Mécanismes d'action antivirale de l'interféron

L'infection de cellules par certains virus les rend réfractaires à une réinfection immédiate par ces virus. Jusque vers les années 1950, on expliquait ce phénomène, connu sous le nom d'interférence virale, par le fait que le virus infectant bloquait les récepteurs cellulaires nécessaires à l'infection, les empêchant ainsi d'accueillir les nouveaux virus. Des études sur l'interférence virale, conduites par Isaacs et Lindenmann à Londres et réalisées avec le virus influenza, ont montré que celle-ci survenait lorsque les cellules (membranes chorio-allantoïques de poulet dans cette expérience) étaient incubées avec un virus préalablement inactivé par la chaleur et donc non infectieux. Le surnageant des cellules ainsi traitées appliqué à des cellules fraiches était capable d'inhiber l'infection de ces dernières par un virus influenza infectieux. Ce résultat montrait pour la première fois que c'est la cellule elle-même qui, au contact d'un virus, produit une substance capable de provoquer l'interférence virale. Cette substance, rapidement identifiée comme de nature protéique, fut appellée « interféron » [1]. Ce nom est toujours utilisé et les connaissances sur les interférons ont nettement progressé, surtout à partir des années 1980 où le clonage du premier interféron a pu être réalisé par le groupe de Weissman, à Zurich.

Les interférons : de la synthèse à l'expression des gènes cibles

La transcription des gènes des interférons est régulée par l'interaction spécifique de facteurs cellulaires avec des séquences cibles localisées dans leurs régions promotrices. L'interferon gene regulatory element (IRE) est une région de 110 nucléotides, située en amont du site d'initiation du gène de l'interféron b, qui se compose de deux domaines chevauchants appelés positive regulatory domains (PRD), PRDI et PRDII, permettant son induction en réponse aux virus et à l'ARN bicaténaire, et d'un domaine régulateur négatif (negative regulatory domain ou NRD). PRDI et PRDII lient deux facteurs régulateurs (interferon regulatory factor ou IRF), IRF1 et IRF2 qui, bien que structurellement proches (plus de 60 % d'identité), ont des fonctions distinctes : IRF1 est le facteur positif déclenchant l'induction de l'interféron b, alors qu'IRF2 réprime l'action d'IRF1 par compétition au niveau du site de reconnaissance [4]. Le domaine PRDII lie en outre le facteur NF-kB. Le facteur IRF1 joue un rôle pivot, non seulement dans la transcription de l'interféron b, mais aussi dans la transcription des gènes cibles car il se lie également à la séquence baptisée IFNa-stimulated response element (ISRE) dont le rôle sera développé plus loin (figure 1). La transcription d'IRF1 est inductible par les virus, l'ARN bicaténaire et l'interféron lui-même [5]. Cependant l'IFNb peut être induit dans des souris knock-out pour le gène IRF1 en réponse aux virus ou à l'ARN bicaténaire synthétique poly(I)-poly(C) [6]. Il existerait donc deux voies conduisant à l'induction des interférons de type I, l'une dépendante d'IRF1, l'autre indépendante. On a récemment établi que la protéine-kinase dépendante des ARN bicaténaires (PKR), qui est une des enzymes induites par l'interféron, participe à l'induction de l'interféron par la voie dépendante d'IRF1 (figure 2). L'IRF1 pourrait également avoir une fonction suppresseur de tumeur [7]. Son inactivation conduirait au développement de certaines tumeurs du système hématopoïétique chez l'homme et il provoquerait une apoptose des lymphocytes T activés par transactivation des gènes des protéases Ice, dont la nouvelle dénomination est Caspase-1 [8].

Expression des gènes cibles

Une unité d'interféron est définie comme la dose nécessaire pour inhiber une croissance virale de 50 %. Les interférons ont une activité spécifique élevée (10⁷ à 10⁹ U/mg de protéine) et sont actifs à très faible concentration. Leur action s'exerce à partir du milieu extracellulaire, après fixation à haute affinité à des récepteurs spécifiques (constante d'affinité : Kd = 10^{­ 9}-10^{­ 11} M). Le nombre de récepteurs varie de quelques centaines à quelques milliers d'une cellule à l'autre. Il existe un récepteur commun aux interférons a et b (type I), distinct du récepteur de l'interféron g (type II). Pour être fonctionnels, ces récepteurs nécessitent la coexpression de deux chaînes, respectivement IFNa-R1 et IFNa-R2 pour le récepteur de type I [9, 10] et a et b pour le récepteur de type II [11]. L'activation des récepteurs par le ligand nécessite l'oligomérisation des composés. Les interférons a et b entraînent l'oligomérisation des chaînes IFNa-R1 et IFNa-R2. L'interféron g entraîne, de la même façon, la dimérisation de deux monomères de chaîne a qui démasque un site de liaison pour la chaîne b. Le récepteur de l'interféron g serait donc un trimère ou un tétramère, composé d'un dimère de chaînes a flanqué de une ou deux chaînes b [12]. Les récepteurs ainsi activés déclenchent des événements de signalisation utilisant des protéines kinases qui appartiennent à une famille de tyrosine kinases cytoplasmiques et sont appelées Jaks pour « Janus kinases » car, tel Janus, dieu gardien des portes chez les Romains, elles commandent l'ouverture de la porte cellulaire à l'interféron. L'interaction IFN-récepteur déclenche l'association deux à deux de trois de ces Jaks kinases (Tyk2, Jak1 et Jak2) [pour revue, voir 13] à la partie cytoplasmique des récepteurs. Pour le récepteur de type I (IFNa et b), Jak1 interagit avec la chaîne IFNa-R2 et s'associe avec Tyk2, qui a plus d'affinité pour la chaîne IFNa-R1. Pour le récepteur de type II (IFNg), Jak1 interagit avec Jak2, Jak1 étant associé à la chaîne a et Jak2 à la chaîne b [12] (figure 1).

La kinase Jak1 est ainsi commune aux voies de signalisation par les deux types d'interférons, alors que Tyk2 et Jak2 sont respectivement spécifiques de la signalisation par les interférons de type I et de type II. Les Jaks kinases réunies par le récepteur s'activent mutuellement par phosphorylation en tyrosine. Elles phosphorylent ensuite leurs récepteurs, ainsi que des protéines cytoplasmiques de la famille des signal transducers and activators of transcription (Stat). Après phosphorylation, les protéines Stat se dimérisent ou se multimérisent grâce à la présence de domaines SH₂ d'interaction avec le peptide portant la tyrosine phosphorylée [13]. Les protéines Stat migrent ensuite dans le noyau cellulaire pour y stimuler l'expression de gènes contenant, au niveau de leurs promoteurs, deux types d'éléments qu'elles peuvent reconnaître : a) pour les gènes cibles de l'interféron de type I, un complexe formé de protéines Stat se positionne sur l'IFNa-stimulated response element (motif ISRE), dont la séquence consensus est AGTTTCNNTTTCNC/T ; b) pour les gènes stimulés par l'interféron g, un complexe différent de protéines Stat se positionne sur l'IFNg activation site (motif GAS), dont la séquence consensus est TTNCNNNAA.

La partie centrale (ou core) du motif ISRE est homologue du motif PRDI présent dans les promoteurs des gènes des interférons de type I. Le motif ISRE peut donc également lier le facteur IRF1. Ainsi, le facteur IRF1 qui déclenche l'induction du gène de l'interféron b est capable de stimuler également des gènes répondant à l'interféron b, ce qui renforce l'action de celui-ci. Sur le site ISRE se fixe un complexe multiprotéique, initialement appelé interferon stimulatory gamma factor 3 (ISGF3), composé des protéines Stat1a (91 kDa), Stat1b (84 kDa) et Stat2 (113 kDa) qui s'associent à la protéine p48 ou ISGF3g. Cette dernière appartient, avec IRF1 et IRF2, à la famille des IRF. Elle n'est pas phosphorylée et c'est elle qui se lie effectivement à l'ADN, mais avec une faible affinité. Cette affinité est considérablement augmentée par l'association d'ISGF3g aux protéines Stats. Sur le site GAS se fixe un dimère de Stat1, initialement appelé IFNg activation factor (GAF). Stat1a et Stat1b proviennent du même gène par épissage alternatif et ne diffèrent que par une séquence de 38 acides aminés à la partie COOH-terminale, correspondant à un domaine de transactivation au niveau de Stat1a. En conséquence, GAF n'est actif que sous les formes Stat1a/Stat1a ou Stat1a/Stat1b [13].

