéine E2 de jouer un rôle de chaperon nécessaire à la formation correcte de E1. Par ailleurs, les deux protéines sont assistées dans leur repliement en s’associant d’abord individuellement avec la CNX. Puis cette protéine chaperon du RE assisterait l’assemblage des glycoprotéines d’enveloppe et la formation correcte des hétérodimères non covalents. Les agrégats se forment plus rapidement que les complexes E1-E2 non covalents et interagissent avec d’autres chaperons du RE, la calréticuline et la Bip [13, 36, 37]. Il est possible que la formation de ces agrégats soit seulement la conséquence de l’utilisation de systèmes de surexpression de protéines recombinantes. En effet, il n’y a pas d’association des protéines d’enveloppe avec la calréticuline ou la Bip ni de formation d’agrégats lors de la réplication du VDBV en culture cellulaire. Ainsi, lors de l’infection naturelle des pestivirus, il n’y a pas de voie non productive [27].
Les étapes tardives de la morphogenèse des virions HCV restent méconnues. La rétention des protéines d’enveloppe E1 et E2 dans le RE, vérifiée par l’absence de glycanes complexes sur ces protéines et par des analyses en immunofluorescence, suggère un bourgeonnement de la particule virale dans le RE comme pour les autres membres des Flaviviridae.

Inhibition de la morphogenèse et de l’infectiosité des virions

La morphogenèse représente une étape du cycle viral potentiellement intéressante pour le développement d’antiviraux. Des études récentes réalisées sur les virus de l’hépatite B (HBV) et le VDBV, un pestivirus modèle pour l’étude du virus de l’hépatite C (HCV), ainsi que sur certains flavivirus ont démontré in vitro, mais également dans des modèles animaux, la pertinence de cette nouvelle approche antivirale. L’objectif principal de ce chapitre est de décrire une famille chimique d’inhibiteurs de la morphogenèse virale et de montrer l’intérêt potentiel de telles molécules, notamment dans le cadre de la lutte anti-HCV.
Le repliement et l’assemblage de nombreuses glycoprotéines virales nécessitent l’assistance de protéines dites chaperons, résidant dans le réticulum endoplasmique (RE) [12, 40]. Comme indiqué précédemment, la CNX et la calréticuline interagissent non pas avec la partie peptidique mais avec la partie N-glycane des protéines qu’elles doivent assister pour le repliement [5, 41-44]. Pour que cette interaction ait lieu, il faut que la structure initiale du N-glycane, qui est composée de 3 glucoses, 9 mannoses et 2 N-acétylglucosamines (Glc₃Man₉GlcNAc₂), soit modifiée par le clivage de deux résidus glucose. En effet, ces deux protéines chaperons interagissent seulement avec des N-glycanes monoglucosylés (Glc₁Man₉GlcNAc). Les réactions de déglycosylation sont catalysées par deux enzymes du RE, les α-glucosidases I et II [5, 41-44]. L’interaction avec la CNX est cruciale pour le repliement de certaines, mais non de toutes, les glycoprotéines. Certaines protéines se replient très vite et n’ont pas besoin d’être retenues par ces lectines dans le RE. Ainsi, les inhibiteurs des α-glucosidases peuvent être utilisés pour perturber de manière spécifique le repliement des protéines fortement dépendantes de cette interaction. De nombreuses glycoprotéines virales, dont celles du HCV, dépendent de la CNX pour se replier correctement et surtout pour s’assembler les unes avec les autres en oligomères. Cela explique pourquoi les inhibiteurs des α-glucosidases ont souvent des propriétés antivirales [45-50]. Par exemple la casternospermine, un inhibiteur puissant des α-glucosidases, a des propriétés antivirales à l’égard de nombreux virus, dont les hépadnavirus (ex : HBV), les rétrovirus (ex. : VIH), les herpèsvirus, les coronavirus et les alphavirus. Cet effet antiviral est la conséquence soit d’une inhibition de la sécrétion du virus, soit d’une réduction de l’infectiosité des particules virales néoformées.