Mécanisme d'action de quelques gènes induits par l'interféron

L'interféron induit la synthèse d'au moins trente gènes. Certains sont induits uniquement par l'interféron de type I ou par l'interféron de type II, tandis que d'autres sont induits par les deux types d'interférons à la fois. Les fonctions de ces gènes sont loin d'être toutes connues [pour revue, voir 14]. Nous avons choisi de décrire ici quelques gènes dont la fonction est directement impliquée dans le mécanisme d'action antivirale de l'interféron : protéines Mx, 2-5A synthétase, oxyde nitrique synthétase, protéines du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Nous mentionnerons également une famille de protéines associées aux corps nucléaires qui pourraient avoir un rôle antiviral et l'ubiquitine cross-reactive protein (UCRP) qui pourrait servir de relais dans les inductions d'interféron. Nous insisterons enfin sur la protéine kinase dépendante d'ARN bicaténaire (PKR) dont l'étude a pris un essor considérable ces dernières années en raison de son implication à la fois dans les mécanismes d'action antivirale et antitumorale de l'interféron, dans les mécanismes d'apoptose et dans les mécanismes de signalisation conduisant à la synthèse de différents gènes, dont celui de l'interféron b.

Les protéines Mx

La famille des gènes Mx a été découverte par une étude génétique. Il a en effet été observé que des cellules de souris portant l'allèle dominant Mx résistaient à l'infection par le myxovirus influenza (d'où le nom Mx), alors que les cellules de génotype Mx^­ étaient sensibles au virus. Les cellules Mx⁺ étaient capables de synthétiser, en réponse à l'interféron de type I, une grande quantité d'une protéine de poids moléculaire 75 kDa appelée protéine Mx1. Les protéines Mx font partie d'une nouvelle famille de GTPases comprenant la dynamine du rat, associée aux microtubules, et la protéine Vps1/Spo15, impliquée dans la séparation des kinétochores [15]. Elles ont en commun une région NH₂ terminale très conservée contenant un domaine de liaison au GTP. Les protéines Mx les mieux caractérisées sont les protéines Mx1 et Mx2 murines et de rat et les protéines MxA et MxB humaines. Le gène des protéines Mx humaines est situé sur le chromosome 21. Ces protéines sont induites par les interférons de type I, mais aussi directement au cours de certaines infections virales. En particulier, l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH1) induit la synthèse de la protéine MxA. Il a été observé que les protéines Mx confèrent aux cellules une résistance contre le virus influenza, le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) et le virus de la rougeole. La protéine Mx1 de souris et de rat est nucléaire, alors que les autres protéines Mx (Mx2, MxA, MxB) sont cytoplasmiques. L'action des protéines Mx est absolument dépendante de leur activité GTPase et s'exercerait sur les polymérases virales. Lorsque les protéines Mx sont nucléaires (Mx1), leur inhibition s'exercerait au niveau de la sous-unité PB2 de la polymérase, bloquant ainsi la synthèse des ARN messagers du virus influenza dans le noyau des cellules infectées. Lorsque les protéines Mx sont cytoplasmiques, elles bloqueraient le transport des polymérases virales vers le noyau [15, 16].

La 2'-5' oligo-adénylate synthétase (2-5A synthétase) et le système 2'-5' oligo-adénylate
(2-5A)

En 1974, le groupe de Ian Kerr à Londres a observé que le traitement préalable de cellules par l'interféron les rendait plus sensibles à l'inhibition de leurs synthèses protéiques par les ARN bicaténaires. L'addition d'ARN bicaténaire aux extraits de cellules prétraitées par l'interféron déclenchait la synthèse d'un inhibiteur, le 2-5A. Le 2-5A est formé d'une série d'oligo-adénylates di- ou triphosphates synthétisés à partir de l'ATP, dont la particularité est d'avoir ses riboses liés en 2'-5' au lieu de la liaison classique 3'-5'. On l'exprime par la formule pppA (2'p5'A)_n où n est égal ou supérieur à 1. La série des 2-5A est synthétisée par une enzyme cellulaire, la 2'-5' oligo-adénylate synthétase (2-5A synthétase) qui est induite dans les cellules par l'interféron et ne s'active pour synthétiser les 2-5A qu'en présence d'ARN bicaténaire. À concentrations subnanomolaires, le 2-5A active une endoribonucléase cellulaire associée aux polysomes, la RNAse L, de poids moléculaire 80 kDa [17], qui dégrade les ARN simple-brin cellulaires et viraux par clivage en 3' des séquences UU et UA. La capacité de la RNAse L à dégrader de façon quasi non spécifique de nombreux ARN lui confère un rôle important dans le métabolisme de l'ARN : elle est donc hautement contrôlée. Ce contrôle peut s'exercer par la dégradation de son activateur, le 2-5A, sous l'action d'une 2'-phospho-diestérase et d'une 5'-phosphatase. Il s'exerce également par l'interaction de la RNAse L avec la protéine RLI, de poids moléculaire 68 kDa, qui l'inhibe [18]. L'inhibiteur RLI est induit au cours de l'infection de certains virus, comme le virus de l'encéphalo-myocardite murine (EMCV), les protégeant contre l'action de la RNAse L et ce, jusqu'à ce que l'induction de la 2-5A synthétase par l'interféron renforce l'action de la RNAse L (C. Bisbal, communication personnelle). Outre sa capacité à activer la RNAse L, le 2-5A est également capable d'inhiber les activités des enzymes transcriptase inverse et ADN topo-isomérase [19, 20].

La 2-5A synthétase correspond en fait à une famille d'enzymes de poids moléculaires différents (40, 46, 69 et 100 kDa) induites par les deux types d'interférons. Les formes 40 kDa et 46 kDa sont codées par le même gène et diffèrent par épissage alternatif [21]. Elles se complexent sous forme de tétramères, alors que la forme 69 kDa forme un dimère et la forme 100 kDa se présente comme un monomère [22]. Les 2-5A synthétases sont présentes dans la plupart des cellules et des tissus de mammifères et leurs niveaux peuvent varier en fonction de l'état de croissance ou de différenciation des cellules, ainsi qu'au cours d'une infection [23]. La surexpression des formes 40 kDa humaine ou murine après transfection de leurs ADNc et établissement de lignées cellulaires protège les cellules contre certains virus tels que les picornavirus ou le VIH1, mais non contre d'autres comme, par exemple, le VSV [21-25].

L'oxyde nitrique synthétase

L'oxyde nitrique synthétase (NOS) catalyse la transformation de la L-arginine en citrulline en libérant l'oxyde nitrique (NO), gaz à radical libre qui joue un rôle important comme médiateur de multiples fonctions biologiques, en particulier dans la cytotoxicité des macrophages. L'enzyme NOS est présente sous trois isoformes : deux des isoformes sont constitutives dans les cellules endothéliales et dans le cerveau ; la troisième (i-NOS) est inductible dans les macrophages par le TNFa et le lipopolysaccharide (LPS) et cette induction est considérablement augmentée par l'interféron g. Le mécanisme exact de la régulation de l'expression d'i-NOS n'est pas encore complètement élucidé du fait de la diversité des effets bénéfiques et néfastes de l'oxyde nitrique que l'organisme doit contrôler. La production d'oxyde nitrique permet aux macrophages d'inhiber la croissance de cellules tumorales, de bactéries, de champignons ou de virus, tels que le virus herpès simplex 1 (HSV1) et le virus de la vaccine [26, 27]. Cependant, une production excessive d'oxyde nitrique peut conduire à une destruction cellulaire massive, y compris de cellules saines.

Des études réalisées sur le promoteur du gène i-NOS murin ont montré qu'il contenait au moins six éléments de régulation : deux motifs ISRE, deux motifs NF-kB, un élément octamère et un motif GAS. Sur ces motifs peuvent donc venir se positionner les facteurs de transcription IRF1 (motifs ISRE), NF-kB et Stat1 (motif GAS). Il semble cependant que l'induction optimale du gène dépende de la formation d'un complexe regroupant tous ces facteurs qui, par eux-mêmes, sont peu opérationnels [28].

Les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité

Le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I permet la présentation de différents antigènes à la surface cellulaire après leur dégradation en peptides dans le cytoplasme par la voie protéasome/ubiquitine. L'antigène du CMH de classe I est induit par les interférons a, b et g, par l'intermédiaire des facteurs de transcription IRF1 et NF-kB. L'interféron g induit pour sa part le CMH de classe II par l'intermédiaire de la synthèse de deux de ses sous-unités (LMP2 et LMP7) qui stimulent l'activité catalytique du protéasome en s'échangeant avec deux de ses sous-unités qui leur sont fortement homologues. Ce type d'échange favoriserait l'activité du protéasome sans changer sa structure [29].

Les protéines associées aux corps nucléaires

La présence de domaines discrets ou corps nucléaires dans les noyaux de nombreuses cellules a été révélée par des techniques de microscopie électronique et par immunomarquage avec le sérum de patients atteints de maladies auto-immunes. Il existe au moins trois protéines qui se localisent dans ces corps nucléaires : Sp100, PML et NDP52. Sp100 a été découverte dans le sérum de patients atteints de cirrhose biliaire primitive. Le gène codant pour PML a été identifié par sa fusion avec le récepteur de l'acide rétinoïque dans les translocations t(15:17) des leucémies aiguës promyélocytaires [30]. NDP52 a été découvert plus récemment. L'expression de ces trois gènes est induite par l'interféron, ce qui est confirmé par le fait que le promoteur de Sp100 contient une région ISRE et celui de PML une région ISRE et une région GAS [31]. L'expression de Sp100 est également augmentée en cas d'infection virale et de transformation cellulaire. La protéine PML a une fonction suppresseur de tumeur impliquée dans le développement de la leucémie aiguë promyélocytaire [32]. Elle est présente dans les corps nucléaires sous sa forme naturelle mais se trouve distribuée de façon microponctuelle après sa fusion au cours de la leucémie.

Les corps nucléaires seraient choisis par certains virus à ADN pour commencer leur réplication dans le noyau des cellules infectées. Il en résulte une modification de la structure des corps nucléaires car certaines protéines virales s'y accumulent et entraînent leur désorganisation (exemples : protéine ICP0 d'HSV1, protéines E1A et E4-ORF3 de l'adénovirus ou protéine EBNA5 du virus d'Epstein-Barr). De nombreuses études sont en cours pour tenter de comprendre la signification biologique de ces localisations virales. Par exemple, un groupe a récemment montré que la protéine virale ICP0 (encore appelée Vmw110), qui est impliquée dans l'initiation du cycle lytique d'HSV1, interagit au niveau des corps nucléaires avec une nouvelle protéase cellulaire de poids moléculaire 135 kDa, l'herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease (HAUSP) qui dégrade spécifiquement l'ubiquitine. Pour l'instant, la signification exacte de l'interaction Vmw110/HAUSP n'est pas claire : il a été proposé que la protéine Vmw110 obligerait HAUSP à « déubiquitiner », donc à stabiliser, les protéines virales qui auraient déjà été reconnues comme étrangères par la cellule et préparées, par ubiquitination, à être dégradées [33].

Les protéines des corps nucléaires sont clairement inductibles par l'interféron mais on ne sait toujours pas dans quelle mesure l'augmentation de la concentration des protéines PML, Sp100 ou NDP52 aux sites de réplication virale procure à la cellule un moyen de défense antivirale. En effet, la résistance à une infection virale en réponse à l'interféron a était identique dans des cellules de fibroblastes embryonnaires dérivées de souris exprimant une forme mutée null ou une forme sauvage de la protéine PML [34]. L'étude de l'action de l'interféron dans d'autres systèmes cellulaires doit cependant être réalisée avant d'éliminer totalement une possible participation des protéines des corps nucléaires à l'action antivirale de l'interféron.

La protéine ISG15 ou UCRP

Les interférons a et b induisent dans les cellules humaines et bovines un gène codant pour une protéine cytoplasmique de 15 kDa, l'interferon-stimulated protein 15 (ISG15), par l'intermédiaire d'une région ISRE présente dans son promoteur. La protéine ISG15 est composée de deux domaines homologues entre eux et à l'ubiquitine (8,5 kDa). ISG15 est en effet reconnue par des anticorps dirigés contre l'ubiquitine [35] et, pour cette raison, s'appelle également ubiquitin cross-reactive protein (UCRP). L'ubiquitine a pour rôle de préparer les protéines cellulaires à être dégradées. Pour cela, elle modifie les protéines au niveau post-traductionnel par un processus appelé conjugaison, au cours duquel une glycine de la région carboxy-terminale de l'ubiquitine se lie de façon covalente, via une liaison isopeptide, aux amines primaires des lysines des protéines cibles. Les complexes ainsi formés sont ensuite dégradés au niveau des protéasomes par un processus dépendant de l'action d'un complexe multienzyme (E1 : ubiquitin-activating enzyme, E2 : ubiquitin carrier proteins, E3 : ubiquitin protein ligase). La séquence carboxy-terminale LRLRGG de l'ubiquitine, essentielle pour la conjugaison à d'autres protéines cellulaires, est conservée dans la région C-terminale de l'UCRP, indiquant que celle-ci pourrait fonctionner de façon similaire à l'ubiquitine. Cependant, l'UCRP diffère de l'ubiquitine à la fois par son peu d'affinité pour l'enzyme E1 et par sa faible concentration intracellulaire : même après induction par l'interféron, celle-ci ne représente en effet que 10 % du pool de l'ubiquitine. Il est donc probable qu'UCRP utilise une enzyme différente de E1 et donc une voie de conjugaison parallèle à celle de l'ubiquitine [36]. L'UCRP aurait également la fonction (non partagée avec l'ubiquitine), d'induire la secrétion d'interféron g. Cette propriété, qui reste à confirmer, suggérerait un rôle de relais de l'UCRP permettant aux interférons de type I de provoquer l'expression d'interféron de type II [37].

La protéine-kinase dépendante d'ARN bicaténaire ou PKR

L'existence d'une protéine-kinase induite par l'interféron et dépendante des ARN bicaténaires a été démontrée en même temps que celle de la 2-5A synthétase dans les années 1975-1977. Alors que la découverte de cette dernière a été fortuite, l'activité kinase était systématiquement recherchée dans différents types cellulaires du fait de la connaissance d'une kinase présente dans les réticulocytes de lapin, dont l'activité était dépendante d'ARN bicaténaire et qui provoquait une inhibition de la synthèse protéique. Comme la 2-5A synthétase, cette protéine-kinase induite par l'interféron, appelée protéine-kinase dépendante d'ARN bicaténaire (PKR), a la propriété de se lier à son activateur, l'ARN bicaténaire. Cela a facilité son étude grâce à sa purification partielle sur le poly(I)-poly(C)-sépharose [38]. Les travaux sur la PKR ont été accélérés après son clonage, achevé en 1990 à l'Institut Pasteur de Paris [39].

La PKR est présente à des niveaux de base plus ou moins élevés dans de nombreux types cellulaires. Elle est induite par les deux types d'interférons, quoique plus faiblement par l'interféron g que par les interférons a et b. La PKR humaine a un poids moléculaire de 68 kDa (contre 65 kDa pour la PKR murine). Son activation par des ARN bicaténaires ou monocaténaires présentant une structure bicaténaire interne s'effectue par liaison de l'ARN avec deux motifs similaires (57 % d'homologie) d'environ 20 acides aminés. Ces motifs, appelés double-strand RNA binding domains (dsRBD), ont pour séquence consensus GxGxSKKxAKxxAAxxALxxL [40]. Le motif dsRBD est également présent au niveau d'autres protéines liant les ARN bicaténaires comme les PKR murine et de rat, la RNAse III d'Escherichia coli, la protéine E3L du virus de la vaccine, la protéine s3 des réovirus, l'antigène cellulaire La, la protéine TRBP ou la protéine Staufen de la drosophile. C'est d'ailleurs à partir de la protéine Staufen que la structure de ce motif a pu être établie. Par ses motifs dsRBD, la PKR interagirait avec le petit sillon de la double hélice (configuration A) de l'ARN bicaténaire [41]. L'activation de la PKR ne dépend pas de la séquence de l'ARN bicaténaire mais de sa longueur : 11 paires de bases, soit un tour d'hélice, sont nécessaires pour lier la PKR et 30 paires de bases pour l'activer. La région 1-91 de la PKR contenant le premier motif dsRBD présente une bonne affinité pour l'ARN bicaténaire (Kd = 3,8 x 10^{­ 7} M). Mais l'affinité est 100 fois supérieure lorsque les deux motifs sont utilisés (région 1-184 ; Kd = 4 x 10^{­ 9} M) [42]. L'activation de la PKR par les ARN bicaténaires, même s'ils ont la longueur requise, dépend aussi de leur concentration. La PKR présente en effet la particularité d'être activée par de faibles concentrations, mais inhibée par de fortes concentrations d'ARN bicaténaires [43]. Elle diffère ainsi de la 2-5A synthétase, dont l'activation par les ARN bicaténaires ne dépend pas de leur concentration [44]. Il semble que la PKR puisse s'associer en dimère [45], mais il n'est pas démontré que cette dimérisation soit requise pour son activation. L'activation de la PKR, qui suit sa liaison à l'ARN bicaténaire, se produirait par phosphorylation réciproque des monomères. Une fois phosphorylée sur différents sites sérine et thréonine, la PKR subit probablement un changement dans sa conformation qui ouvre l'accès aux sites reconnus par les substrats.