Sucres iminés à activité antivirale

La recherche d’inhibiteurs des enzymes impliquées dans la modification des N-glycanes, notamment les α-glucosidases, a permis d’identifier de nouvelles molécules appartenant à la famille des sucres iminés (ou iminosucres) [48, 49]. Les sucres iminés sont des analogues de carbonhydrates qui contiennent un azote substituant l’oxygène du cycle (figure 6). Ils peuvent être isolés de certaines plantes et de microorganismes mais aussi obtenus artificiellement par synthèse chimique. Du fait de leurs propriétés biologiques remarquables, les iminosucres représentent la classe d’analogues de carbonhydrates la plus intéressante en termes de développement d’agents thérapeutiques contre des maladies aussi diverses que le diabète, le cancer ou les infections virales [51].
Du fait de leur analogie avec des carbonhydrates, les sucres iminés sont des inhibiteurs in vitro et in vivo de nombreuses glycosidases [49, 51]. Ainsi les sucres iminés dérivés du glucose (ex : déoxynojirimycine ou DNJ) sont des inhibiteurs notamment des α-glucosidases I et II du RE. Comme la casternospermine, le DNJ et ses dérivés N-alkylés (ex. : N-butyl-DNJ [NB-DNJ] ou N-nonyl-DNJ [NN-DNJ]) ont des propriétés antivirales à l’égard de différents virus, incluant le VIH et le HBV [48, 49, 52]. Des études, réalisées par l’équipe de Tim Block, pour déterminer les mécanismes de l’action anti-HBV de NB-DNJ ont montré que l’effet antiviral était la conséquence d’un mauvais repliement de la protéine M qui prévenait la morphogenèse du virus et la sécrétion virale [53-55]. En effet, la protéine M ne pouvait plus interagir avec la CNX à cause de l’accumulation de structures N-glycanes tri-glycosylées. Sachant que la protéine M n’est pas indispensable à la morphogenèse virale, les auteurs ont émis l’hypothèse d’un effet négatif trans dominant pour expliquer l’inhibition de la morphogenèse virale. D’autres études par la même équipe ont démontré que le NN-DNJ, le dérivé du DNJ portant un groupement nonyl branché sur l’azote du cycle, était 100 à 200 fois plus efficace que NB-DNJ quant à son effet inhibiteur de la sécrétion virale. Ces études, réalisées in vivo dans le modèle de la marmotte américaine infectée par le WHV (équivalent du HBV dans ce modèle) [56], ont démontré l’efficacité antivirale et l’absence de toxicité de ce type d’inhibiteurs des α-glucosidases et ont donc apporté pour la première fois la preuve de concept que ce type d’inhibiteur ciblant une fonction cellulaire pouvait être utilisé in vivo.

Des travaux par Courageot et al. [47] et Lorenz et al. [23] plus récemment ont également montré que les inhibiteurs des α-glucosidases, DNJ et NB-DNJ respectivement, avaient un effet sur le repliement et l’assemblage des protéines prM et E des flavivirus, ainsi que sur la sécrétion virale. Ces résultats montrent que les inhibiteurs des α-glucosidases sont potentiellement intéressants pour lutter contre les infections à flavivirus pour lesquelles, rappelons-le, il n’existe pas de traitement efficace.

Inhibiteurs des alpha-glucosidases comme agents anti-VIH : historique d’un échec

La démonstration de l’activité in vivo des nouveaux inhibiteurs des α-glucosidases à l’égard de la réplication du WHV est d’autant plus importante que la communauté scientifique garde à l’esprit l’échec du NB-DNJ dans la lutte in vivo contre le VIH. En effet, au milieu des années 1990, plusieurs travaux ont décrit l’effet antiviral de cette molécule à l’égard de la réplication du VIH in vitro et ont étudié son mécanisme d’action. La protéine gp160, qui est le précurseur des protéines gp120 et gp41, est hyper-N-glycosylée et dépend fortement de l’interaction avec la CNX pour son repliement et sa maturation [12]. En effet, il a été montré que le NB-DNJ, en inhibant la maturation des N-glycanes triglycosylés et par conséquent l’interaction avec la CNX, avait un effet dramatique sur le repliement de cette protéine se traduisant par des changements conformationnels dans les régions V1/V2 de gp120 [52, 57]. La conséquence de cette inhibition et de la perturbation du repliement et de la maturation de gp160 était une diminution de l’infectiosité des virions libres et donc un effet antiviral par défaut d’entrée. Des travaux plus poussés ont permis de montrer que le blocage de l’entrée virale était dû à une perturbation du changement conformationnel induite par l’interaction avec CD4 [58], ce changement de conformation étant crucial pour la fusion du virion avec la membrane cellulaire. La dose de NB-DNJ nécessaire pour obtenir une inhibition proche de 100 % était supérieure à 1 mM.
Sur la base de ces travaux, le NB-DNJ (SC-48334) a été évalué dans des essais cliniques de phase II. Malheureusement, aux doses testées et avec les protocoles utilisés, aucun impact majeur sur la charge virale n’a été observé [59]. En fait, la dose sérique de drogue n’était pas suffisante pour qu’un effet puisse être observé. Clairement, cette molécule n’était pas intéressante comme agent antiviral et son développement a été stoppé.