La PKR possède différentes propriétés, antivirales, suppresseur de tumeur, inducteur d'apoptose et médiateur de la stimulation de plusieurs gènes qui peuvent influencer la croissance cellulaire en réponse à différentes formes de stress.

* Phosphorylation de eIF2a par la PKR et action antivirale

La sous-unité a du facteur d'initiation eIF2 de la synthèse protéique est le premier substrat qui a été attribué à la PKR. La démonstration de sa phosphorylation par la PKR a d'abord été faite in vitro, puis confirmée in vivo après expression de PKR recombinante dans des cellules eucaryotes ou des levures [pour revue, voir 46, 47]. La phosphorylation d'eIF2a est une fonction que la PKR partage avec la kinase GCN2 de la levure [48] et la kinase HRI des réticulocytes de lapin (hemin reticulocyte inhibitor). Ces trois kinases sont cependant différentes dans leur structure et dans leur mode d'activation : si la PKR est activée par des ARN bicaténaires, la kinase GCN2 est activée par un manque en acides aminés dans le milieu de croissance de la levure et la kinase HRI par un manque en hème. Elles possèdent un motif commun, LFIQMEFCDKL, qui est considéré comme la signature pour leur reconnaissance d'eIF2a [48]. Le site de liaison exact d'eIF2a aux kinases n'est cependant pas encore connu et, dans le cas de la PKR, pourrait se situer en aval de ce motif [49]. La phosphorylation d'eIF2a inhibe la synthèse protéique. En effet, au cours d'un processus normal de traduction, le facteur eIF2 forme un complexe ternaire avec le GTP et le Met-tRNA_i. Sa fonction est de permettre la liaison du Met-tRNA_i à la sous-unité 40S des ribosomes et l'initiation de la synthèse protéique. Au cours d'un cycle d'initiation, le GTP est hydrolysé en GDP lors de la formation du complexe ribosomal 80S et les facteurs d'initiation sont relargués. La molécule de GDP, encore associée au facteur eIF2, doit alors être échangée pour une molécule de GTP afin que celui-ci puisse de nouveau exercer un cycle d'initiation. Cette réaction d'échange est catalysée par un autre facteur, eIF2B ou facteur d'échange du nucléotide guanine. Lorsque la sous-unité a de eIF2 est phosphorylée, elle forme une association étroite avec eIF2B, le séquestre et empêche le recyclage du GTP. Le facteur eIF2 ne peut plus exercer sa fonction catalytique et les fréquences d'initiation chutent de façon très importante, bloquant ainsi les synthèses protéiques [50].

L'expression de la PKR sauvage (PKR^wt) par transfection dans Saccharomyces cerevisiae, conduit à la phosphorylation du produit du gène sui2 (équivalent d'eIF2a chez la levure) et à une forte inhibition de la synthèse protéique et de la croissance de la levure [48]. De la même façon, le facteur eIF2a est phosphorylé après infection par le virus de l'encéphalomyocardite murine (EMCV) dans des clones stables murins NIH/3T3 exprimant de façon constitutive la PKR^wt, mais non dans ceux exprimant une PKR catalytiquement inactive (PKR^K-R296) qui a été mutée par substitution du résidu lysine 296 en arginine dans son sous-domaine catalytique II, essentiel pour le transfert du phosphate de l'ATP sur le substrat [51]. La PKR serait activée dans la levure par des ARN bicaténaires fungiques parasites. Dans les clones stables, son activation est due aux formes intermédiaires de réplication virale produites au cours de l'infection par EMCV. Comme dans le cas des clones exprimant la 2-5A synthétase, les clones exprimant la PKR^wt exercent un effet antiviral sélectif puisqu'ils permettent une résistance contre le virus EMCV mais non contre le virus VSV. Ils sont cependant beaucoup moins efficaces que les clones 2-5A synthétase, avec seulement un log d'inhibition contre 3 logs pour la 2-5A synthétase [51].

* Action de la PKR sur le contrôle de la prolifération cellulaire : suppresseur de tumeur, inducteur d'apoptose et médiateur de la stimulation de plusieurs gènes

La PKR est localisée dans le cytoplasme et, en plus faible quantité, dans le noyau. Dans le cytoplasme, elle se situe principalement dans la fraction microsomale et présente différents états de phosphorylation (pHi de 7,5 à 9,5). Cela suggère la présence continue d'activateurs de la PKR dans la cellule. Dans le noyau, la PKR est présente à un faible taux dans les nucléoles, avec un point iso-électrique unique de pH 9,5 [52]. Le rôle de la PKR nucléaire n'est pas connu. Cependant, on peut noter l'existence de deux phosphoprotéines nucléaires fortement homologues et immunologiquement apparentées à la PKR, puisque initialement clonées à l'aide d'anticorps anti-PKR. Ces protéines, qui sont également induites par l'interféron, présentent des homologies avec des motifs helix-loop-helix (HLH) les reliant à une famille de protéines engagées dans la reconnaissance d'acides nucléiques, ayant en particulier des affinités pour le petit sillon de l'ADN. Leur rôle dans la fonction et/ou la régulation de la PKR reste à définir [53].

Une fonction suppresseur de tumeur a été rapportée pour la PKR. Des clones exprimant la PKR délétée dans le motif LFIQME ou la PKR catalytiquement inactive (PKR^K-R296) se développent sous forme de tumeurs après injection à des souris athymiques, ce qui n'est pas le cas de clones exprimant la PKR^wt [54, 55]. Le mécanisme sous-jacent n'est pas connu avec précision et pourrait n'être pas simplement lié à une dérégulation du contrôle de la synthèse protéique, via eIF2a. En effet, bien que des clones exprimant le mutant eIF2a^Ser-Ala51 (non phosphorylable et constitutivement actif) puissent conduire à la formation de tumeurs in vivo [56], des clones exprimant le mutant PKR^K-R296 ne sont pas totalement inhibés dans leur capacité à phosphoryler eIF2a [48, 57]. Ceci indique que des mécanismes faisant intervenir la phosphorylation d'autres substrats ou une interaction directe de la PKR avec d'autres protéines seraient impliqués dans l'effet suppresseur de tumeur de la PKR.

Depuis quelques années, plusieurs travaux indiquent que la PKR pourrait être impliquée dans un des mécanismes d'induction de l'apoptose, établissant ainsi un lien avec son action antitumorale. Son rôle dans l'apoptose a été initialement montré en utilisant le vecteur vaccine. Le gène de la PKR y a été placé sous contrôle de l'opérateur/répresseur lacI et l'expression de la PKR a pu être induite après infection des cellules et traitement à l'isopropyl b-D-thiogalactoside (IPTG). L'induction de la PKR^wt a conduit à l'inhibition de la synthèse des protéines virales et cellulaires ainsi qu'à une fragmentation de l'ADN et à une destruction des cellules relevant d'un mécanisme d'apoptose, tandis que celle de la PKR^K-R296 était sans effet [58]. D'autres travaux ont montré que la synthèse de Fas (le récepteur de Fas ligand, ou FasL, protéine de la même famille que le TNF, également impliquée dans l'apoptose) était induite au cours de certaines infections virales, comme celles par le virus d'Epstein-Barr et le virus influenza. Cette induction, qui se produit au niveau transcriptionnel, est bloquée par la 2-aminopurine, un inhibiteur de la PKR [59]. Une relation plus directe a été récemment montrée entre la PKR et la protéine transactivatrice IRF1 qui a des propriétés suppresseur de tumeur et d'induction d'apoptose [7, 8]. Des études réalisées à partir de fibroblastes embryonnaires de souris knock-out pour la PKR [60] indiquent que celle-ci est directement impliquée dans la signalisation d'IRF1 par le poly(I)-poly(C) et par l'interféron g et que les souris knock-out en PKR sont déficientes en apoptose [61].

Les propriétés antivirales, suppresseur de tumeur ou inductrice d'apoptose de la PKR, sont toutes compatibles avec un rôle de contrôle négatif de la PKR sur la prolifération cellulaire. Cependant, la PKR est paradoxalement également impliquée dans la signalisation de gènes nécessaires à la prolifération cellulaire, via l'activation de la voie NF-kB. Cette propriété a été initialement mise en évidence par l'observation que la 2-aminopurine, un inhibiteur de la PKR, pouvait inhiber l'induction par les ARN bicaténaires des gènes précoces c-myc et c-fos, ainsi que l'induction du gène de l'interféron b et de certains gènes induits par ce dernier [pour revue, voir 46]. Des expériences concordantes ont par la suite confirmé le rôle de la PKR dans l'activation de la voie NF-kB : en effet, la suppression sélective des ARN messagers de la PKR entraîne l'inhibition de l'activation de NF-kB en réponse à l'ARN bicaténaire [pour revue, voir 46] ; la transfection du mutant PKR^K-R296 inhibe l'activation d'un gène reporter sous la dépendance d'éléments de réponse à NF-kB ; enfin, les fibroblastes embryonnaires murins provenant de souris knock-out pour la PKR sont déficientes dans l'activation de la voie NF-kB par les ARN bicaténaires [60, 61]. On ne sait pas comment la PKR active la voie NF-kB. Elle est capable de phosphoryler IkBa, l'inhibiteur cellulaire de NF-kB, mais cette phosphorylation n'a pour l'instant été démontrée qu'in vitro [pour revue, voir 46].

La capacité de la PKR à stimuler l'expression génique via la voie NF-kB pourrait être un élément supplémentaire de l'action antivirale de l'interféron, puisqu'elle entraîne l'induction de l'interféron lui-même (figure 3). Cependant, la PKR pourrait également stimuler par cette voie l'expression de long terminal repeats (LTR) de rétrovirus, tels que le VIH1 et le HTLV1 [62] et conduire ainsi à la réactivation de gènes viraux latents. Ce rôle complexe est encore difficile à comprendre et suggère que l'activité de la PKR doit être très contrôlée dans la cellule, même en l'absence d'infection virale.

* Régulateurs viraux et cellulaires de la PKR

De nombreux virus ont, au cours de l'évolution, élaboré des stratégies permettant d'échapper à l'action de la PKR (figure 4). Ils peuvent synthétiser abondamment soit des ARN bicaténaires qui séquestrent la PKR (exemples : les ARN-EBER du virus d'Epstein-Barr ; l'ARN-VA1 des adénovirus), soit des protéines virales qui entrent en compétition avec la PKR pour la fixation à l'ARN bicaténaire (ex. : protéines E3 du virus de la vaccine, s3 des réovirus) ou pour sa liaison avec le substrat eIF2a (ex. : protéine K3L du virus de la vaccine). Certains virus peuvent induire la dégradation de la PKR (poliovirus) ou sa séquestration par compartimentation (virus de l'encéphalomyocardite) [pour revue, voir 47]. Ils peuvent également bloquer l'autophosphorylation de la PKR, soit directement (ex. : protéines tat72 du VIH1, NS5A du virus de l'hépatite C), soit indirectement en activant des inhibiteurs cellulaires. Parmi ces inhibiteurs cellulaires, on peut mentionner la protéine p58^IPK (inhibitor of protein kinase, 58 kDa) qui est activée au cours de l'infection par le virus influenza. La p58^IPK appartient à une famille de protéines de stress. Elle possède des motifs répétés en hélice a de type tétratricopeptide (TPR) qui permettent des liaisons protéine-protéine. Par ces motifs TPR, elle se lie à la région 244-296 de la PKR, recouvrant les deux premiers domaines catalytiques de celle-ci, et l'inactive. Par d'autres motifs de type DNAJ, elle serait elle-même régulée de façon négative par liaison avec un inhibiteur de la famille des protéines du heat shock [63]. L'infection par influenza déstabiliserait la liaison de la p58^IPK et de son inhibiteur au profit de la liaison PKR/p58^IPK. Le rôle de la p58^IPK dans la cellule en l'absence d'infection par un virus influenza n'est pas connu. Un autre régulateur cellulaire de la PKR, l'antigène La (large antigen), présente une activité déroulase sur des matrices ADN-ARN et ARN-ARN [64] qui peut être augmentée au cours d'une infection virale ou d'une croissance tumorale. La TAR RNA binding protein (TRBP), qui a été isolée grâce à sa
capacité à lier la région TAR du VIH1, se conduit également comme un inhibiteur de la PKR. La fonction de TRBP dans la cellule en l'absence d'infection par le VIH n'est pas connue. La TRBP s'apparente à la PKR par la présence d'un motif dsRBD [65] : elle est donc capable de bloquer l'activation de la PKR par compétition avec les ARN bicaténaires. Il semble cependant que l'inhibition de la PKR par la TRBP s'effectue par interaction directe protéine/protéine sur une région différente de celles contenant leurs motifs dsRBD [66].

D'autres inhibiteurs cellulaires de la PKR peuvent également être mentionnés. Ainsi, une protéine de 15 kDa, appelée dRF, bloque la liaison de la PKR à l'ARN bicaténaire dans des cellules non différenciées. Une protéine d'environ 100 kDa, induite au cours de la transformation par ras, bloque l'activation de la PKR par un mécanisme encore inconnu [pour revue, voir 46].

Interféron et infections virales :
mécanisme d'action et emploi thérapeutique

L'interféron est efficace en clinique dans le traitement d'infections virales, telles que les hépatites virales chroniques (B et C), les papillomes laryngés et génitaux, certains virus herpès, et de certaines néoplasies telles que le sarcome de Kaposi, la leucémie à tricholeucocytes ou la leucémie myéloïde chronique. La connaissance des mécanismes d'action des gènes qu'il induit permet d'élaborer des stratégies antivirales plus précices, notamment dans le cas du VIH [67].

Interféron et VIH

Le traitement de l'infection par le VIH actuellement le plus efficace consiste en l'administration d'une trithérapie associant deux analogues nucléosidiques inhibant la transcriptase inverse et un inhibiteur de protéase [68]. Bien que ces traitements entraînent une diminution profonde de la virémie, l'émergence de souches résistantes est possible après plusieurs mois de traitement. Une action sur les mécanismes de défense cellulaire induits par l'interféron pourrait être utilisée en association à la thérapeutique spécifique. En plus de son activité antivirale, l'interféron stimule les réponses immunes, par exemple en induisant les gènes du CMH, ce qui favorise une présentation des peptides viraux à la surface cellulaire et leur reconnaissance par les lymphocytes T. Un autre intérêt de l'emploi de l'interféron en thérapeutique du VIH est son rôle antitumoral sur les sarcomes de Kaposi associés au sida.

L'infection par le VIH entraîne l'induction de l'interféron a et de l'interféron g, le premier étant majoritaire. Cette induction se produirait après interaction de la boucle V3 du virus avec un site secondaire à la surface cellulaire [69]. La réplication du VIH a lieu principalement dans les cellules réservoirs monocytes/macrophages et dans les lymphocytes T CD4⁺. Les macrophages servent également de réservoirs pour le virus et ont la capacité de propager l'infection à d'autres types cellulaires. L'action de l'interféron sur la réplication du VIH a été étudiée dans différents cas : au cours d'une infection aiguë, au cours d'une infection chronique ou au cours d'une infection latente, avec ou sans stimulation des cellules permettant la réactivation du provirus. Les cellules ont été traitées par les interférons, soit avant l'infection, soit au cours de l'infection. Les trois types d'interféron (a, b et g) se sont avérés capables d'inhiber la réplication d'une souche de VIH1 ayant un tropisme spécifique pour les macrophages (souche M-tropic) dans des macrophages primaires humains lorsque les cellules étaient prétraitées par l'interféron avant l'infection. En revanche, lorsque le traitement par l'interféron était réalisé après l'établissement de l'infection, celui-ci n'avait plus d'effet. Ces résultats indiquent que l'action antivirale de l'interféron s'exerce sur une étape précoce de l'infection, avant l'intégration de l'ADN [70]. Dans les lymphocytes T ou dans des lymphocytes périphériques, l'interféron entraîne une réduction des niveaux d'ADN proviral intégré dans le cas d'infections à cycle unique et cette inhibition semble se faire au niveau de la transcription inverse [71]. Là encore, lorsque l'infection est préalablement établie, l'interféron n'a pas d'effet. Une étude de traitement par l'interféron de type I, effectuée en parallèle au niveau d'une lignée promonocytaire U937 infectée chroniquement et d'une lignée CEM lymphocytaire, montre que celui-ci inhibe spécifiquement la synthèse protéique, semble-t-il par rétention spécifique des ARN viraux dans les polysomes de petite taille. Cela indique que, puisque les ARN ne peuvent pas être engagés dans les polysomes de grande taille, leur traduction est bloquée [72]. Une autre étude de traitement par l'interféron de cellules MT4 a conclu, quant à elle, à des altérations post-traductionnelles [73].