Sucres iminés de deuxième génération comme antiviraux contre les Flaviviridae

À la suite de l’échec sur le VIH, une phase de recherche et développement a permis d’identifier des sucres iminés de deuxième génération beaucoup plus intéressants en termes d’activité antivirale et de toxicité. Deux voies de recherche ont été considérées. La première consistait à améliorer les inhibiteurs des α-glucosidases du type NB-DNJ afin de les rendre plus puissants et moins toxiques. Cela a été obtenu essentiellement en allongeant la chaîne carbonée branchée sur l’azote du cycle, une chaîne en 9 carbone étant optimale (ex. : NN-DNJ), et en ajoutant un oxygène dans la chaîne carbonée dans la partie distale de la chaîne alkyl (figure 6) [60].

La deuxième voie de recherche consistait à identifier de nouveaux sucres iminés qui ne soient pas des inhibiteurs des α-glucosidases du RE, mais qui gardent une activité antivirale. Cet objectif a été atteint avec la découverte de dérivés alkylés du déoxygalactonojirimycine (DGJ), un analogue du galactose, qui avaient une activité antivirale dans le modèle du virus de la diarrhée bovine virale (VDBV) [60]. Une chaîne alkyl d’au moins 8 carbones branchée sur l’azote du cycle était nécessaire pour avoir une activité antivirale. De la même manière que pour les dérivés de DNJ, l’activité antivirale maximale a été obtenue avec un composé contenant une chaîne alkyl longue de 9 carbones (NN-DGJ, figure 6). Par ailleurs, l’ajout d’un oxygène dans la partie distale de la chaîne alkyl a permis une réduction très significative de la toxicité [60]. Ces nouveaux sucres iminés ont été étudiés en détail avec le VDBV. Ce virus a été utilisé comme un modèle viral et cellulaire d’étude du HCV en l’absence d’un système cellulaire permettant la réplication de ce dernier [27, 45, 60]. En effet, pour étudier ces inhibiteurs, il est indispensable de pouvoir répliquer de manière efficace et complète le virus, c’est-à-dire de l’étape d’entrée virale à l’étape de relarguage des particules virales néoformées. Le VDBV, contrairement au HCV, peut être propagé de manière efficace sur cellule MDBK. Il était ainsi possible d’utiliser ce modèle pour cribler l’activité antivirale de nouveaux iminosucres et d’étudier les mécanismes d’action à un niveau moléculaire. Au niveau des mécanismes d’action, seulement quelques iminosucres dits de référence ont été utilisés. Certains travaux ont montré que la déoxyjirimycine (DNJ) ainsi que ses dérivés, du fait de leur activité inhibitrice des α-glucosidases, avaient des propriétés antivirales à l’égard du VDBV [27, 45, 60]. Dans ce modèle, les dérivés contenant une chaîne alkyl de 9 carbones branchée sur l’azote du cycle (NN-DNJ) étaient beaucoup plus efficaces que les dérivés contenant une chaîne plus courte (NB-DNJ), suggérant le rôle important de la chaîne alkyl branchée sur l’azote du cycle. L’hypothèse initiale était que la chaîne en 9 carbones permettait une meilleure entrée et donc une meilleure inhibition des α-glucosidases. De manière surprenante, il a été démontré que NN-DGJ, une molécule dérivée non pas du glucose mais du galactose et ne présentant pas d’activité inhibitrice des α-glucosidases in vitro, était toutefois antivirale contre VDBV [60]. Ces résultats indiquaient que la taille de la chaîne alkyl branchée sur l’azote du cycle était importante pour l’efficacité et suggéraient un second mécanisme d’action, indépendant de l’inhibition des α-glucosidases pour les sucres- iminés à longue chaîne carbonée. Des travaux afin de mieux comprendre les deux types de mécanisme d’action au niveau moléculaire ont été entrepris. Ils ont permis de montrer que les inhibiteurs des α-glucosidases, tels que NB-DNJ, induisaient :

– un mauvais repliement des glycoprotéines d’enveloppes E1 et E2, une conséquence directe de l’inhibition des α-glucosidases ;
– une inhibition de l’assemblage de E1 et E2 en hétérodimère ;
– la dégradation de ces protéines par le protéasome.
Cette inhibition avait pour conséquences mesurables une diminution de la sécrétion virale mais également une diminution du pouvoir infectieux des particules virales relarguées malgré l’inhibition de la sécrétion [27, 60]. L’effet antiviral s’expliquait donc par deux phénomènes : d’une part, une inhibition de la quantité de virus relarguée, due à l’inhibition de la morphogenèse et, d’autre part, un défaut d’infectiosité dû à l’incorporation de protéines mal repliées et mal glycosylées dans les virions (figure 7) [60]. En ce qui concerne le mécanisme d’action de NN-DNJ, il a été montré que l’activité antivirale accrue de cette molécule n’était pas due à une meilleure pénétration dans la cellule et donc à une meilleure inhibition des α-glucosidases in cellulo, comme suggéré initialement [60]. À concentrations inhibitrices équivalentes, l’inhibition des α-glucosidases était plus importante avec NB-DNJ qu’avec NN-DNJ, suggérant une absence de corrélation entre la capacité de ce dernier à inhiber les α-glucosidases et son effet antiviral contre VDBV. Clairement au moins, un autre mécanisme d’action était responsable de l’activité accrue de NN-DNJ. Ce second mécanisme d’action expliquerait également l’activité antivirale de NN-DGJ, une molécule qui n’inhibe pas les α-glucosidases. Le mécanisme précis expliquant l’activité antivirale des iminosucres à longue chaîne (NN-DNJ et NN-DGJ) n’est pas complètement compris. Cependant, il a été montré que ces composés induisaient une accumulation anormale de complexes E2-E2 (ces complexes sont normalement présents en faible quantité dans les cellules infectées par VDBV et dans les virons) à la fois dans le RE des cellules infectées et dans les particules virales relarguées de ces cellules [60]. Ce phénomène n’a pas été observé avec les sucres iminés à courte chaîne. La modification de la composition des virions est un marqueur en corrélation avec la réduction de leur infectiosité. En résumé, des sucres iminés qui ne sont pas des inhibiteurs des α-glucosidases ont une activité antivirale dans le modèle du VDBV et cette activité antivirale s’explique par un défaut d’infectiosité des particules virales (figure 7).
Des travaux récents ont montré que les dérivés de DGJ à longue chaîne carbonée (NN-DGJ et autres) étaient des inhibiteurs de l’activité de canal ionique de la protéine p7 dans des systèmes membranaires artificiels [32]. Cette activité inhibitrice pourrait expliquer en partie l’activité antivirale de ces molécules. La fonction biologique de la protéine p7 n’est toujours pas connue. Cette protéine pourrait être impliquée dans l’entrée virale, tout comme la protéine M2 du virus influenza en permettant l’acidification des endosomes par transport de protons après l’endocytose des virions.
Cependant, elle n’a pas encore été observée dans les virions du VDBV ou du HCV car il n’existe pas d’anticorps dirigé contre p7.

Autres inhibiteurs de la morphogenèse

Des travaux récents ont démontré que certaines molécules (ex. : l’époxomycine) capables d’inhiber le protéasome avaient un effet inhibiteur sur la morphogenèse du VIH [61]. L’analyse des mécanismes d’action a permis de montrer que ces molécules interféraient avec le clivage de la protéine gp160, la maturation et le relarguage des virons. Cependant, cette interférence est indirecte. En effet, les auteurs de ces travaux ont montré que la protéine gp160 était mono-ubiquitiné et que la présence de cette ubiquitine était importante pour son clivage et sa maturation. Le traitement avec un inhibiteur du protéasome a pour conséquence une diminution du pool d’ubiquitine libre, ce qui interfère avec l’ubiquitination de gp160 et explique in fine l’effet sur la morphogenèse du virus. D’autres travaux ont montré que les inhibiteurs de protéasome avaient un effet inhibiteur sur le HBV [Hans Will, données non publiées]. Ces travaux ont permis d’ouvrir un champ d’investigation intéressant qui pourrait aboutir au développement de nouvelles classes d’antiviraux.