L'interféron aurait donc des effets différents selon que les cellules sont chroniquement infectées ou infectées de façon aiguë par le VIH1. Au cours d'une infection chronique, il bloquerait l'association des ARN aux polyribosomes, les modifications post-traductionnelles des protéines et leur assemblage en particules virales. Au cours d'une infection aiguë, il exercerait un rôle sur l'intégration et l'activité transcriptase inverse. Dans le cas d'une infection aiguë, on peut supposer que ses mécanismes d'action antivirale classiques se mettent en place, via l'une des ses 30 protéines induites. Dans le cas d'une infection chronique, on peut supposer que le VIH a eu le temps de mettre en place ses propres mécanismes.

L'interféron est un agent antiviral pouvant limiter la propagation du VIH1 en cas d'infection par des particules virales libres. Cependant, son utilisation en monothérapie chez des patients asymptomatiques (taux des lymphocytes CD4⁺ supérieur ou égal à 400/mm³) n'est pas recommandée car elle n'a qu'une efficacité transitoire et oblige à l'emploi de fortes doses (18 millions d'unités MU par jour), toxiques et mal tolérées par les patients (symptômes grippaux, diarrhée, altération du goût, alopécie, difficultés de concentration, granulocytopénie, protéinurie, anémie). Une alternative serait l'emploi d'interféron à faible dose (1 million d'unités par jour) couplé à un inhibiteur de la transcriptase inverse tel que la zidovudine. Depuis quelques années, une approche de thérapie génique est développée par le groupe d'Edward de Maeyer, fondée sur la production faible mais continue d'interféron b dans des cellules après transformation par un vecteur rétroviral exprimant l'interféron b humain de façon constitutive sous la dépendance du promoteur murin H-2Kb. La transformation par ce vecteur de cellules CEM, U937 et de monocytes du sang périphérique de donneurs sains ou infectés par le VIH1 leur permet de mieux résister à une infection par le VIH1. ll semble que l'interféron b produit par ces cellules ne se propage pas dans le surnageant et ne soit capable de protéger que les cellules qui le produisent, selon un mécanisme autocrine [74]. L'interféron b interagirait avec son récepteur en restant proche de la surface cellulaire, mais à l'intérieur de la cellule. Ce mécanisme autocrine a également été décrit pour d'autres cytokines, telles que PDGF, IL3 et GM-CSF. Le blocage de l'infection virale par ce mécanisme se produirait à un stade très précoce de l'infection par le VIH1, probablement au moment de l'adsorption ou de la pénétration. Une autre possibilité de thérapie génique par l'interféron consiste en une construction artificielle amenant le gène de l'interféron sous la dépendance de la région TAR du VIH1, ce qui provoque son induction par la protéine transactivatrice tat au cours de l'infection par le VIH1 [75].

L'utilisation de l'action antivirale de l'interféron dans l'infection par le VIH1 peut aussi être fondée sur l'action de l'un de ses gènes induits (Mx, 2-5A synthétase, PKR).

* Mx et VIH

La protéine Mx humaine, connue depuis plusieurs années pour être un marqueur sensible du traitement des cellules à l'interféron, peut être détectable dans les cellules du sang périphérique plus de deux semaines après traitement à l'interféron. Elle est pratiquement toujours détectée dans les cellules du sang périphérique de patients infectés par le VIH1, ce qui a initialement conduit à émettre l'hypothèse que sa présence représenterait un marqueur de l'induction de l'interféron par le VIH. Cependant, une étude sur 26 patients infectés par le VIH1 a montré que, si la majorité d'entre eux (25 patients) étaient positifs pour Mx, seuls 11 présentaient des taux d'interféron mesurables [76]. Cela a été expliqué par le fait que le VIH1 induisait directement la synthèse du gène MxA [77]. Parmi les gènes inductibles par l'interféron, le VIH1 induit également la 2-5A synthétase [78], mais non les gènes GBP, ISRE 6-16 et ISRE 9-27 [77]. L'induction directe de MxA au cours de l'infection par le VIH1 fait que les monocytes infectés par le VIH résistent à l'infection par le VSV. On pense que cette capacité qu'a le VIH d'induire lui-même dans la cellule un état antiviral lui permettrait de se protéger contre des surinfections liées à d'autres virus, ce qui pourrait expliquer en partie sa survie dans les macrophages. Il ne semble donc pas souhaitable d'utiliser directement l'induction du gène Mx dans la lutte contre le VIH1.

* Système 2-5A et VIH

Le système 2-5A peut être activé au cours de l'infection par le VIH [78] et pourrait jouer un rôle dans le contrôle des synthèses virales. Plusieurs stratégies sont à l'étude. Le groupe de Schröder envisage une « immunisation intracellulaire » avec un ADN complémentaire de 2-5A synthétase couplé à la région TAR du VIH. L'objectif de cette approche est d'augmenter la synthèse de la 2-5A synthétase par l'action transactivatrice de tat se fixant sur la région TAR, puis de prendre avantage de l'activation de l'enzyme par cette même région TAR pour augmenter la concentration de 2-5A dans la cellule. L'infection par le VIH1 dans des cellules Hela-T4 transfectées de façon stable par un vecteur exprimant la 2-5A synthétase sous dépendance du LTR du VIH1 a montré une augmentation de l'accumulation de 2-5A intracellulaire par rapport à l'infection de cellules Hela-T4 seules. En parallèle, la production de VIH1 est fortement inhibée dans les cellules Hela T4-2-5A synthétase par rapport aux cellules Hela-T4 seules [79]. Si la 2-5A synthétase se lie à la région TAR, elle peut en être déplacée par la protéine tat qui a une meilleure affinité (Kd = 3,2 x 10⁹ M^{­ 1}). Cette forte affinité de tat pour TAR pose d'ailleurs un problème pour la recherche d'inhibiteurs directs de tat utilisables en pharmacologie. Afin d'être le plus efficace possible, l'utilisation de l'activité 2-5A synthétase dans l'action antiVIH devrait donc être couplée à l'action conjuguée de plusieurs agents inhibiteurs de tat. La stratégie décrite ci-dessus a permis de démontrer que l'activité de la 2-5A synthétase était efficace contre l'infection par le VIH1. Pour ne pas devoir introduire la 2-5A synthétase directement dans les cellules, deux stratégies sont à l'étude, visant toutes deux à augmenter la concentration intracellulaire du 2-5A par traitement direct des cellules avec des analogues du 2-5A ou des ARN bicaténaires misappariés, comme le Poly(I)Poly(C₁₂U) (Ampligen). Les deux types d'agents se sont révélés capables d'inhiber fortement la réplication du VIH1. Cependant, l'étude de leur action ainsi que celle du 2-5A authentique a montré qu'elle ne correspondait pas forcément à une activation de la RNAseL qui dégraderait ensuite les ARN viraux. En effet, le 2-5A, ainsi que ses analogues de type cordycepine (3'-déoxyadénosine), sont capables d'inhiber l'activité transcriptase inverse du VIH1. Cette inhibition se produirait par compétition entre la transcriptase inverse et le 2-5A ou les analogues cordycépine pour la liaison sur l'anticodon du primer tRNAlys [19]. Le 2-5A possède également la capacité d'inhiber l'activité de l'ADN topo-isomérase lorsqu'il s'accumule sous forme de longs oligomères (hexamères de 2-5A 5'-triphosphate). Il peut inhiber l'activité topo-isomérase du VIH1 et pourrait ainsi interférer avec l'intégration du provirus. L'ARN bicaténaire Ampligen est capable de réduire significativement la charge virale de patients infectés par le VIH tout en restaurant leurs fonctions immunitaires. Son mécanisme d'action antivirale n'est pas encore parfaitement compris, bien qu'on sache qu'il active la 2-5A synthétase et la PKR. Entre autres actions, il pourrait favoriser l'accumulation de longues chaînes de 2-5A dans la cellule et donc son activité antitopo-isomérase sur le VIH1 [78].