Perspectives d’utilisation clinique des inhibiteurs de la morphogenèse dans le cadre des nouvelles approches thérapeutiques contre les flavivirus et le HCV

L’inhibition d’une fonction cellulaire dans le cadre d’une stratégie antivirale peut paraître risquée, voire absurde de prime abord. C’est pourquoi la plupart des molécules antivirales étudiées et développées à ce jour ciblaient essentiellement des fonctions virales (ex. : enzymes virales). Cependant, de nouvelles perspectives se sont ouvertes avec la démonstration in vitro qu’il était possible de cibler des fonctions cellulaires qui sont plus importantes pour la survie du virus que pour celle de la cellule hôte. L’idée globale étant de bloquer une fonction cellulaire jusqu’à un certain niveau (réduction de 10-20 % de l’activité), afin qu’il n’y ait pas d’effet délétère pour la cellule mais seulement pour le virus. Nous avons donné dans cette revue l’exemple des inhibiteurs des α-glucosidases et du protéasome, mais d’autres molécules inhibant des fonctions cellulaires ont été étudiées pour leur effet antiviral. C’est le cas notamment des inhibiteurs de l’inosine 5’-monophosphate déhydrogénase (IMPDH), une enzyme cellulaire impliquée dans la biosynthèse des nucléotides de la guanosine. L’un d’entre eux, le composé VX-497 de Vertex Pharmaceuticals, est actuellement en essai clinique contre le HCV. Finalement, notons que le ritonavir, une molécule d’ores et déjà utilisée en clinique contre le VIH, est un inhibiteur de protéase qui a un effet croisé sur le protéasome. Ce dernier exemple nous montre que le concept d’inhibition d’une fonction cellulaire en lutte antivirale est applicable.
Dans ce contexte, quelles sont les perspectives d’utilisation clinique pour les iminosucres ? En ce qui concerne les sucres iminés, la prudence a guidé le choix de la molécule pour une évaluation clinique. Ainsi c’est le N-7oxanonyl-6déoxy-DGJ (SP231), un dérivé alkylé du DGJ contenant un oxygène dans la chaîne carbonée, qui a été choisi pour les essais cliniques (actuellement en phase II). En effet, cette molécule, qui n’est pas un inhibiteur des α-glucosidases, inhibe in vitro et à dose micromolaire la réplication du VDBV en diminuant l’infectiosité des virions [60]. De plus, elle inhibe in vitro l’activité de canal ionique de p7 [32]. Cette molécule a un très bon profil toxicologique (dose de 1 mg/kg/j sans effet toxique chez le chien) et une bonne biodisponibilité, avec une accumulation préférentielle dans le foie. Par ailleurs, elle n’est pas métabolisable, donc pas dégradée dans le foie ; elle est directement éliminée dans les urines. C’est sur ces bases expérimentales que le choix s’est fait. Les résultats de ces essais cliniques devraient être rendus publics en 2004.
Est-il envisageable d’utiliser un inhibiteur des α-glucosidases en clinique ? Comme nous l’avons déjà évoqué, des travaux récents ont permis de montrer qu’il était possible d’inhiber une fonction cellulaire à un certain niveau (ex. : 10 à 20 % d’inhibition) sans qu’il y ait de conséquence sur la survie de la cellule. C’est dans ce contexte que s’articule la réflexion ; une inhibition trop efficace d’une enzyme cellulaire n’est pas envisageable. En accord avec cet argument, les spécialistes des maladies congénitales liées à un déficit d’enzymes impliqués dans la N-glycosylation s’accordent à penser que cette voie métabolique est suffisamment flexible pour supporter une inhibition partielle [62]. Donc, dans une situation extrême telle qu’une infection sévère à évolution rapide par un flavivirus, la balance risque/bénéfice ne penche-t-elle pas vers l’utilisation de telles molécules inhibitrices dans un traitement de courte durée ? Avant d’évaluer en clinique des inhibiteurs des α-glucosidases comme antiviraux, des compléments d’étude en particulier toxicologiques sont indispensables. Cependant, le fait que l’un de ces inhibiteurs, le miglitol, soit déjà utilisé pour lutter contre le diabète permet de penser que les inhibiteurs des α-glucosidases pourraient avoir un avenir intéressant dans le cadre des nouvelles stratégies antivirales en combinaison avec des molécules ciblant les enzymes virales pour retarder ou prévenir les résistances virales.

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