* PKR et VIH

La PKR peut être activée au cours de l'infection par le VIH par sa liaison à la région ARN bicaténaire TAR du LTR, au niveau de la région tige. La protéine transactivatrice tat (qui se positionne au niveau de l'excroissance) et la protéine cellulaire TRBP (qui se lie à différents endroits de la tige) se lient également à la région TAR. Une interaction entre tat et PKR a été mise en évidence, ainsi que la capacité de la PKR à phosphoryler la forme complète de tat exprimée à partir de ses deux exons et appelée tat86. La forme « un exon » de tat (tat72), au contraire, ne peut être phosphorylée et se conduit comme un inhibiteur de l'autophosphorylation de la PKR. Le rôle de la phosphorylation de tat86 par la PKR dans l'infection n'est pas connu [80]. Une interaction entre PKR et TRBP en dehors de leur région liant l'ARN bicaténaire a également été mise en évidence [66]. TRBP et tat72 peuvent donc servir d'inhibiteurs de la PKR au cours de l'infection virale, empêchant ainsi son action antivirale. Une application thérapeutique de la PKR inhibiteur du VIH serait d'utiliser sa reconnaissance de tat, de TRBP, ainsi que de ses substrats. On peut envisager la synthèse de peptides correspondant aux points de liaison PKR/tat et PKR/TRBP afin de favoriser l'accès au substrat eIF2a et donc l'inhibition de la synthèse protéique par la PKR.

Interféron et virus de l'hépatite B

L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) entraîne une réponse cytotoxique de l'hôte restreinte par le système HLA de classe I, dirigée contre de nombreux épitopes viraux dont, en particulier, les épitopes de l'antigène de capside exprimés à la surface de la membrane hépatocytaire [81]. Si la réponse n'est pas assez forte pour permettre l'élimination des cellules infectées, l'infection devient persistante et peut conduire à une hépatite chronique, une cirrhose ou un carcinome hépatocellulaire. La régulation de certains promoteurs de gènes viraux est effectuée spécifiquement par des facteurs de transactivation hépatiques, ce qui explique l'hépatotropisme du VHB [82]. L'infection par le VHB induit également l'action de nombreuses cytokines de l'inflammation qui pourraient jouer un rôle dans l'inhibition de la propagation virale. Effectivement, un modèle transgénique murin d'expression de l'antigène de surface a démontré une action inhibitrice de l'interféron g, de l'interleukine 2 et du TNF [83]. Le TNFa, l'interféron g et l'interféron a, ont également montré leur pouvoir inhibiteur dans une autre expérience, réalisée in vitro (transfection d'un gène reporter placé sous la dépendance du promoteur du core/prégénome (C/P) du VHB) [84].

Bien qu'il existe maintenant un vaccin contre l'hépatite B, l'infection chronique de plus de 300 millions de personnes dans le monde impose encore l'utilisation de traitements antiviraux. C'est finalement l'interféron a qui, au cours des dernières années, s'est montré le plus efficace dans le traitement de l'hépatite chronique B (2,5 à 18 MU trois fois/semaine). D'un point de vue clinique, on peut observer dans un premier temps, sous traitement par l'interféron, une recrudescence des signes d'hépatite secondaire au démasquage des cellules infectées grâce à l'induction des antigènes HLA de classe I par l'interféron, puis l'élimination de l'ADN viral et de sa polymérase du sérum des patients, associée à une diminution du taux des transaminases sériques et du degré d'inflammation histologique hépatique. Une réponse (disparition de l'antigène Hbe et arrêt de la réplication virale) est observée chez un peu plus d'un tiers des patients traités de 6 mois à un an [85]. Afin de mieux comprendre les mécanismes par lesquels l'interféron agit sur la réplication du virus, un système expérimental a été établi avec un autre membre de la famille des Hepadnaviridæ, le virus de l'hépatite B du canard ou DHBV. L'action de l'interféron sur l'infection par le DHBV a été étudiée dans la lignée d'hépatome humain Huh7, l'interféron humain n'agissant pas sur les cellules de canard. Le traitement par l'interféron g entraînait un blocage de la réplication au niveau post-transcriptionnel. Depuis le clonage récent de l'interféron a du canard, un système d'étude homologue va pouvoir être utilisé et permettre une expérimentation animale [86].

Interféron et virus de l'hépatite C

Le virus de l'hépatite C (VHC) est le principal agent causal des hépatites non-A, non-B post-transfusionnelles. Il se transmet principalement par le sang (seringues contaminées au cours d'injection de drogues par voie veineuse, transfusion sanguine). Avant sa découverte en 1989 et le développement de tests de détection fiables, sa transmission par la transfusion sanguine a conduit à l'infection d'un grand nombre de personnes (150 000 personnes infectées aux États-Unis en 1994). Son génome est un ARN positif d'environ 10 000 bases, traduit en une polyprotéine précurseur (environ 3 000 acides aminés) qui est ensuite clivée en protéines structurales (capside et deux glycoprotéines membranaires) et non structurales. Les différents génotypes du VHC constituent actuellement le genre hépacivirus de la famille des Flaviviridæ. Le VHC est un virus hautement variable, ce qui rend difficile le développement de vaccins et de traitements antiviraux efficaces [87]. L'infection par le VHC devient chronique dans 50 à 75 % des cas, et peut conduire au développement de cirrhoses et de carcinomes hépatocellulaires [88]. Le mécanisme de la persistance virale n'est pas encore compris. C'est l'interféron a (a2a, a2b) qui est, aujourd'hui, le seul médicament efficace dans le traitement des infections par le VHC (3 millions d'unités trois fois par semaine pendant 12 mois). Dans l'ensemble, on observe une amélioration chez 30 à 50 % des patients, mais une rechute survient fréquemment après l'arrêt du traitement. Les rémissions à long terme ne représentent en fait que 15 à 30 % des cas traités. En outre, le traitement n'est indiqué que si les patients ne présentent pas de signes de cirrhose ou de désordres auto-immuns. Le mécanisme d'action de l'interféron dans l'infection par le VHC ne peut être analysé de façon systématique en l'absence, pour l'instant, de système de culture cellulaire pouvant être infectée par ce virus. Les études sont donc réalisées à partir de patients infectés et traités par l'interféron. Une mesure de l'activité 2-5A synthétase dans des cellules mononucléées du sang périphérique de patients infectés par le VHC et traités par l'interféron a montré qu'au cours du traitement, il pouvait survenir une désensibilisation des cellules à l'interféron [89]. Cela impose soit de trouver d'autres agents efficaces sur la réplication du VHC pour s'associer à l'action antivirale de l'interféron, soit de comprendre le mécanisme précis de défense antivirale mis en place par l'interféron au cours de cette infection. Il a été récemment avancé que la sensibilité du génotype 1b du virus de l'hépatite C à l'interféron serait liée à la région comprise entre les acides aminés 2209 et 2248 de la protéine non structurale NS5A. Ce motif de 40 acides aminés a été baptisé interferon sensitivity-determining region (ISDR). Lorsque la séquence ISDR est identique à celle de la souche prototype VHC-J, les patients seraient résistants à l'action de l'interféron. Lorsque cette région est mutée en différents acides aminés, les patients répondraient au traitement par l'interféron [90]. À la suite de cette observation, une autre étude a montré l'existence d'une interaction directe protéine-protéine entre une protéine NS5A de type « sauvage » (c'est-à-dire de prototype VHC-J) et la PKR. Cette interaction inhibe la phosphorylation de la PKR, ce qui expliquerait pourquoi les patients infectés par un VHC exprimant une protéine NS5A de type « sauvage » résisteraient à l'action de l'interféron. Lorsque la protéine NS5A comporte plusieurs mutations, elle ne pourrait plus bloquer l'action de la PKR et l'action antivirale de l'interféron pourrait s'exercer [91]. Cette information est importante car elle permettrait de déterminer, par séquençage de la région ISDR de la NS5A avant traitement, si un patient va être répondeur ou non. Cependant, une étude récente réalisée chez des patients infectés par le même génotype viral n'a pas permis d'observer de corrélation entre la séquence de l'ISDR et le type de réponse du patient à l'interféron : on observait en effet une distribution similaire des séquences de type « sauvage », de type intermédiaire et de type muté chez les répondeurs et chez les non-répondeurs [92]. L'importance de l'interaction NS5A/PKR dans la réponse à l'interféron des patients infectés par le VHC reste donc encore hypothétique.

Interféron et virus d'Epstein-Barr

Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est un virus complexe (génome ADN de 172 Kb) lymphotrope et transformant. Il est l'agent causal de la mononucléose infectieuse et se trouve fortement associé à différentes affections malignes telles que le lymphome de Burkitt, le carcinome nasopharyngé et des lymphomes B chez des patients immunodéprimés. Parmi les cellules infectées par l'EBV, une
fraction s'immortalise sous forme de lignées lymphoblastoïdes au sein desquelles le génome viral persiste sous forme latente comme un ADN épisomal circulaire [93]. Il n'exprime plus alors qu'une partie très restreinte de son génome, soit six antigènes nucléaires (EBNA 1-6), trois protéines membranaires (LMP-1, -2A, -2B) et deux ARN de petit poids moléculaire, abondants et non traduits : EBER1 (166 nucléotides) et EBER2 (172 nucléotides), transcrits par l'ARN polymérase III. Les EBER peuvent résider en partie dans le noyau, en fonction de l'état de croissance de la cellule, mais leur localisation est principalement cytoplasmique, au niveau du réticulum endoplasmique [94]. Les EBER ne sont pas nécessaires à la réplication du virus, puisqu'un EBV recombinant dans lequel les gènes EBER ont été délétés est encore capable de se répliquer. On pense qu'un des rôles des EBER serait en fait de contrecarrer l'action de la PKR (donc un des mécanismes de défense antivirale de l'interféron), permettant ainsi le maintien du virus dans la cellule. En effet, les EBER ont une structure secondaire bicaténaire de type boucle-tige. Une analyse Scatchard a montré que les ARN EBER1 et 2 se lient à la PKR avec la même affinité (Kd = 0,3 nM), comme l'ARN bicaténaire VA1 de l'adénovirus. Cette affinité est plus élevée que celle de la PKR pour la région TAR du VIH1. Comme VA1, les EBER inhibent l'activation de la PKR en se fixant sur les motifs dsRBD de l'enzyme dans sa partie NH₂-terminale. L'analogie de fonction entre VA1 et EBER est renforcée par le fait que les EBER peuvent se substituer à VA1 en permettant la croissance de mutants d'adénovirus ne contenant pas les gènes VA [95]. La synthèse de petits ARN viraux hautement structurés ferait partie des stratégies virales pour se maintenir chez l'hôte.

Interféron et virus herpès humain 8 (sarcome de Kaposi)

Les sarcomes de Kaposi sont des tumeurs d'origine vasculaire qui se caractérisent par la croissance d'un mélange de cellules endothéliales et fibroblastiques (cellules spindle), par une angiogenèse et par l'infiltration de cellules inflammatoires. Bien que décrit en 1872 par Kaposi, ce type inhabituel de sarcome n'a commencé à susciter l'intérêt qu'à partir de 1981, lorsque sa progression de type épidémique a coïncidé avec celle du sida. L'infection par le VIH joue un rôle important dans le développement du sarcome de Kaposi, mais elle ne suffit pas à l'initier. En effet, cette tumeur peut apparaître chez des sujets VIH-négatifs et, lorsqu'elle survient chez des sujets VIH-positifs, elle est considérablement plus fréquente chez les personnes ayant eu des contacts sexuels que chez les hémophiles contaminés par transfusion sanguine ou les enfants. Cela suggère qu'un deuxième facteur, sexuellement transmissible, en est responsable. Récemment, il est apparu de façon assez convaincante, grâce à des études séro-épidémiologiques, que l'agent responsable serait un nouveau virus de la famille des Herpesviridæ appelé virus herpès humain 8 (HHV8) [96]. Le génome d'HHV8 a été entièrement séquencé, mais on connaît encore mal sa biologie. Il est intéressant de constater, toutefois, qu'il pourrait être phylogéniquement apparenté au virus d'Epstein-Barr. Comme ce dernier, il peut infecter des lymphocytes B et s'y maintenir, à l'état latent, sous forme épisomale [97]. Cette similitude permet d'aborder l'étude d'HHV8 et de ses interactions avec les gènes induits par l'interféron en s'aidant des connaissances provenant de l'étude d'EBV.

L'infection par le VIH joue un rôle important dans le développement des sarcomes de Kaposi. En effet, les cellules de Kaposi répondent à l'action de la protéine transactivatrice tat extracellulaire qui s'y fixe sur des récepteurs de type intégrine. Récemment, il a été montré que tat présentait des propriétés angiogéniques en stimulant la migration des cellules endothéliales. Cette action serait augmentée par des cytokines de l'inflammation (IL1, TNF et IFNg) qui stimulent l'expression des récepteurs de tat [98].

Il existe différents traitements des sarcomes de Kaposi, parmi lesquels les plus efficaces sont les traitements chimiothérapiques (vinblastine, étoposide) ou les traitements par l'interféron a, seul ou en association à un antirétroviral (s'il s'agit d'un sarcome de Kaposi associé au sida) [99]. L'interféron a montré dès 1983 qu'il pouvait entraîner la régression des sarcomes de Kaposi. Actuellement, le meilleur traitement (et le mieux toléré) consiste en des injections d'interféron a trois fois par semaine par voie sous-cutanée ou intramusculaire pendant trois mois, soit seul (20 millions d'unités/m²), soit en association avec la zidovudine, ce qui permet l'utilisation de doses plus faibles, mieux tolérées. Ce traitement entraîne la régression complète des sarcomes de Kaposi dans 30 à 50 % des cas (interféron seul) ou dans 50 % des cas (bithérapie). La récidive des tumeurs est fortement retardée (8 à 24 mois) [99].

Le système interféron est l'un des premiers mécanismes de défense de l'organisme. Il lui permet de se protéger contre une infection virale. Au fur et à mesure que l'on analyse la structure et la fonction des protéines cellulaires impliquées dans cette défense antivirale, on ne peut que s'émerveiller devant leur diversité et la précision de leurs actions. On constate cependant que de nombreux virus ont développé des stratégies astucieuses afin de contrecarrer le système de défense antiviral des cellules et de détourner à leur profit les fonctions cellulaires. Bien que l'on sache que cette relation cellule-virus se construit, sans cesse, au cours du jeu aveugle de l'évolution, le fait d'utiliser des expressions telles que « stratégies astucieuses » ou « détourner à leur profit » montre que l'on ne peut s'empêcher de comparer la relation virus-cellule à une joute entre deux fins stratèges. Un exemple frappant est celui de la protéine-kinase dépendante d'ARN bicaténaire, la PKR, dont l'un des rôles principaux est de contrôler l'initiation de la synthèse protéique. Or, la machinerie de la synthèse protéique est un point de passage obligé pour tout virus, qui a besoin de synthétiser ses propres protéines, structurales et non structurales. Afin de contrecarrer l'action de la PKR et de continuer à voir leurs protéines traduites, de nombreux virus inhibent cette kinase stratégique, par exemple en l'attirant par des formes imparfaites d'ARN bicaténaire qui la séquestrent au lieu de l'activer, ou par des analogues de son substrat naturel qui empêchent l'accès de celui-ci au site catalytique de l'enzyme.

Une utilisation efficace de l'interféron en clinique est possible depuis plusieurs années. Elle a été améliorée, d'abord par la comparaison systématique de nombreuses molécules d'interféron dans des essais cliniques, ce qui a permis de choisir les molécules les plus actives, puis par l'emploi d'interférons recombinants correspondant à ces molécules. L'étude systématique des protéines induites par les interférons, ainsi que la connaissance de leur mode d'action antivirale, permettent d'améliorer encore les protocoles de traitement par l'interféron. Par exemple, on peut maintenant évaluer rapidement, sur un prélèvement de cellules sanguines, si un patient va répondre à l'interféron ou non (test d'induction de la 2-5A synthétase ou de Mx) avant de se lancer dans un long protocole de traitement.

On se tourne également depuis plusieurs années vers une seconde génération de défenses par l'interféron. En effet, au lieu de traiter les patients uniquement par l'interféron, on peut activer directement telle ou telle protéine à fort pouvoir antiviral. Le traitement de patients par l'ARN bicaténaire Ampligen, qui stimule l'action du système 2-5A et de la PKR, en est un bon exemple. On peut ainsi renforcer l'action de ces systèmes de défense naturels en soutien du traitement général par l'interféron et/ou en association à des traitements antiviraux spécifiques.

En développant leurs stratégies antidéfenses cellulaires, les virus nous ont, en quelque sorte, dévoilé leur jeu : en « fondant » sur leurs cibles cellulaires pour les inhiber, ils ne font pas que nous les révéler, mais ils nous permettent également de déterminer, au niveau moléculaire, la nature des motifs qu'ils ont choisis de bloquer. On sait alors que l'on doit renforcer l'action de ces protéines-clefs si l'on veut soutenir la défense cellulaire. La recherche nous met donc sur la voie d'aider nos propres cellules, qui, par elles-mêmes, ne peuvent que suivre le rythme lent de l'évolution, à trouver les ripostes nécessaires. Dans le futur, on pourrait envisager la synthèse de peptides correspondant à l'interaction protéine virale/protéine cellulaire ­ soit la création d'un leurre antileurre ­ et de les injecter aux patients pour détourner les virus de leurs cibles.